楊娜 宮暢 李楠 張四喜

1吉林大學第一醫(yī)院臨床藥學部，長春 130000；2吉林省鮮龍葵果種植及加工工程研究中心，四平 136500

鮮龍葵果為茄科植物龍葵（Solanum nigrumLinn.）的未成熟果實，具有清熱解毒、消腫散結的作用［1］，已被證實具有抗驚厥［2］、抗腫瘤［3］、抗過敏［4］、保護肝損傷［5］、降糖及腎臟保護作用［6］，相關制劑在臨床上已被用于晚期肝癌［7］、中晚期胃癌［8］、中晚期大腸癌［9］、中晚期非小細胞肺癌［10］、鼻咽癌［11］、乳腺癌［12］等多種癌癥的輔助放化療［13］。龍葵果富含生物堿、多糖［14-16］，其中生物堿含量果實高于全草、鮮果高于干果［17］，目前已分離出具有抗腫瘤活性的澳洲茄堿、澳洲茄邊堿［18-19］。龍葵在我國大部分地區(qū)均有分布，目前以東北地區(qū)產(chǎn)量較大、質(zhì)量較好［20］，吉林省四平市是主要種植基地［21］。市面上所用的鮮龍葵果飲片原藥材除了少量是民間藥農(nóng)自種自用外，其余大部分由吉林省四平市供應。因此，根據(jù)各道地產(chǎn)地、主產(chǎn)區(qū)質(zhì)量、資源可持續(xù)供應等情況，本質(zhì)量標準選擇吉林省四平市為鮮龍葵果配方顆粒的原料產(chǎn)地。

中藥配方顆粒作為傳統(tǒng)湯劑的改良產(chǎn)物，被廣泛應用于各級醫(yī)療機構，具有調(diào)配方便、使用便利、質(zhì)量穩(wěn)定等特點［22-23］。本研究參照《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標準制定技術要求》［24-25］的規(guī)定，以鮮龍葵果藥材為對照，采用薄層色譜法（TLC）［26］鑒別鮮龍葵果配方顆粒的專屬性，基于標準湯劑的一致性，以出膏率、澳洲茄堿和澳洲茄邊堿含量、超高效液相色譜法（UPLC）特征圖譜等為指標，建立鮮龍葵果配方顆粒的質(zhì)量評價方法，為進一步的質(zhì)量控制和標準制定提供數(shù)據(jù)支持和理論基礎。

儀器與試藥

1.試驗儀器

本試驗所用的試驗儀器見表1。

表1 試驗儀器

2.藥材與試劑

2.1.藥材 本試驗所收集的鮮龍葵果藥材用乙醇處理保鮮，由吉林省創(chuàng)岐生態(tài)農(nóng)業(yè)技術開發(fā)有限公司采收，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學楊世海教授鑒定，具體產(chǎn)地及采收時間見表2。鮮龍葵果配方顆粒（20210311、20210315、20210321，吉林創(chuàng)岐生態(tài)農(nóng)業(yè)技術開發(fā)有限公司研制）、鮮龍葵果對照藥材（14240001-201605，廣東省藥品檢驗所）、澳洲茄堿對照品（20180614，廣東省藥品檢定研究院）、澳洲茄邊堿對照品（20180613，廣東省藥品檢定研究院）、麥芽糊精（FH2004003，吉林中糧生化能源銷售有限公司）。

表2 10批檢測合格的鮮龍葵果藥材產(chǎn)地及采收時間表

2.2.試劑 分析純甲醇、乙酸乙酯、乙醇（天津天力化學試劑有限公司），色譜純甲醇、乙腈（德國默克股份有限公司），鹽酸（成都科隆化學品有限公司），三乙胺（美國天地有限公司），十二水磷酸氫二鈉（成都科隆化學品有限公司）。

方法與結果

1.鮮龍葵果標準湯劑和配方顆粒的制備

鮮龍葵果標準湯劑的制備工藝如下：將鮮龍葵果按飲片炮制規(guī)范加工，取炮制后鮮龍葵果1 000 g加20倍量水煎煮，保持沸騰30 min 后濾過，得濾液并濃縮成清膏，冷凍干燥后得到鮮龍葵果標準湯劑凍干粉。根據(jù)10 批鮮龍葵果標準湯劑出膏率、小試工藝研究及中試3 批生產(chǎn)實際出膏率情況，在確保能順利生產(chǎn)的前提下，以加入最小量輔料（麥芽糊精）補足總量至制成顆粒，確定本品的制成量為25.0%，即4 000 g 飲片制成1 000 g 顆粒，規(guī)格為每1 g 配方顆粒相當于飲片4 g，并以此方法制得3 批鮮龍葵果配方顆粒（淺黃棕色至棕色顆粒，氣微，味微苦澀）。

