李茂婷,何佩真,李 睿,周廣舉△

川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院:1.內(nèi)分泌科;2.影像醫(yī)學(xué)科,四川南充 637000

近年來(lái),2型糖尿病(T2DM)的患病率持續(xù)升高,其相關(guān)的心腦血管并發(fā)癥一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)。T2DM相關(guān)的并發(fā)癥中,動(dòng)脈粥樣硬化(AS)及其相關(guān)的心腦血管并發(fā)癥,如心肌梗死、腦卒中是其主要的死亡原因[1]。頸動(dòng)脈粥樣硬化(CAS)是全身動(dòng)脈硬化的一種表現(xiàn),也是DM患者大血管病變的早期主要征兆之一,由于頸動(dòng)脈位置淺而相對(duì)固定,彩色多普勒可用于檢查頸動(dòng)脈內(nèi)中膜厚度,進(jìn)而預(yù)測(cè)全身AS[2]。AS是一種與年齡相關(guān)的心血管疾病,其發(fā)生的始動(dòng)因素為血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,此外還與炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、脂質(zhì)代謝異常、氧化應(yīng)激等密切相關(guān),其中氧化應(yīng)激貫穿于AS的形成、發(fā)展和斑塊破潰的整個(gè)過(guò)程[3-5]。因此,及早發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激的相關(guān)因素并進(jìn)行干預(yù),有助于延緩AS的發(fā)生和發(fā)展,對(duì)于預(yù)防缺血性腦卒中、心肌梗死、下肢缺血性壞疽等AS相關(guān)血管事件的發(fā)生至關(guān)重要,同時(shí)可減輕全球疾病負(fù)擔(dān)。血清γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)是一種糖基化的線粒體酶,主要存在于細(xì)胞膜表面[6],它的主要功能是分解細(xì)胞外谷胱甘肽(GSH),因而被認(rèn)為是氧化應(yīng)激的生物標(biāo)志物。許多觀察性研究表明,血清GGT可能與AS、腦卒中、冠心病等心腦血管疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[7-12],但也有研究表明血清GGT與頸動(dòng)脈內(nèi)膜厚度及CAS之間缺乏關(guān)聯(lián)[13-14]。因此,目前血清GGT與CAS之間的因果關(guān)系尚不明確。上述截然不同的研究結(jié)果可能是因?yàn)橛^察性研究常受混雜因素、反向因果關(guān)系的影響,導(dǎo)致其驗(yàn)證因果關(guān)系的能力有限。孟德?tīng)栯S機(jī)化(MR)是流行病學(xué)研究中一個(gè)強(qiáng)有力的工具,該方法的核心思想是利用遺傳變異來(lái)評(píng)估危險(xiǎn)因素與特定疾病之間的因果關(guān)系[15]。本研究將通過(guò)觀察性研究探討血清GGT水平與CAS之間的關(guān)聯(lián)性,同時(shí)將基于全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)的匯總數(shù)據(jù)選取與血清GGT水平存在顯著關(guān)聯(lián)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)作為工具變量(IV)來(lái)進(jìn)一步探討血清GGT水平與CAS之間的因果關(guān)聯(lián)。本項(xiàng)MR分析選擇的IV需同時(shí)滿足以下3個(gè)條件[15]:(1)關(guān)聯(lián)性假設(shè),所選擇的IV與GGT強(qiáng)相關(guān)。(2)獨(dú)立性假設(shè),IV不能與血脂、血壓等混雜因素相關(guān)。(3)排他性假設(shè),IV僅通過(guò)影響GGT從而導(dǎo)致AS發(fā)生。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年1月至2023年6月本院內(nèi)分泌科收治的符合診斷標(biāo)準(zhǔn)的354例T2DM患者作為研究對(duì)象,男217例,女137例;年齡42～80歲。將其中247例CAS患者作為CAS組,107例無(wú)CAS患者作為無(wú)CAS組。一般資料包括一般信息、一般體格檢查及詳細(xì)檢查結(jié)果。所有研究對(duì)象均進(jìn)行頸動(dòng)脈超聲檢查。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡≥40歲;(2)T2DM患者。排除標(biāo)準(zhǔn)[16-17]:(1)急慢性肝病,如脂肪肝、病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、肝硬化、肝功能不全等;(2)膽道疾病,如膽囊炎、膽石癥、膽囊息肉、膽道腫瘤等;(3)大量飲酒者,乙醇攝入量男性每周>280 g,女性每周>140 g;(4)近6個(gè)月服用過(guò)他汀類調(diào)脂藥物及肝功能保護(hù)藥物。診斷標(biāo)準(zhǔn):(1)高血壓參照2018版《中國(guó)高血壓防治指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)或既往已診斷為高血壓且目前正在服用降壓藥物;(2)T2DM參照2020版《中國(guó)2型糖尿病防治指南》T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn)或既往已明確診斷的T2DM患者;(3)CAS參照2015版《中國(guó)腦卒中血管超聲檢查指導(dǎo)規(guī)范》的診斷標(biāo)準(zhǔn)。所有研究對(duì)象均知情同意并簽署知情同意書(shū)。本研究已獲得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(2023ER302-1)。

