周心怡,林 萃,呂曉萍,譚功軍,汪國慶

廣東省珠海市婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳與產(chǎn)前診斷科,廣東珠海 519000

遺傳代謝病(IEM)是生化代謝標(biāo)志物異常的一類疾病,屬于單基因遺傳病的一部分,絕大多數(shù)為常染色體隱性遺傳,少數(shù)為常染色體顯性遺傳、X連鎖伴性遺傳或線粒體遺傳[1]。近年來,隨著人民生活水平的提高和醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,許多非遺傳因素導(dǎo)致的疾病得到了控制,但遺傳因素在疾病構(gòu)成比例中日益突出。MILLINGTON等[2]首次將串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用于新生兒遺傳病篩查以來,經(jīng)過30多年的發(fā)展,串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)已成為IEM篩查診斷中理想的技術(shù)。利用高靈敏度、高特異度和快速檢測的串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)能在2 min內(nèi)同時測定同一生物樣品中多種目標(biāo)代謝物,實現(xiàn)1次實驗即可檢測出包括因氨基酸、有機(jī)酸代謝紊亂、脂肪酸氧化缺陷而導(dǎo)致的數(shù)10種IEM[3]。因此,將串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用于IEM的篩查,有助于IEM的早期診斷、及時精準(zhǔn)干預(yù)、節(jié)約醫(yī)療資源,同時也能提高臨床對新生兒IEM篩查及高危篩查、診療、防控的能力[4]。本研究分析了珠海市2021年1月至2022年12月新生兒IEM串聯(lián)質(zhì)譜篩查情況,現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2021年1月至2022年12月在珠海地區(qū)出生的20 364例新生兒作為研究對象,其中男10 784例,女9 580例;足月新生兒(孕周:37～42周) 19 141例,早產(chǎn)兒(孕周:<37周) 1 223例;低體質(zhì)量兒(<2 500 g) 1 060例。所有研究對象監(jiān)護(hù)人均知情同意并簽署知情同意書,且本研究通過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)(2020112501)。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集 依據(jù)《新生兒疾病篩查技術(shù)規(guī)范》[5]相關(guān)要求,在新生兒出生后72 h,于腳跟內(nèi)、外側(cè)分別采血,滴于S&S903新生兒篩查專用濾紙待其自然晾干,置于2～8 ℃冰箱中保存,1周內(nèi)送檢。

1.2.2儀器與試劑 儀器采用美國AB SCIEX API3200MD串聯(lián)質(zhì)譜儀、PerkinElmer Puncher 9 全自動打孔儀、杭州奧盛MB100-2A恒溫孵育振蕩器,試劑采用PerkinElmer公司生產(chǎn)的非衍生化多種氨基酸、肉堿和琥珀酰丙酮測定試劑盒,S&S903新生兒篩查專用濾紙由杭州杰毅麥特公司生產(chǎn)(浙杭械備20210259)。

1.2.3檢測方法 所有操作均嚴(yán)格按照PerkinElmer非衍生化多種氨基酸、肉堿和琥珀酰丙酮測定試劑盒說明書進(jìn)行。從干血濾紙中打孔3 mm的圓形血片,置于96孔聚丙烯板孔內(nèi),加入萃取液與內(nèi)標(biāo)液的混合液共100 μL,650 r/min混勻,45 ℃孵育45 min后,將75 μL混合液轉(zhuǎn)移至無包被潔凈微孔板,上機(jī)檢測。檢測指標(biāo)包括11種氨基酸與31種肉堿。

1.2.4結(jié)果分析 采用ChemoView專用定量分析軟件,根據(jù)待測標(biāo)本中各種氨基酸、肉堿及其內(nèi)標(biāo)的離子峰強(qiáng)度,利用已知濃度的內(nèi)標(biāo)計算待測標(biāo)本中氨基酸、肉堿水平及其之間的比值。

1.2.5可疑陽性病例的召回和確診 初次篩查為陽性的血片通過原血片進(jìn)行復(fù)查,2次結(jié)果均為陽性則召回復(fù)查。復(fù)查仍陽性者進(jìn)行氣相質(zhì)譜檢測和(或)基因檢測等以明確診斷。確診患兒給予特殊飲食或藥物治療,并納入系統(tǒng)管理。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用Excel2003統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示。

