劉晨旭，郜娜

（鄭州大學(xué) 臨床藥理研究所，河南 鄭州 450001）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis, RA）是最常見的免疫介導(dǎo)性疾病之一。其主要病理表現(xiàn)為滑膜炎，特征是對稱的多關(guān)節(jié)疼痛和腫脹，通常累及手和腳的小關(guān)節(jié)，存在多種并發(fā)癥和關(guān)節(jié)外表現(xiàn)[1-3]。流行病學(xué)調(diào)查，我國的RA患病率為0.42%，患者總數(shù)為500萬[4]。RA不僅造成患者身體機(jī)能、生活質(zhì)量的下降，也給患者家庭和社會帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[5-6]。由于RA的病因不明，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，對RA的深入研究有助于進(jìn)一步理解RA的病理生理學(xué)特點(diǎn)，促進(jìn)RA診斷和治療的發(fā)展。

蛋白質(zhì)是組成人體一切細(xì)胞和組織的重要成分，是機(jī)體發(fā)揮功能的主要物質(zhì)之一，在幾乎所有的病理、生理過程中都是不可或缺的。蛋白質(zhì)組學(xué)是在特定時間點(diǎn)對生物系統(tǒng)（細(xì)胞、組織、器官、生物流體或生物體）中存在的整套蛋白質(zhì)（蛋白質(zhì)組）進(jìn)行系統(tǒng)和定量鑒定[7]。在過去的10余年里，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析了從RA患者中采集的不同類型的生物樣本（滑液、血漿和尿液），并取得了許多進(jìn)展。本文旨在總結(jié)蛋白質(zhì)組學(xué)在RA研究中的進(jìn)展，并介紹RA研究中涉及的蛋白質(zhì)組學(xué)方法，為進(jìn)一步研究RA的發(fā)病機(jī)制、尋找新的治療靶點(diǎn)提供參考。

1 蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用

1.1 傳統(tǒng)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

蛋白質(zhì)組學(xué)主要研究蛋白質(zhì)的表達(dá)、結(jié)構(gòu)、功能、修飾和相互作用以及這些方面在不同環(huán)境條件下的變化。在基于質(zhì)譜（mass spectrometry, MS）的蛋白質(zhì)組學(xué)分析出現(xiàn)之前，傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)分離技術(shù)以離子交換層析、尺寸排阻層析和親和層析為主。對于選擇性蛋白質(zhì)的分析，一般使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和Western blotting。但是這些技術(shù)僅限于對少數(shù)蛋白質(zhì)的分析，而且不能確定蛋白質(zhì)表達(dá)水平[8]。

1.2 MS技術(shù)

20世紀(jì)80年代末基質(zhì)輔助激光解吸電離法、電噴霧電離法的出現(xiàn)，使MS在蛋白質(zhì)測序領(lǐng)域開始流行[9]，使得通過MS對蛋白質(zhì)進(jìn)行高通量分析成為可能。MS是目前所有蛋白質(zhì)組研究的核心

目前，基于MS的蛋白質(zhì)組學(xué)主要依靠自下而上的MS法進(jìn)行分析，由多個不同的階段組成。首先，各種樣品制備措施確保生物樣品最適合MS分析，典型的步驟包括蛋白質(zhì)的變性、還原和烷基化。接下來，通過液相色譜（liquid chromatography, LC）處理該肽的混合物并進(jìn)行分離。從柱洗脫后，通過電噴霧電離處理肽以獲得電荷，并在MS儀中生成衍生光譜。最后，通過各種生物信息學(xué)手段解釋生成的光譜數(shù)據(jù)。自下而上的MS法實(shí)際上并不是對蛋白質(zhì)本身進(jìn)行測序，而是推斷蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)或?qū)Φ鞍踪|(zhì)進(jìn)行分類，因此該方法有時并不是非常敏感[9-10]。

1.3 生物信息學(xué)技術(shù)

生物信息學(xué)是運(yùn)用計(jì)算機(jī)科學(xué)技術(shù)和信息技術(shù)開發(fā)新算法和數(shù)據(jù)庫信息系統(tǒng)，對生物學(xué)過程進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和歸納甄別，確定數(shù)據(jù)所蘊(yùn)含的生物學(xué)意義并建模，開發(fā)新的數(shù)據(jù)分析工具的學(xué)科。生物信息學(xué)是一門生物學(xué)與信息學(xué)相結(jié)合的交叉學(xué)科。該領(lǐng)域正在不斷提出新的算法來管理大量的、不同種類的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，并在運(yùn)用過程中不斷進(jìn)步。各種生物信息學(xué)工具被逐步開發(fā)并用于蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和模體的分析、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的快速分析和MS的數(shù)據(jù)分析。

