高偉勤，王 佳，童升洪，趙秀芳

（嶺南生態(tài)文旅股份有限公司，廣東 東莞 523125）

20 世紀(jì)50 年代—90 年代，中國紅樹林面積銳減68.70%，存在的林分80.00%以上為退化次生林，立地環(huán)境惡劣[1]。由于沿海海岸帶成為許多沿海經(jīng)濟(jì)區(qū)優(yōu)先和重點(diǎn)開發(fā)的區(qū)域，使得沿海濕地被過度開發(fā)，加之人造林的存活率并不高，所以如何持續(xù)保護(hù)瀕危紅樹林樹種和保護(hù)紅樹林生態(tài)系統(tǒng)依然是一個(gè)亟待解決的問題。小草海桐（Scaevola hainanensisHance），又名海南草海桐，桔梗目草海桐科草海桐屬蔓性小灌木；葉螺旋狀著生，肉質(zhì)，條狀匙形，長1～2.5 cm，寬2～5 mm，分布在我國廣東、福建、臺(tái)灣以及越南國的沿海地區(qū)，常生于海邊鹽田或與紅樹同生。作為一種半紅樹植物，于2005 年正式被列為珍稀易危植物，其遺傳多樣性水平極低，作為一種珍稀植物在分子水平上同樣面臨著滅絕的風(fēng)險(xiǎn)[2]，但國內(nèi)卻少有研究報(bào)道其保育方法。組織培養(yǎng)技術(shù)作為一種有效的植物繁殖技術(shù)，可以在無需種子的情況下，通過細(xì)胞分裂和組織再生的方式，快速繁殖大量的植物[3]，能夠有效提高紅樹林植物的繁殖效率，保存其種質(zhì)資源，并為沿海環(huán)境綠化提供苗木保障。本研究以半紅樹植物小草海桐為研究對(duì)象，探究不同生長激素配比對(duì)小草海桐葉片組織培養(yǎng)過程中的影響，旨在為小草海桐種植資源的保護(hù)和快速繁殖技術(shù)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

小草海桐枝條于2022 年3 月采自海南省臨高縣新盈鎮(zhèn)合貴村，取小草海桐枝條上的嫩葉用超純水洗凈，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在超凈工作臺(tái)用75%乙醇浸沒消毒后，再用10%NaClO 溶液滅菌5 min，無菌水清洗4 次后備用。添加不同質(zhì)量濃度的NAA（0、0.5、1.0 mg/L）和6-BA（0、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/L）進(jìn)行小草海桐葉片外植體愈傷組織的誘導(dǎo)，在愈傷組織形成40 d 后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移至添加不同質(zhì)量濃度的6-BA（0.5、1.0、1.5 mg/L）和NAA（0、0.05、0.1、0.5 mg/L）的培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)，45 d 后將健康的帶芽外植體轉(zhuǎn)移至添加了不同質(zhì)量濃度的6-BA（0、0.5、1.0、1.5 mg/L）的培養(yǎng)基內(nèi)開始繼代培養(yǎng)，進(jìn)行不定芽的增殖，45 d 后，將長出5～7片真葉的再生芽分別接種到MS 培養(yǎng)基，添加不同質(zhì)量濃度的IAA（0.5、1.0、1.5 mg/L）的MS 培養(yǎng)基，添加不同質(zhì)量濃度的IBA（0.5、1.0、1.5 mg/L）的MS培養(yǎng)基進(jìn)行生根誘導(dǎo)，35 d后統(tǒng)計(jì)生根率和生根系數(shù)。

本試驗(yàn)所用基礎(chǔ)培養(yǎng)基均為MS 培養(yǎng)基4.7 g/L，蔗糖30 g/L，瓊脂7 g/L，pH 值為5.80±0.05，涉及的計(jì)算如式（1）-式（10）所示：

2 結(jié)果與分析

2.1 不同激素處理對(duì)小草海桐葉片誘導(dǎo)愈傷組織的影響

不同激素處理對(duì)小草海桐愈傷組織誘導(dǎo)的影響如表1 所示。激素對(duì)誘導(dǎo)小草海桐葉片外植體產(chǎn)生愈傷是必要的，統(tǒng)計(jì)不同激素處理對(duì)小草海桐葉片愈傷組織的誘導(dǎo)情況發(fā)現(xiàn)，與CK（不添加激素）相比，植物生長調(diào)節(jié)劑顯著促進(jìn)了葉片外植體愈傷組織的生長，不添加NAA 的處理都出現(xiàn)外植體死亡，且無愈傷組織產(chǎn)生，外植體保持原狀或死亡，其中無激素處理死亡率最大（達(dá)83.34%），培養(yǎng)基僅添加NAA 會(huì)使外植體生根，單獨(dú)添加質(zhì)量濃度為0.5 mg/L 和1.0 mg/L 的NAA 后生根率分別達(dá)61.11%和72.22%。與不添加NAA相比，添加NAA 和質(zhì)量濃度為0.1～0.8 mg/L 的6-BA 顯著增加了愈傷組織的鮮質(zhì)量，其中，不同質(zhì)量濃度的NAA 和6-BA 配合使用對(duì)外植體鮮質(zhì)量的影響差異顯著，顯著高于單獨(dú)使用NAA 處理，且在質(zhì)量濃度為0.5 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA 處理時(shí)，愈傷組織鮮質(zhì)量達(dá)到最大，為62.13 mg。

表1 不同激素處理對(duì)小草海桐愈傷組織誘導(dǎo)的影響Tab.1 Effects of different hormone treatments on callus induction of Scaevola hainanensis

