朱明武,李多多,劉向群,王亞南

1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,河南新鄉(xiāng) 453100;2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒內(nèi)科,河南新鄉(xiāng) 453100;3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院營(yíng)養(yǎng)科,河南新鄉(xiāng)453002

諾如病毒是引起急性非細(xì)菌性胃腸炎暴發(fā)及散發(fā)的主要病毒,具有傳染性強(qiáng)、變異快的特點(diǎn),常引起暴發(fā)流行。隨著輪狀病毒疫苗接種率提高,諾如病毒已經(jīng)成為兒童病毒性腹瀉的首位病因,在兒童、免疫力低下人群中普遍易感,嚴(yán)重者可因脫水或其他嚴(yán)重并發(fā)癥而死亡[1]。由于缺乏有效的諾如病毒感染致病動(dòng)物模型,諾如病毒感染引起的胃腸炎的致病機(jī)制目前仍然還不是很清楚。有研究表明,免疫抑制機(jī)制通過抑制受感染宿主細(xì)胞防御病毒感染的能力或抑制免疫效應(yīng)細(xì)胞消滅病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞,在促進(jìn)病毒感染方面扮演重要角色[1-2]。人類白細(xì)胞抗原-G(HLA-G)是一種非經(jīng)典的組織相容性復(fù)合體Ⅰ類分子,是體內(nèi)重要的免疫耐受分子,在先天免疫和適應(yīng)性免疫中發(fā)揮重要免疫調(diào)節(jié)作用。作為體內(nèi)重要的免疫耐受分子,HLA-G的免疫抑制功能主要是抑制自然殺傷(NK)細(xì)胞、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和抗原呈遞細(xì)胞的成熟和功能。此外,HLA-G還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生和誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)揮長(zhǎng)期耐受性作用,抑制先天免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答,導(dǎo)致病毒感染細(xì)胞的免疫逃逸。而HLA-G 3′非翻譯區(qū)(3′UTR)基因多態(tài)性(SNP)在HLA-G的功能表達(dá)中起關(guān)鍵作用,它可以在病理?xiàng)l件下影響mRNA的穩(wěn)定性和表達(dá)。近年來,HLA-G已被證明與人類巨細(xì)胞病毒、人乳頭瘤病毒(HPV)、甲型流感病毒、人類免疫缺陷病毒(HIV)等病毒易感性相關(guān),被認(rèn)為是病毒逃避宿主免疫監(jiān)視的重要易感基因,然而該基因與兒童諾如病毒感染是否具有關(guān)聯(lián)目前少見報(bào)道[3-4]。本課題擬通過研究HLA-G 3′UTR SNP位點(diǎn)及血清可溶性HLA-G(sHLA-G)水平與兒童諾如病毒感染的相關(guān)性,為闡明免疫耐受在兒童諾如病毒感染發(fā)生和發(fā)展中的可能作用提供資料,也為諾如病毒感染患兒的診斷和治療提供新的思路和理論依據(jù),現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2021年1月至2022年12月因急性胃腸炎于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒童門診就診的700例患兒作為研究對(duì)象。在新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科完善諾如病毒抗原檢測(cè),篩選后留取確診諾如病毒感染患兒346例作為病例組,其中男196例,女150例,并且以“諾如病毒性腸炎”為檢索條件,通過醫(yī)院臨床數(shù)據(jù)平臺(tái)和實(shí)驗(yàn)室大數(shù)據(jù)平臺(tái)收集其臨床資料及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果,以2020年版兒童急性感染性腹瀉為診療規(guī)范,病例組按照患兒病情進(jìn)展程度分為輕型感染組、中型感染組和重型感染組。病例組納入標(biāo)準(zhǔn):(1)諾如病毒抗原或RNA檢測(cè)陽(yáng)性;(2)在臨床診斷感染性腹瀉基礎(chǔ)上,大便性狀改變(稀水樣或蛋花湯樣)且排便次數(shù)增加(24 h排便次數(shù)≥3次)或24 h內(nèi)出現(xiàn)嘔吐≥2次;(3)大便常規(guī)檢查結(jié)果提示白細(xì)胞計(jì)數(shù)(WBC)及紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)均≤10/HP;(4)病程不超過2周。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并輪狀病毒感染;(2)大便常規(guī)檢查結(jié)果提示W(wǎng)BC及RBC均>10/HP;(3)細(xì)菌、寄生蟲、真菌及其他病原菌感染。另選取同期在新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院門診進(jìn)行健康體檢的320例兒童作為對(duì)照組,其中男182例,女138例。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn):(1)1個(gè)月內(nèi)均無(wú)感染性疾病病史;(2)均留有血液標(biāo)本。所有研究對(duì)象均知情同意并簽署知情同意書。本研究經(jīng)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。兩組性別、各年齡段占比等一般資料比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 病例組和對(duì)照組一般資料比較[n(%)]