1.2方法

1.2.1研究設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)來(lái)源 本研究選用已經(jīng)公布的GWAS的匯總數(shù)據(jù),選取來(lái)自IEU數(shù)據(jù)庫(kù)的血清GGT水平作為暴露表型,選取來(lái)自GWAS catalog數(shù)據(jù)庫(kù)的頸動(dòng)脈內(nèi)膜厚度及來(lái)自FinnGen數(shù)據(jù)庫(kù)(R9版本)的AS(不包括腦動(dòng)脈粥樣硬化、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化及外周動(dòng)脈疾病)作為結(jié)局表型,采用MR分析評(píng)估其因果關(guān)聯(lián),同時(shí)采用敏感性分析來(lái)驗(yàn)證因果關(guān)聯(lián)的可靠性。具體特征見(jiàn)表1。

表1 兩樣本MR分析中GWAS數(shù)據(jù)信息匯總

1.2.2IV的選擇 選取IEU數(shù)據(jù)庫(kù)的血清GGT水平作為暴露表型,選擇與其明顯相關(guān)的SNP位點(diǎn)作為IV(P<5E-10);設(shè)置參數(shù)r2=0.001且kb=10 000的標(biāo)準(zhǔn)排除連鎖不平衡的干擾;計(jì)算F值,排除F<10的弱IV;剔除與結(jié)局直接相關(guān)的IV(P<5E-8)。在進(jìn)行MR分析前,先進(jìn)行MR-PRESSO分析(NbDistribution=10 000),以排除任何具有潛在多效性的異常值,以確保MR估計(jì)的可靠性。

1.2.3MR分析 MR分析基于R語(yǔ)言統(tǒng)計(jì)軟件,采用TwoSampleMR包進(jìn)行MR分析,采用逆方差加權(quán)法(IVW)作為主要分析方法,采用MR-Egger回歸法和加權(quán)中位數(shù)法(WM)進(jìn)一步驗(yàn)證MR結(jié)果。其中IVM是對(duì)所有SNP位點(diǎn)的效應(yīng)值進(jìn)行匯總。MR-Egger回歸法考慮了不同IV之間可能存在的異質(zhì)性,同時(shí)校正由IV多效性所產(chǎn)生的偏倚。而WM是將SNP位點(diǎn)的效應(yīng)值按照權(quán)重排序后獲得的分布函數(shù)的中位數(shù),WM對(duì)于有明顯離群SNP位點(diǎn)的因果推斷更為穩(wěn)健。