此外，將蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)與其他組學(xué)數(shù)據(jù)結(jié)合，正成為生物信息學(xué)新的趨勢。例如，可以建立蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)之間的逐點(diǎn)比較，趨勢不一致的蛋白質(zhì)/基因可能表明參與了重要的轉(zhuǎn)錄和翻譯后調(diào)節(jié)機(jī)制[11-12]。蛋白質(zhì)信號網(wǎng)絡(luò)的溯源也可以受益于其他組學(xué)數(shù)據(jù)。鑒于不同類型的組學(xué)數(shù)據(jù)通常是互補(bǔ)的，當(dāng)從多組學(xué)角度分析時，基于MS的蛋白質(zhì)組學(xué)將變得更加強(qiáng)大。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)在RA研究中的應(yīng)用

2.1 闡明RA的發(fā)病機(jī)制

研究不同條件下蛋白質(zhì)組的差異可以識別與疾病、應(yīng)激反應(yīng)或治療效果相關(guān)的蛋白質(zhì)。目前，多位學(xué)者已經(jīng)對不同類型的RA樣本進(jìn)行了大量的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。BIRKELUND等[13]利用LC-MS的方法對RA患者和脊柱關(guān)節(jié)炎（Spondyloarthritis,SpA）患者的滑液進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析。結(jié)果顯示，SpA和RA患者來自先天免疫系統(tǒng)的蛋白存在顯著差異，而這些差異主要來源于中性粒細(xì)胞，提示中性粒細(xì)胞在RA病理過程中起著獨(dú)特的重要作用。REN等[14]使用串聯(lián)MS標(biāo)簽（tandem mass tag, TMT）偶聯(lián)液相色譜的方法比較RA和骨關(guān)節(jié)炎患者滑膜組織中的蛋白質(zhì)組，結(jié)果顯示成纖維樣滑膜細(xì)胞中的嗅覺素4在RA關(guān)節(jié)炎癥中發(fā)揮重要作用。SHARMA等[15]應(yīng)用基于MS的蛋白質(zhì)組學(xué)方法，研究4名RA患者滑液纖維蛋白原中的瓜氨酸化位點(diǎn)。在所鑒定的23個位點(diǎn)中，其中位于α84、α123、α 129、α547、α573、α591、β334和γ134位的瓜氨酸化位點(diǎn)尚未見報(bào)道，研究這些新的瓜氨酸位點(diǎn)能增加對RA 免疫發(fā)病機(jī)制的理解。HU等[16]使用隨機(jī)森林模型和蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)的分析方法，對蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)在正常人和RA患者血清中ORM1存在顯著差異表達(dá)，且ORM1表達(dá)水平與疾病活動性呈正相關(guān)。ORM1在病理機(jī)制上與CD56dim自然殺傷細(xì)胞、效應(yīng)型記憶CD8+T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞密切相關(guān)。為理解RA的病理機(jī)制提供了新的視角。HUANG等[17]使用基于TMT的蛋白質(zhì)組學(xué)對炎癥性關(guān)節(jié)炎滑液來源的外泌體進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)與中軸型脊柱關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)和骨關(guān)節(jié)炎相比，RA中發(fā)現(xiàn)了28種高表達(dá)蛋白。其中包括玻連蛋白、肝素輔因子Ⅱ、纖維蛋白原β鏈、α-1抗胰蛋白酶和激肽原-1等，其與補(bǔ)體和凝血級聯(lián)反應(yīng)密切相關(guān)，這提示補(bǔ)體和凝血功能與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎有著重要的關(guān)系。

2.2 新生物標(biāo)志物

RA早期生物標(biāo)志物是從血液或其他體液、組織液中發(fā)現(xiàn)的某種成分。其作為RA的一種發(fā)生信號，能用于健康人群的篩檢及RA患者的早期診斷和治療反應(yīng)預(yù)測[18-19]。利用蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法，尋找具有特征性的RA生物標(biāo)志物，是蛋白質(zhì)組學(xué)在RA研究中重要的目的。

2.2.1 診斷生物標(biāo)志物 RA的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且受多種因素影響?，F(xiàn)有的診斷標(biāo)準(zhǔn)更傾向于是一種將RA其他疾病區(qū)分的分類標(biāo)準(zhǔn)，這導(dǎo)致現(xiàn)有診斷更多發(fā)生在癥狀出現(xiàn)后，這對于RA的治療和關(guān)節(jié)破壞的預(yù)防是非常不利的。而且現(xiàn)有的診斷標(biāo)志物鑒別能力有限，因此有必要尋找新的診斷標(biāo)志物，以盡早診斷RA[20-21]。