2 結(jié) 果

2.1篩查及確診情況 20 364例接受串聯(lián)質(zhì)譜篩查的新生兒中,初篩陽性人數(shù)687例,初篩陽性率為3.37%(687/20 364);初篩陽性召回人數(shù)為621例,初篩陽性召回率為90.39%(621/687)。經(jīng)召回復(fù)查發(fā)現(xiàn)70例可疑陽性,篩查陽性率為0.34%(70/20 364),召回陽性率為11.27%(70/621),最終確診7例,總發(fā)病率為1/2 909。見表1。其中氨基酸代謝病2例(希特林蛋白缺乏癥和高甲硫氨酸血癥各1例)、脂肪酸代謝障礙4例(原發(fā)性肉堿缺乏癥2例、中鏈?；o酶A脫氫酶缺乏癥和極長鏈?；o酶A脫氫酶缺乏癥各1例)、有機(jī)酸代謝病(甲基丙二酸血癥)1例。

表1 篩查及確診情況[n(%)]

2.2IEM患兒串聯(lián)質(zhì)譜篩查指標(biāo)及基因檢測結(jié)果 7例確診患兒中有6例進(jìn)行了基因突變檢測,并對其主要標(biāo)志物及相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行分析,其中氨基酸基因確診2例,脂肪酸基因確診3例,有機(jī)酸基因確診1例。見表2。

表2 IEM患兒串聯(lián)質(zhì)譜篩查指標(biāo)及基因檢測結(jié)果

3 討 論

IEM的發(fā)生多為機(jī)體所必需的某種酶、運(yùn)載蛋白或受體所編碼的基因發(fā)生突變造成蛋白質(zhì)、糖、氨基酸、脂類等代謝異常,進(jìn)而累積至多臟器、多系統(tǒng)而出現(xiàn)一系列病理和臨床癥狀的一類疾病。臨床表現(xiàn)為嗜睡、嘔吐、喂養(yǎng)困難、短期代謝性酸中毒等[6]。

本研究結(jié)果顯示,20 364例接受串聯(lián)質(zhì)譜篩查的新生兒中,初篩陽性人數(shù)687例,初篩陽性率為3.37%,初篩陽性召回人數(shù)621例,初篩陽性召回率為90.39%。復(fù)查檢測發(fā)現(xiàn)70例可疑陽性,篩查陽性率為0.34%,召回陽性率為11.27%,最終確診7例,總發(fā)病率為1/2 909,略低于本地區(qū)先天性甲狀腺功能減低癥的發(fā)病率(1/1 884),但明顯高于該地區(qū)苯丙酮尿癥的發(fā)病率(1/33 403)[7]。雖然串聯(lián)質(zhì)譜法本身靈敏度高,但也受患者早產(chǎn)、低體質(zhì)量、胎齡、黃疸、母源性缺乏和季節(jié)變化、濾紙質(zhì)量等影響而導(dǎo)致假陽性率較高。

IEM的臨床表現(xiàn)復(fù)雜且多樣,因此,及時進(jìn)行準(zhǔn)確的相關(guān)致病基因檢測尤為重要。本研究中希特林蛋白缺乏癥就是因SLC25A13基因參與編碼的蛋白缺乏造成干細(xì)胞中系列糖酵解產(chǎn)物的表達(dá)受到抑制而引起的低蛋白血癥。檢測發(fā)現(xiàn),其為SLC25A13基因c.852_855del復(fù)合c.1638_1660dup突變的希特林蛋白缺乏癥,但其串聯(lián)質(zhì)譜檢測結(jié)果和臨床肝功能均未出現(xiàn)明顯異常。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),患兒易在新生兒期出現(xiàn)肝內(nèi)膽汁淤積癥、黃疸、肝功能異常、氨基酸血癥、半乳糖血癥等,雖然SLC25A13基因突變類型有明顯的種族及地域差異,但其臨床表現(xiàn)、異常生化指標(biāo)無明顯差異[8]。同時,也有學(xué)者指出嬰兒單純希特林蛋白缺乏癥患兒預(yù)后良好[9]。

本次研究亦發(fā)現(xiàn)1例高甲硫氨酸血癥,患兒會因甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶(MAT)發(fā)生缺陷致使甲硫氨酸代謝異常,進(jìn)而發(fā)生高甲硫氨酸血癥。MAT由MAT1A基因編碼,國內(nèi)目前已有報道的突變位點分別為c.791G>A、c.769G>A、c.1070C>T、c.874C>T[10],而本研究中所出現(xiàn)的c.769G>A基因突變位點位于7號外顯子,為單個核苷酸的變異,患兒首次檢測MET水平為48.86 μmol/L,召回重采足底血復(fù)查MET水平高達(dá)88.72 μmol/L(參考范圍8.00～40.00 μmol/L)。據(jù)文獻(xiàn)報道,甲硫氨酸血癥患者臨床表現(xiàn)均有不同[11],因此,臨床對于不同的病例應(yīng)進(jìn)行個性化分析,判斷其預(yù)后情況并持續(xù)隨訪。