1.2.4敏感性分析 采用異質(zhì)性檢驗(yàn)、多效性檢驗(yàn)和逐個(gè)剔除檢驗(yàn)進(jìn)一步進(jìn)行敏感性分析。采用Cochran′sQ檢驗(yàn)對(duì)不同IV之間的異質(zhì)性進(jìn)行檢驗(yàn),當(dāng)P<0.05時(shí),表明不同IV之間存在異質(zhì)性,且P值越小,不同IV之間的異質(zhì)性越大。采用MR-Egger回歸法的截距項(xiàng)進(jìn)行多效性分析,以評(píng)估檢驗(yàn)各個(gè)IV是否存在水平多效性。如果IV不存在水平多效性,模型截距應(yīng)為0,回歸截距的P>0.05。當(dāng)研究結(jié)果存在水平多效性時(shí),表明IV可以通過(guò)除暴露結(jié)局以外的其他途徑導(dǎo)致結(jié)局發(fā)生,最終可能導(dǎo)致獨(dú)立性假設(shè)及排他性假設(shè)不成立。當(dāng)研究結(jié)果存在水平多效性時(shí)應(yīng)當(dāng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行謹(jǐn)慎解釋。逐個(gè)剔除檢驗(yàn)主要是逐個(gè)剔除IV后計(jì)算剩下IV的MR結(jié)果,如果剔除某個(gè)IV后其他IV的MR結(jié)果和總結(jié)果差異很大,則說(shuō)明MR結(jié)果對(duì)該IV是敏感的。

2 結(jié) 果

2.1CAS組和無(wú)CAS組基線特征比較 CAS組體質(zhì)量指數(shù)、年齡均大于無(wú)CAS組,吸煙患者比例、糖化血紅蛋白水平、血尿酸水平均高于無(wú)CAS組,高密度脂蛋白膽固醇水平低于無(wú)CAS組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);而CAS組與無(wú)CAS組性別比例、高血壓比例、T2DM病程、低密度脂蛋白膽固醇水平及GGT水平比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 CAS組和無(wú)CAS組基線特征比較[n(%)或M(P25,P75)或

2.2血清GGT水平與CAS的關(guān)聯(lián)性

2.2.1兩樣本MR分析結(jié)果 采用IVW作為評(píng)估血清GGT水平與CAS間因果效應(yīng)的主要方法,IVW結(jié)果不支持血清GGT水平與CAS之間存在因果效應(yīng)(GGT→頸動(dòng)脈內(nèi)膜厚度:P=0.423;GGT→AS:P=0.345)。

2.2.2敏感性分析及可視化結(jié)果 盡管不同IV之間異質(zhì)性較大(P<0.001),但MR-Egger回歸法及WM的結(jié)果與IVW一致,也不支持血清GGT水平與CAS之間存在因果效應(yīng)。此外,多效性檢驗(yàn)結(jié)果顯示,此研究不存在水平多效性(GGT→頸動(dòng)脈內(nèi)膜厚度:MR-Egger回歸截距=0.00,P=0.262;GGT→AS:MR-Egger回歸截距=0.00,P=0.059),見(jiàn)表3。MR分析結(jié)果散點(diǎn)圖見(jiàn)圖1。漏斗圖顯示兩側(cè)的SNP位點(diǎn)基本對(duì)稱分布,未見(jiàn)明顯異常的離群值,提示上述因果關(guān)聯(lián)受到潛在偏倚影響的可能性較小,見(jiàn)圖2。

圖1 血清GGT水平對(duì)頸動(dòng)脈內(nèi)膜厚度(左)和AS(右)因果效應(yīng)的散點(diǎn)圖

圖2 血清GGT水平對(duì)頸動(dòng)脈內(nèi)膜厚度(左)和AS(右)因果效應(yīng)的漏斗圖

表3 不同MR分析方法評(píng)估血清GGT水平對(duì)頸動(dòng)脈內(nèi)膜厚度或AS的因果效應(yīng)