類風(fēng)濕因子（rheumatoid factor, RF）是最早在RA患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的生物標(biāo)志物，是診斷RA的標(biāo)準(zhǔn)之一[22]。但RF在正常人體內(nèi)也可出現(xiàn)，因此診斷的特異性較差。LEE等[23]對不同RF水平的RA患者血清，進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)掘潛在的生物標(biāo)志物，并運(yùn)用多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring,MRM）驗(yàn)證分析結(jié)果。在鑒定出的45個差異蛋白中，轉(zhuǎn)甲狀腺素、凝膠蛋白、血管緊張素原、脂多糖結(jié)合蛋白和蛋白S100-A9被證明在診斷類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中具有潛在的應(yīng)用價值。通過在單個樣品中同時檢測5種蛋白，MRM可以很容易診斷出RA。MUN等[24]也同樣使用MRM技術(shù)對蛋白質(zhì)組學(xué)確定的RA診斷生物標(biāo)志物進(jìn)行驗(yàn)證，確定血清淀粉樣蛋白A（serum amyloid A, SAA）和維生素D結(jié)合蛋白在區(qū)分類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者和健康對照中表現(xiàn)出較高性能。HUANG等[25]通過TMT結(jié)合LC-MS/MS對RA患者CD4+T細(xì)胞來源的外泌體進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。結(jié)果表明，二氫嘧啶酶相關(guān)蛋白3（dihydropyrimidinase-related protein 3, DPYSL3）在RA組中顯著上調(diào)，而蛋白酶體激活劑復(fù)合物亞基1（proteasome activator complex subunit 1, PSME1）在RA組中顯著下調(diào)。這些差異表達(dá)的蛋白可能與RA的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，DPYSL3和PSME1可能成為RA新的生物標(biāo)志物。

2.2.2 預(yù)測治療效果和區(qū)分疾病活動度的生物標(biāo)志物 RA患者常接受甲氨蝶呤等改善病情抗風(fēng)濕藥物和生物制劑的三聯(lián)療法，但近三分之一的患者對三聯(lián)療法反應(yīng)不佳[26]，這造成了巨大的浪費(fèi)和治療的不確定性。因此，CHEN等[27]試圖通過蛋白質(zhì)組學(xué)研究尋找可以預(yù)測三聯(lián)療法療效的生物標(biāo)志物，通過對三聯(lián)療法不同響應(yīng)者的血清蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析，確定了附睪分泌蛋白Li282和睪丸組織蛋白Li70可作為預(yù)測三聯(lián)療法療效的生物標(biāo)志物。CHEN等[28]采用同位素標(biāo)記相對與絕對定量技術(shù)（isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ）的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，對接受三聯(lián)療法14周后的有反應(yīng)者和無反應(yīng)者血清蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析，經(jīng)平行反應(yīng)監(jiān)測驗(yàn)證后，確認(rèn)應(yīng)答者和無應(yīng)答者體內(nèi)血清轉(zhuǎn)鐵蛋白含量差異顯著，認(rèn)為血清轉(zhuǎn)鐵蛋白相關(guān)分子機(jī)制可能是三聯(lián)療法是否起作用的關(guān)鍵，也可以作為研究難治性RA的關(guān)鍵靶點(diǎn)。甲氨蝶呤（Methotrexate,MTX）和艾拉莫德（Iguratimod, IGU）是廣泛用于治療RA的抗風(fēng)濕藥物。雖然兩者聯(lián)合可以顯著抑制RA的進(jìn)展，但一些患者對治療沒有反應(yīng)[29]。ZHANG等[30]利用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對聯(lián)合治療反應(yīng)良好和較差的RA患者血清蛋白進(jìn)行差異分析，得到的差異蛋白通過MRM進(jìn)一步驗(yàn)證，其中RELN、LDHA和MRC1被證實(shí)與甲氨蝶呤和艾拉莫德聯(lián)合治療反應(yīng)相關(guān)，Logistic回歸和ROC曲線分析結(jié)果表明，RELN、LDHA和MRC1有潛力成為客觀評價MTX和IGU療效的新指標(biāo)。董新文等[31]采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究了大鼠口服甲氨蝶呤后尿蛋白的變化。鑒定出的部分差異蛋白可以體現(xiàn)出甲氨蝶呤對機(jī)體谷胱甘肽代謝以及對JAK/STAT信號通路的影響。

目前臨床上對RA活動期的判斷均基于患者的臨床表現(xiàn)，并沒有可靠有效的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，因此有學(xué)者希望通過蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)掘可以區(qū)分RA活動度的標(biāo)志物。GONZáLEZ-RODRíGUEZ等[32]應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)策略，通過MS分析了不同活動度RA患者樣品。對篩選出的差異蛋白進(jìn)行驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)，載脂蛋白B、富含組氨酸的糖蛋白、血漿蛋白酶C1抑制劑、結(jié)合珠蛋白和SAA1含量在不同類型樣品中有明顯的區(qū)別，可作為區(qū)分RA活動度的候選標(biāo)志物。NYS等[33]也同樣認(rèn)為SAA可作為區(qū)分RA活動度的標(biāo)志物。其利用靶向蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對SAA的蛋白質(zhì)亞型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)SAA1亞型（主要是SAA1α和SAA1β亞型）在不同活動度RA患者血漿中存在明顯差異。