1.2方法

1.2.1血液基因組提取 對(duì)照組和病例組各留取2～3 mL全血標(biāo)本,使用外周血DNA基因組提取試劑盒提取外周血基因組DNA,采用Nano Drop紫外分光光度計(jì)測(cè)量A值(A260/A280≈1.8)后進(jìn)行分裝并冷凍儲(chǔ)存于-70 ℃冰箱備用。

1.2.2HLA-G基因擴(kuò)增與分型 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物序列來源于文獻(xiàn)[5-7],由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。PCR總體系共25.0 μL,包括PCR Master 12.5 μL(大連康為世紀(jì)公司),去離子水9.5 μL,正向、反向引物各1.0 μL(正向引物序列:5′-TGTGAAACAGCTGCCCT GTGT-3′;反向引物序列:5′-CTGGTGGGACAAGGTTCTACTG-3),模板DNA1.0 μL。引物序列HLA-G 3′UTR擴(kuò)增程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,65.5 ℃ 退火30 s,72 ℃延伸1 min,72 ℃延伸5 min,共32個(gè)循環(huán);擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳,以紫外光下顯示是否出現(xiàn)理想條帶來確定擴(kuò)增產(chǎn)物的有無(wú)。送檢測(cè)序,采用DNAstar V7.0軟件分析測(cè)序結(jié)果。

1.2.3ELISA檢測(cè)血清sHLA-G水平 留取所有研究對(duì)象外周血2～3 mL,3 000 r/min離心10 min,分別收集血清至EP管。將EP管血清分別吸取100 μL至ELISA微孔板進(jìn)行sHLA-G水平檢測(cè),兩組標(biāo)本均做復(fù)孔,結(jié)果取其測(cè)量值的平均值,操作流程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的A值采用GraphPad Prism (Version 6.01)擬合曲線軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,病例組和對(duì)照組標(biāo)本A值帶入回歸方程計(jì)算sHLA-G水平,試劑盒檢測(cè)sHLA-G的靈敏度為0.05 U/mL。

2 結(jié) 果

2.1兩組HLA-G 3′UTR SNP位點(diǎn)基因型和等位基因分布頻率比較 HLA-G 3′UTR共發(fā)現(xiàn)8個(gè)SNP位點(diǎn),分別是14 bp+/-(rs371194629)、+3003 T/C(rs1707)、+3010 C/G(rs1710)、+3027 A/C(rs17179101)、+3035 C/T(rs17179108)、+3142 C/G(rs1063320)、+3187 A/G (rs9380142)和+3196 C/G(rs1610696)。除14 bp+/-(rs371194629)和+3142 C/G(rs1063320)外,其余SNP位點(diǎn)均不符合Hardy-Weinberg平衡,不具有人群代表性。病例組和對(duì)照組HLA-G 3′UTR 14 bp+/-和+3142 C/G基因型和等位基因分布頻率比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 病例組和對(duì)照組HLA-G 3′UTR 14 bp+/-和+3142 C/G基因型和等位基因分布頻率比較[n(%)]

2.2輕型、中型和重型感染組HLA-G 3′UTR 14 bp+/-和+3142 C/G基因型和等位基因分布頻率比較 輕型、中型和重型感染組分別為150、100、96例。輕型、中型和重型感染組HLA-G 3′UTR 14 bp+/-和+3142 C/G基因型和等位基因分布頻率比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 輕型、中型和重型感染組HLA-G 3′UTR 14 bp+/-和+3142 C/G基因型和等位基因分布頻率比較[n(%)]

2.3對(duì)照組和病例組血清sHLA-G水平比較 對(duì)照組血清sHLA-G水平為(19.94±6.81)U/mL,明顯低于病例組的(34.58±10.13)U/mL,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。輕型、中型和重型感染組sHLA-G水平分別為(28.76±16.17)、(31.06±20.77)、(33.56±19.06)U/mL,3組sHLA-G水平兩兩比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4病例組和對(duì)照組HLA-G 3′UTR 14 bp+/-基因型和+3142 C/G基因型對(duì)應(yīng)的血清sHLA-G水平比較 病例組和對(duì)照組HLA-G 3′UTR 14 bp+/-基因型(14 bp+/14 bp+、14 bp+/14 bp-、14 bp-/14 bp- )對(duì)應(yīng)的血清sHLA-G水平比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);病例組和對(duì)照組HLA-G 3′UTR+3142 C/G基因型(CC、CG、GG)對(duì)應(yīng)的血清sHLA-G水平比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 病例組和對(duì)照組HLA-G 3′UTR 14 bp+/-基因型和+3142 C/G基因型對(duì)應(yīng)的血清sHLA-G水平比較