結果顯示，10 批鮮龍葵果標準湯劑出膏率為（18.21±1.87）%，均值±3 倍標準偏差（3SD）、均值的30%～70%的范圍分別為12.61%～23.81%、12.75%～23.67%。為避免因范圍過大無法進行質(zhì)量控制，因此，取12.75%～23.67%為鮮龍葵果配方顆粒的出膏率范圍［27］，3批配方顆粒的出膏率分別為15.90%、21.26%、18.01%，均在該范圍內(nèi)。

2.薄層色譜（TLC）鑒別

取鮮龍葵果配方顆粒（20210311）適量，研細后取約0.5 g。首先，加1%的鹽酸溶液30 ml，超聲下充分溶解30 min 后濾過，并調(diào)節(jié)濾液pH 至9～10。然后，用乙酸乙酯溶液提取2次，每次30 ml，合并提取液并蒸干，得殘渣。最后，加甲醇2 ml 將殘渣溶解，得到供試品溶液。取鮮龍葵果對照藥材約2 g，加100 ml 水煮沸30 min，濾過后將濾液蒸干，同法制得對照藥材溶液。取約0.5 g 麥芽糊精作為陰性樣品，同法制得陰性樣品溶液。分別吸取供試品溶液、對照藥材溶液及陰性樣品溶液各3 μl 點樣，乙酸乙酯∶甲醇∶濃氨試液=6∶3∶1 的條件下展開，取出晾干后噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃下加熱至顯色，365 nm 紫外光下檢視。結果發(fā)現(xiàn)，在相應位置上，鮮龍葵果配方顆粒與對照藥材展開情況相似，顯相同顏色的斑點，陰性樣品無斑點（圖1），說明該方法專屬性良好。

圖1 鮮龍葵果配方顆粒薄層色譜

3.澳洲茄堿、澳洲茄邊堿的含量測定

3.1.色譜條件 Thermo Hypersil GOLD色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫30 ℃，檢測波長203 nm，流動相A 為乙腈，流動相B 為含0.5%三乙胺的0.3%磷酸溶液，以23% A等度洗脫，流速1 ml·min-1，進樣量10 μl。

3.2.對照品溶液制備 精密稱取澳洲茄堿、澳洲茄邊堿各4.0 mg，置于25 ml 容量瓶中，用甲醇稀釋并搖勻，即得混合對照品溶液（每1 ml含澳洲茄堿、澳洲茄邊堿各160 μg）。

3.3.供試品溶液制備 精密稱定研細的鮮龍葵果配方顆粒約0.2 g，置具塞錐形瓶中，加甲醇20 ml，超聲下充分溶解，搖勻后濾過，即得。

3.4.線性關系考察 分別精密稱取約18.9 mg的澳洲茄堿和25.9 mg 的澳洲茄邊堿對照品，置于25 ml容量瓶中，加甲醇制成濃度分別為756.0 mg·L-1和1 036.0 mg·L-1的溶液。分別取0.4 ml、0.8 ml、2.0 ml、2.5 ml、3.5 ml、5.0 ml 置于5 ml容量瓶中加甲醇，制成每1 ml分別含澳洲茄堿60.48 μg、120.96 μg、302.40 μg、378.00 μg、529.20 μg、756.00 μg 和澳洲茄邊堿82.88 μg、165.76 μg、414.40 μg、518.00 μg、725.20 μg、1 036.00 μg 的混合溶液。按“3.1.”項的色譜條件進樣，并以峰面積為縱坐標（Y），濃度為橫坐標（X）繪制二者的標準曲線?；貧w方程分別為：Y=0.0369X+2.606，R2=0.9966（n=6）和Y=0.0596X+4.2019，R2 =0.9958（n=6），分別在60.48～756.00 mg·L-1和82.88～1 036.00 mg·L-1范圍內(nèi)線性關系良好。

3.5.精密度試驗 取“3.3.”項的供試品溶液，按“3.1.”項的色譜條件連續(xù)進樣6 次。澳洲茄堿和澳洲茄邊堿的峰面積相對標準偏差（RSD）值分別為0.21%和0.43%，表明儀器精密度良好。