本研究發(fā)現(xiàn)的2例原發(fā)性肉堿缺乏癥中,其中1例因拒做基因檢測而缺少基因診斷結(jié)果,另1例為SLC22A5A基因復(fù)合雜合突變。由于編碼有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)體的SLC22A5A基因突變導(dǎo)致肉堿轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)障礙,造成游離肉堿在組織細(xì)胞內(nèi)水平降低[12]。脂肪利用減少后積聚在骨骼肌或心肌、肝臟,可引起進(jìn)一步病變,具有潛在危害[13]。有文獻(xiàn)報道SLC22A5A基因突變有180多種,最為常見的為c.760C>T突變,而本研究出現(xiàn)病例所攜帶的為c.51C>G突變,c.51C>G在湖南、廣西等地攜帶率較高[12]。目前對于細(xì)胞程序性死亡的治療首選左旋肉堿穩(wěn)定口服給藥,且需終身補(bǔ)充左旋肉堿,效果明顯。

中鏈?；o酶A脫氫酶缺乏癥的致病基因為ACADM基因?；蛲蛔儗?dǎo)致相應(yīng)酶合成減少或完全缺乏,使得中鏈脂肪酸發(fā)生代謝障礙[14]。ACADM基因最常見致病突變位點為c.985A>G,白種人群中最多占比94.00%,有特異的種族起源性。而本文中出現(xiàn)的基因突變類型為c.50G>C合并c.838dup,數(shù)據(jù)庫中尚未見此報道[15]。中鏈?；o酶A脫氫酶缺乏癥發(fā)病多有誘發(fā)因素,長時間饑餓最為常見,且其臨床表現(xiàn)多樣,無特異性,首發(fā)癥狀為嗜睡和嘔吐,部分以黃疸表現(xiàn),可能為肝功能受損所致。該病治療原則為避免饑餓,保證熱量供應(yīng),且應(yīng)積極對癥,提前預(yù)防。

極長鏈?；o酶A脫氫酶缺乏癥的致病基因為ACADVL基因,為常染色體隱性遺傳病[16]。本研究中該患者檢出c.1246G>A和c.1427G>A復(fù)合雜合變異,突變基因分別來源于父親與母親。2022年在美國報道的c.1246G>A突變位點意義不明,但c.1427G>A位點突變導(dǎo)致終止密碼子提前,氨基酸構(gòu)象發(fā)生改變,從而致病。患兒C14:1 水平為5.124 μmol/L(正常參考范圍0.00～0.30 μmol/L),MILLER等[17]指出一旦C14:1 水平>1.00 μmol/L則強(qiáng)烈提示極長鏈?；o酶A脫氫酶缺乏,但其水平高低并不用來判斷疾病的嚴(yán)重程度。有國外研究表明,三庚酸甘油酯及過氧化物酶體增值激活受體的激動劑苯扎貝特在改善生活質(zhì)量方面具有一定意義,有望用于脂肪酸氧化障礙的治療[18]。

本文中僅出現(xiàn)1例有機(jī)酸代謝病,為甲基丙二酸血癥,其致病基因主要為MMUT基因。此例有機(jī)酸血癥全外顯子測序結(jié)果為c.323G>A(p.Arg108His)復(fù)合c.729_730i-nsTT(p.Asp244Leufs*39),均為致病變異,與國內(nèi)學(xué)者王斐等[19]關(guān)于MUT基因突變頻率統(tǒng)計的報道結(jié)果一致。甲基丙二酸血癥患者發(fā)作時最常見的癥狀包括嗜睡、生長遲緩、反復(fù)嘔吐、脫水等。因此,甲基丙二酸血癥的臨床表現(xiàn)多樣,易誤診,應(yīng)盡早進(jìn)行基因測序分型診斷[20]。目前,臨床主要以減少及加速甲基戊二酸的代謝產(chǎn)物生成作為其治療的主要方案。

綜上所述,作者通過分析珠海地區(qū)新生兒IEM的篩查結(jié)果,初步了解新生兒氨基酸代謝病、有機(jī)酸和脂肪酸代謝病的發(fā)病率,并對其致病基因進(jìn)行相關(guān)探討。IEM的早期篩查及診斷可為臨床診斷及治療提供更好的時機(jī),同時,也為本地區(qū)的出生缺陷防治提供有效依據(jù)。