3 討 論

DM是一種以胰島素缺乏或胰島素抵抗為核心的由遺傳、環(huán)境等多種因素共同決定的慢性代謝性疾病,其在全球范圍內(nèi)呈高患病率,與人們久坐不動(dòng)、飲食結(jié)構(gòu)由素食向肉食轉(zhuǎn)變、快餐化等生活方式的改變密切相關(guān),此外,還與人口老齡化也有一定關(guān)系。依據(jù)2021年全球DM地圖第10版數(shù)據(jù),2021年大約有5.37億20～79歲的成年人患DM,預(yù)測(cè)至2030年將增至6.43億,其中T2DM是DM的主要類型。DM可能導(dǎo)致大血管和微血管損傷,甚至引發(fā)自主神經(jīng)病變,導(dǎo)致大小便失禁等。T2DM相關(guān)的并發(fā)癥中,AS及其相關(guān)的心腦血管并發(fā)癥,如心肌梗死、腦卒中是其主要的死亡原因[1]。有研究發(fā)現(xiàn),血清GGT與氧化應(yīng)激密切相關(guān)[7],而氧化應(yīng)激貫穿于AS形成的整個(gè)過(guò)程。GGT是一種糖基化的線粒體酶,為二聚體糖蛋白,其相對(duì)分子質(zhì)量為68×103,包含相對(duì)分子質(zhì)量為46×103的重鏈和相對(duì)分子質(zhì)量為22×103的輕鏈,輕鏈含有GGT活性,而重鏈則將蛋白質(zhì)錨定在細(xì)胞膜上[8,9,18]。GGT廣泛存在于各個(gè)器官及組織中,包括肝臟、腎臟、肺、胰腺和血管內(nèi)皮等[8]。有研究表明,GGT至少以4種不同的分子形式存在于血液循環(huán)中,包括大GGT、中GGT、小GGT和游離GGT,每種不同分子形式的GGT均有自己的相對(duì)分子質(zhì)量和獨(dú)特的理化性質(zhì)[9,19]。一直以來(lái),關(guān)于GGT與CAS之間的因果關(guān)聯(lián)存在爭(zhēng)議[13-14,20-21],可能有以下原因:首先,血清GGT參與GSH的降解,而GSH是體內(nèi)重要的硫醇類抗氧化劑。其次,GGT在分解GSH的過(guò)程中產(chǎn)生半胱氨酸-甘氨酸,半胱氨酸-甘氨酸作為強(qiáng)還原劑,使Fe3+轉(zhuǎn)變?yōu)镕e2+,參與了包括超氧化物及過(guò)氧化氫在內(nèi)的活性氧產(chǎn)生[22],而這些活性氧可誘導(dǎo)低密度脂蛋白膽固醇氧化,從而參與AS。此外,血清GGT還介導(dǎo)了炎癥介質(zhì)白三烯C4向白三烯D4轉(zhuǎn)換。最后,在CAS斑塊中還發(fā)現(xiàn)了活性GGT,其與泡沫細(xì)胞共定位[7,10]。