2.3 闡明藥物的作用機(jī)制

近年來隨著MS技術(shù)的發(fā)展，蛋白質(zhì)組學(xué)方法已成為檢測特定生物樣品中分子變化和相互作用的工具。因此，蛋白質(zhì)組學(xué)常被用來研究和評估新型藥物和功能性食品作用。尤其是蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)合iTRAQ的方法，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于研究藥物的治療機(jī)制和治療靶點(diǎn)的發(fā)現(xiàn)[34]。

JIANG等[35]采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對中藥黃花的乙醇提取物治療RA的機(jī)制進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)研究。結(jié)果表明，PI3K-Akt信號通路是黃花治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵通路。近年來，基于間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cell, MSC）療法被廣泛認(rèn)為是治療RA有前途的療法[36-37]。JUNG等[38]使用LC-MS/MS對人臍帶血MSCs治療前后的RA小鼠模型進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析，結(jié)果顯示MSCs在RA治療中的關(guān)鍵作用是抑制血小板激動劑的產(chǎn)生，使得在RA病理中起主要作用的血小板的活化可能會從初始狀態(tài)被抑制。JIA等[39]使用基于iTRAQ的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究香菜緩解RA惡病質(zhì)的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)香菜對RA惡病質(zhì)的緩解主要是因?yàn)橄悴丝梢圆糠只謴?fù)RA誘導(dǎo)的分子紊亂，包括碳代謝受損、線粒體功能惡化（三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化）和肌纖維類型改變。白芍是一種中草藥，目前已經(jīng)被批準(zhǔn)用于RA的治療。芍藥苷（paeoniflorin, PA）是白芍中的關(guān)鍵活性成分。YANG等[40]使用基于iTRAQ的定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析大鼠的滑膜組織，并通過Western blotting驗(yàn)證了通過IPA軟件分析得到的蛋白質(zhì)。結(jié)果顯示白血病抑制因子受體和Asporin蛋白對PA治療RA的貢獻(xiàn)最大，提示上述兩個蛋白可能是其治療RA的關(guān)鍵靶點(diǎn)。蔡義思等[41]提取大鼠滑膜組織蛋白質(zhì)，使用4D非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究當(dāng)歸拈痛湯組與風(fēng)濕熱痹證模型組之間的差異蛋白情況，發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸拈痛湯對風(fēng)濕熱痹證類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療涉及多靶點(diǎn)，可能通過調(diào)節(jié)Akt/Bax/Bcl-2通路發(fā)揮對風(fēng)濕熱痹證類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的防治作用。張睿等[42]為了研究甘草養(yǎng)陰湯聯(lián)合甲氨蝶呤對老年類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎小鼠的干預(yù)作用和整體效應(yīng)機(jī)制，采用非依賴采集蛋白組學(xué)技術(shù)分析各組小鼠的分泌表型特點(diǎn)。發(fā)現(xiàn)甲氨蝶呤聯(lián)合甘草養(yǎng)陰湯除了對多種炎癥因子的抑制作用，還傾向于對脂質(zhì)代謝等通路靶點(diǎn)的調(diào)節(jié)，尤其是上調(diào)葉酸合成通路相關(guān)靶點(diǎn)，對甲氨蝶呤治療ERA具有減毒增效作用。

3 結(jié)論和展望

在過去的10多年間，蛋白質(zhì)組學(xué)幫助從蛋白質(zhì)組變化的角度研究RA，加深了對RA的了解、幫助尋找新的治療靶點(diǎn)、尋找新的生物標(biāo)志物、預(yù)測藥物治療的反應(yīng)、提供個性化的治療方案，并最終將會對RA治療產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。此外，將蛋白質(zhì)組學(xué)與其他組學(xué)（例如基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)）相結(jié)合的新興技術(shù)為了解表型疾病特征與風(fēng)險因素之間的聯(lián)系提供了新的見解。

對單個細(xì)胞中DNA和RNA的高通量測序表明，單細(xì)胞水平的分子異質(zhì)性比之前意識到的要大。為了充分捕獲功能異質(zhì)性，還必須以單細(xì)胞分辨率對蛋白質(zhì)組進(jìn)行測序。畢竟，蛋白質(zhì)是細(xì)胞的主要功能分子，RNA豐度并不直接轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)豐度，而且蛋白質(zhì)含有轉(zhuǎn)錄組學(xué)無法捕獲的翻譯后修飾。單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)具有幫助進(jìn)一步了解細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的巨大潛力，是未來蛋白質(zhì)組學(xué)新的發(fā)展方向