2.2 不同激素濃度對(duì)小草海桐愈傷組織分化不定芽的影響

不同濃度6-BA 對(duì)小草海桐愈傷組織分化不定芽的影響如表2所示。

表2 不同質(zhì)量濃度6-BA對(duì)小草海桐愈傷組織分化不定芽的影響Tab.2 Effects of different concentrations of 6-BA on the differentiation of adventitive buds in callus of Scaevola hainanensis

由表2 可知，不同濃度6-BA 對(duì)小草海桐愈傷組織分化不定芽的影響顯著，與不添加6-BA 相比，6-BA 顯著提高了不定芽的出芽率、出芽數(shù)（長出兩片及以上數(shù)量葉子認(rèn)定為大芽，長出一片和未長出葉子的芽點(diǎn)認(rèn)定為小芽）和大芽數(shù)。其中出芽率和大芽數(shù)最大值出現(xiàn)在質(zhì)量濃度為1.0 mg/L 的6-BA（分別達(dá)60.42%和0.25 個(gè)），并隨6-BA 濃度的增加而逐漸降低，出芽數(shù)最大值則出現(xiàn)在質(zhì)量濃度為1.5 mg/L 的6-BA（達(dá)1.23個(gè)）上。與不添加6-BA 相比，愈傷組織死亡率隨6-BA 濃度的升高，呈現(xiàn)先降低再升高的趨勢(shì)，在質(zhì)量濃度為1.0～1.5 mg/L 時(shí)達(dá)到最低為3.17%，最大死亡率低于不添加6-BA處理。

2.3 不同激素濃度對(duì)小草海桐不定根誘導(dǎo)的影響

不同激素濃度對(duì)小草海桐不定根誘導(dǎo)的影響如表3所示。

表3 不同激素濃度對(duì)小草海桐不定根誘導(dǎo)的影響Tab.3 Effects of different hormone concentrations on adventitious root induction of Scaevola hainanensis

由表3 可知，與MS 相比，1/2MS 明顯降低了不定芽的生根率和生根系數(shù)。MS 培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加NAA、IAA 和IBA，發(fā)現(xiàn)與無激素的MS培養(yǎng)基相比，NAA 處理使生根系數(shù)明顯增大，但降低了生根率，其中質(zhì)量濃度為1.0 mg/L 的NAA 使生根率和生根系數(shù)分別降低和提高至最小和最大值。與MS 培養(yǎng)基相比，添加IAA 和IBA 顯著提高了生根系數(shù)，但生根率無顯著上升，質(zhì)量濃度為2.0mg/L 的IAA 甚至顯著降低了生根率（降低了17.43%）。在IAA 處理中，質(zhì)量濃度為0.5 mg/L 的IAA使生根率和生根系數(shù)達(dá)到最大值。而在IBA 處理中，生根率最大值出現(xiàn)在質(zhì)量濃度為1.0 mg/L 的IBA，生根系數(shù)最大值出現(xiàn)在質(zhì)量濃度為1.5 mg/L 的IBA，但處理間差異不顯著。所有處理中，質(zhì)量濃度為0.5mg/L 的IAA分別使生根率和生根系數(shù)達(dá)到了最大值。

3 討論

植物體內(nèi)同時(shí)存在數(shù)種植物激素，它們之間可相互促進(jìn)增效，也可相互拮抗抵消，在植物組織培養(yǎng)過程中，激素雖然用量少，但是對(duì)植物組織培養(yǎng)起著顯著的調(diào)控作用。本研究以小草海桐葉片為研究對(duì)象，在MS+0.5 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA 培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)，誘導(dǎo)率高，且具有較高的鮮重。張華緯[4]認(rèn)為高濃度水平的6-BA 不利于愈傷組織的誘導(dǎo)，會(huì)出現(xiàn)愈傷組織生長狀況差，成功率低的問題，這與本研究結(jié)果相似，但于風(fēng)馳[5]等人認(rèn)為2,4-D 0.6 mg/L+KT 0.4 mg/L 較適合烏腺金絲桃愈傷組織誘導(dǎo)，這與本研究所得結(jié)果有所不同，可能是因?yàn)椴煌锓N之間有物種差異，對(duì)激素類型存在不同反應(yīng)。

在不定芽的分化和增殖方面，以草海桐[Scaevola taccada(Gaertn.)Roxb.]無菌苗葉片為外植體，在培養(yǎng)基中單獨(dú)添加質(zhì)量濃度為2.5 mg/L 的6-BA 可有效誘導(dǎo)不定芽[6]，本研究發(fā)現(xiàn)與不添加6-BA 處理相比，單獨(dú)添加質(zhì)量濃度為0.5 mg/L 和1.0 mg/L 的6-BA 激素處理的培養(yǎng)基中出芽率、出芽數(shù)均顯著高于其他處理。紅樹植物海漆、白骨壤、苦郎樹和海馬齒再生芽都可單獨(dú)使用NAA、IAA 或IBA 誘導(dǎo)生根[7-8]，本研究發(fā)現(xiàn)質(zhì)量濃度為0.5～2.0 mg/L 的NAA、IBA 和IAA 都可誘導(dǎo)小草海桐再生芽產(chǎn)生不定根，但I(xiàn)AA 對(duì)促進(jìn)再生芽生根效果顯著大于NAA和IBA。

4 結(jié)論

采用小草海桐葉片誘導(dǎo)愈傷組織進(jìn)一步誘導(dǎo)芽和根的組培技術(shù)可以用于小草海桐的快速繁殖，其中誘導(dǎo)愈傷組織的條件為MS+0.5 mg/L NAA+0.1 mg/L 6-BA，誘導(dǎo)不定芽的條件為MS+1.0 mg/L 6-BA，不定根的誘導(dǎo)條件為MS+0.5 mg/L IAA。