本研究通過(guò)比較T2DM患者中有CAS患者與無(wú)CAS患者的血清GGT水平,發(fā)現(xiàn)二者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。同時(shí)進(jìn)一步進(jìn)行兩樣本MR分析,結(jié)果不支持血清GGT水平與CAS之間存在因果關(guān)聯(lián),這與既往大部分流行病學(xué)研究結(jié)果不一致,可能有以下原因:(1)流行病學(xué)研究表明,GGT與AS的危險(xiǎn)因素,如胰島素抵抗、高血壓、高血脂等代謝異常密切相關(guān)[23-24],這些代謝異常性疾病可能介導(dǎo)了GGT與CAS的關(guān)聯(lián),而MR分析中與致病危險(xiǎn)因素相關(guān)的遺傳變異在遺傳過(guò)程中隨機(jī)分配,自出生時(shí)已確定,避免了上述因素的影響。(2)觀察性研究中,暴露與結(jié)局常常同時(shí)確定,究竟是高水平血清GGT導(dǎo)致了CAS的發(fā)生和發(fā)展還是CAS的發(fā)生和發(fā)展導(dǎo)致了血清GGT水平升高,目前尚無(wú)法確定,且本項(xiàng)MR分析只研究了GGT對(duì)CAS的影響,可進(jìn)一步進(jìn)行反向MR分析確定CAS的發(fā)生是否導(dǎo)致GGT水平升高。(3)MR分析的基礎(chǔ)是假設(shè)GGT水平與CAS的發(fā)生存在線性因果關(guān)聯(lián),陰性結(jié)果表明GGT水平與CAS的發(fā)生之間不存在線性因果關(guān)聯(lián),但可能存在其他形式的關(guān)聯(lián)。(4)有研究發(fā)現(xiàn),在4種不同分子形式的GGT中,實(shí)際與CAS相關(guān)的是大GGT,其不僅存在于CAS的斑塊中,而且與心血管結(jié)局相關(guān)[19],但目前尚無(wú)與大GGT相關(guān)的GWAS匯總數(shù)據(jù),未來(lái)可進(jìn)一步開(kāi)展不同分子形式的血清GGT與CAS的關(guān)聯(lián)性研究。(5)有研究表明,GSH在細(xì)胞外被GGT分解后產(chǎn)生的前體氨基酸重新用于細(xì)胞內(nèi)GSH的合成,此過(guò)程稱為γ-谷氨酰循環(huán),γ-谷氨酰循環(huán)與GSH的合成和再循環(huán)密切相關(guān)[18]。因此,GGT在生理狀況下可能具有保護(hù)組織細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損害的作用,但流行病學(xué)研究表明其為氧化應(yīng)激的血清學(xué)標(biāo)志物[7],因此可提出以下假設(shè):在受到氧化應(yīng)激損傷時(shí),血清GGT水平升高以抵御氧化應(yīng)激,然而當(dāng)GGT升高到一定水平時(shí),反而成為導(dǎo)致氧化應(yīng)激加重的危險(xiǎn)因素,但仍需進(jìn)一步研究去檢驗(yàn)假設(shè)。(6)MR分析中所選擇的IV只解釋了暴露因素的一部分,且MR分析得出的結(jié)論是理論上的,不能代替臨床上實(shí)際的干預(yù)效果,仍需隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。(7)MR分析未考慮生物體在發(fā)育過(guò)程中存在渠道化的特性,也就是個(gè)體在發(fā)育過(guò)程中,可能會(huì)通過(guò)自身調(diào)節(jié)的方式對(duì)抗由于環(huán)境變化導(dǎo)致的遺傳變異所決定的表型改變,努力維持自身的穩(wěn)態(tài),生物體渠道化的特性可能會(huì)使因果關(guān)聯(lián)的估計(jì)出現(xiàn)偏差。實(shí)際上,MR分析除了3個(gè)主要條件外,還有其他的次要附加假設(shè),在實(shí)行MR分析過(guò)程中,不可能滿足所有的附加假設(shè),盡管如此,但只要滿足MR分析的3個(gè)主要條件,所得出的結(jié)論仍然是有效的,可以為探究因果關(guān)系、選擇干預(yù)靶點(diǎn)等提供一定的臨床價(jià)值。未來(lái)可使用不同的MR分析方法進(jìn)一步探討GGT與CAS的因果關(guān)聯(lián),以盡可能減少誤差,并且提高結(jié)果的可信度。

本研究存在以下局限性:(1)有研究表明,血清GGT水平可能與年齡、種族、吸煙等因素相關(guān)[25-26],但本研究未進(jìn)行進(jìn)一步分層分析;(2)兩樣本的MR分析中未找到CAS的GWAS匯總數(shù)據(jù),只使用了頸動(dòng)脈內(nèi)膜厚度與AS(排除腦動(dòng)脈粥樣硬化、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化與外周動(dòng)脈疾病)的GWAS匯總數(shù)據(jù)代替;(3)MR研究中的參與者主要為歐洲白種人,在歐洲白種人中發(fā)現(xiàn)的遺傳變異不一定與其他地區(qū)及人種的人群相同,未來(lái)需要對(duì)其他地區(qū)及人種的人群采用兩樣本MR分析進(jìn)一步論證因果關(guān)聯(lián);(4)MR分析是假設(shè)因果關(guān)聯(lián)發(fā)生在同一個(gè)方向上,由于生物系統(tǒng)的復(fù)雜多樣性,暴露和結(jié)局之間可能存在反饋通路,會(huì)使結(jié)果變得不準(zhǔn)確。

盡管本研究有諸多局限,但也有以下優(yōu)點(diǎn):(1)本研究與既往的流行病學(xué)研究比較,巧妙結(jié)合了MR分析探討血清GGT水平與CAS的因果關(guān)聯(lián)[20];(2)本研究MR分析克服了傳統(tǒng)流行病學(xué)研究易受混雜因素及反向因果關(guān)系的影響,且數(shù)據(jù)容易從公開(kāi)的遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得。

綜上所述,本次觀察性研究及MR分析結(jié)果均不支持血清GGT水平與CAS之間存在因果關(guān)聯(lián),未來(lái)可進(jìn)一步開(kāi)展更大樣本,以及不同地區(qū)及人種人群的MR分析,以論證二者之間的因果關(guān)聯(lián)。