3 討 論

病毒逃避機(jī)體免疫監(jiān)視的一個(gè)常見機(jī)制是經(jīng)典的HLA-Ⅰa類抗原缺失或下調(diào),以及非經(jīng)典的HLA-Ⅰb類抗原(如HLA-e、HLA-F和HLA-G)的新表達(dá)[5-7]。在病毒感染背景下,作為免疫抑制檢查點(diǎn)分子HLA-G通過抑制免疫細(xì)胞(巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞)的效應(yīng)功能,抑制先天免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答,維持病毒感染的持續(xù)性和易感性。本研究檢測(cè)了346例諾如病毒感染患兒血清sHLA-G水平,并采用PCR擴(kuò)增及基因測(cè)序分析了HLA-G 3′UTR 8個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型和等位基因分布頻率,探討HLA-G 3′UTR SNP及血清sHLA-G水平與兒童諾如病毒感染的相關(guān)性。位于HLA-G 3′UTR SNP與多種感染性疾病(病毒感染)的相關(guān)性已被報(bào)道,如HIV、丙型肝炎病毒、HPV、乙型肝炎病毒、新型冠狀病毒等[8]。在女性HIV、HPV感染患者中,3′UTR 14 bp-和3′UTR+3142 C等位基因與HIV易感性相關(guān),如14 bp+/+純合子等位基因人群HPV18高危型病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)增加,患者更容易發(fā)生宮頸癌變。另一項(xiàng)關(guān)于新型冠狀病毒的研究發(fā)現(xiàn),HLA-G分子參與了機(jī)體新型冠狀病毒的感染過程,其可作為監(jiān)測(cè)新型冠狀病毒感染患者治療恢復(fù)期機(jī)體免疫應(yīng)答的重要指標(biāo)[9]。雖然HLA-G 3′UTR的SNP可能通過調(diào)節(jié)HLA-G的表達(dá)而影響病毒對(duì)機(jī)體的感染,但本研究沒有發(fā)現(xiàn)HLA-G 3′UTR SNP與兒童諾如病毒感染的易感性相關(guān)。有研究表明,病毒感染患者血清sHLA-G水平明顯高于健康者,而在病毒感染消失后,血清sHLA-G水平與健康人相似[9-10],這與本研究結(jié)論一致,可能是由于血清sHLA-G水平升高會(huì)影響外周血中T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和NK細(xì)胞等不同類型細(xì)胞的功能,導(dǎo)致固有免疫應(yīng)答或針對(duì)病毒抗原的特異性免疫應(yīng)答受損,健康人血清sHLA-G水平有助于在健康受試者中控制免疫效應(yīng)細(xì)胞的遷移。相反,當(dāng)血清sHLA-G水平升高(病毒感染)時(shí),會(huì)導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞向炎癥反應(yīng)部位(病毒感染)或腫瘤微環(huán)境的遷移減少,這種控制功能的喪失會(huì)導(dǎo)致免疫細(xì)胞向外周組織異常遷移,加劇病毒持續(xù)感染而導(dǎo)致組織損傷,同時(shí)還會(huì)下調(diào)T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞上趨化因子受體的表達(dá),抑制免疫效應(yīng)細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境或病毒感染部位招募,不同程度地影響疾病的嚴(yán)重程度及進(jìn)程。本研究未發(fā)現(xiàn)sHLA-G水平在不同嚴(yán)重程度諾如病毒感染患兒中有差異,需要進(jìn)一步研究進(jìn)行評(píng)價(jià)。另有研究發(fā)現(xiàn),3′UTR 14 bp+/- SNP會(huì)影響HLA-G mRNA的穩(wěn)定性和表達(dá)[11-12],特別是14 bp-等位基因會(huì)增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性,使sHLA-G水平升高。而+3187 bp位置的腺嘌呤修飾了HLA-G mRNA中富含腺嘌呤-尿嘧啶元件序列,導(dǎo)致其穩(wěn)定性下降,使HLA-G水平降低。在+3142 bp位置的一個(gè)SNP C>G(rs1063320)通過增加該區(qū)域?qū)iR-148a、miR-148b和miR-152的親和力來影響HLA-G位點(diǎn)的表達(dá),進(jìn)而通過mRNA降解和翻譯抑制降低mRNA的可用性。但本研究并未發(fā)現(xiàn)血清sHLA-G水平與14 bp+/- SNP和+3142 C/G SNP有關(guān),這可能是由于sHLA-G在不同疾病(病毒感染)進(jìn)程中潛在的分子機(jī)制也各不相同,同時(shí)因?yàn)楸狙芯繕颖玖坎粔虼?未排除藥物治療因素的影響[13-19]。

綜上所述,在病毒感染背景下,作為免疫抑制分子HLA-G可能發(fā)揮了重要作用,諾如病毒感染時(shí)血清sHLA-G水平升高可能間接影響諾如病毒感染的易感性,而患兒病情嚴(yán)重程度及預(yù)后的關(guān)聯(lián)尚需進(jìn)一步納入更大樣本量進(jìn)行研究和驗(yàn)證HLA-G在諾如病毒感染進(jìn)展中的功能,為進(jìn)一步了解諾如病毒的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)[20-21],以期為諾如病毒的預(yù)防和治療提供新思路。