3.6.穩(wěn)定性試驗 取“3.3.”項的供試品溶液，按“3.1.”項的色譜條件，每隔2 h 進樣1 次，共7 次，至12 h。澳洲茄堿和澳洲茄邊堿的峰面積RSD值分別為0.97%和0.88%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.7. 重復性試驗 取6 份鮮龍葵果配方顆粒（20210311），按照“3.3.”項的方法制成供試品溶液，按“3.1.”項的色譜條件分別進行測定，計算樣品的含量。澳洲茄堿和澳洲茄邊堿的百分含量均值分別為1.92%和2.35%，RSD值分別為1.90%和2.18%，表明本方法重復性良好。

3.8.加樣回收試驗 取鮮龍葵果配方顆粒（20210311）適量，研細后取約0.1 g，精密稱定6 份，分別按照1∶0.8、1∶1.0、1∶1.2 的比例加入澳洲茄堿和澳洲茄邊堿對照品，每個比例平分2 份。按照“3.3.”項的方法制成供試品溶液，按“3.1.”項的色譜條件進行測定，結果見表3，澳洲茄堿和澳洲茄邊堿的加樣回收率均值分別為101.56%和101.78%，RSD值分別為1.66%和1.46%，表明本方法加樣回收率良好，符合測定要求。

表3 鮮龍葵果配方顆粒澳洲茄堿和澳洲茄邊堿加樣回收率

3.9.含量測定

3.9.1.鮮龍葵果標準湯劑中澳洲茄堿和澳洲茄邊堿的含量 按照“3.3.”項的方法制成10 批鮮龍葵果標準湯劑的供試品溶液，按“3.1.”項的色譜條件分別測定澳洲茄堿和澳洲茄邊堿的含量。結果顯示，10 批鮮龍葵果準湯劑中澳洲茄堿含量為（24.54±1.24）mg·g-1，均值的70%～130% 為17.18～31.91 mg·g-1，均值±3SD 為20.83～28.25 mg·g-1；澳洲茄邊堿含量為（31.34±1.65）mg·g-1，均值的70%～130%為21.94～40.74 mg·g-1，均值±3SD 為26.38～36.29 mg·g-1。根據(jù)“1.”項按照25.0%制成量，折算鮮龍葵果配方顆粒中待測成分含量。結果顯示，10 批配方顆粒澳洲茄堿含量為（17.82±1.24）mg·g-1，均值的70%～130%為12.48～23.17 mg·g-1，均值±3SD 為13.53～22.11 mg·g-1；澳洲茄邊堿含量為（22.78±2.19）mg·g-1，均值的70%～130%為15.95～29.62 mg·g-1，均值±3SD 為16.21～29.36 mg·g-1。 見表4、表5。

表4 10批鮮龍葵果標準湯劑澳洲茄堿含量及折算后相應配方顆粒含量

表5 10批鮮龍葵果標準湯劑澳洲茄邊堿含量及折算后相應配方顆粒含量

3.9.2.鮮龍葵果配方顆粒中澳洲茄堿和澳洲茄邊堿的含量 按照“3.3.”項的方法制成3 批鮮龍葵果配方顆粒的供試品溶液，按“3.1.”項的色譜條件分別測定澳洲茄堿和澳洲茄邊堿的含量。結果顯示，3批鮮龍葵果配方顆粒中澳洲茄堿含量分別為19.3 mg·g-1、18.5 mg·g-1、20.4 mg·g-1；澳洲茄邊堿含量分別為23.9 mg·g-1、22.9 mg·g-1、25.8 mg·g-1，均在“3.9.1”項下鮮龍葵果配方顆粒中待測成分含量的均值±3SD 和均值的70%～130%的標準范圍內(nèi)，說明大生產(chǎn)工藝符合要求。

4.鮮龍葵果配方顆粒UPLC特征圖譜的建立

參考標準湯劑特征圖譜的建立方法［28］，本研究建立了鮮龍葵果配方顆粒的特征圖譜，并進行方法學驗證。我們的前期實驗發(fā)現(xiàn)，鮮龍葵果標準湯劑有4 個特征峰，其中峰1 為澳洲茄堿，峰2 為澳洲茄邊堿，以峰1 為參照峰S，峰2、峰3、峰4的相對保留時間分別為1.13、1.70、1.85。

4.1.色譜條件 流動相A 為乙腈，流動相B 為2 mmol/L磷酸氫二鈉（Na2HPO4）溶液。先以39% A 等度洗脫10 min，然后線性梯度洗脫28 min 至60% A，并以60% A 等度洗脫5 min，再線性梯度洗脫5 min 至39% A，最后以39% A 等度洗脫至基線平穩(wěn)。其余條件同“3.1.”。

4.2.參照物與對照品溶液的制備 取鮮龍葵果對照藥材1 g，加水20 ml 后稱定重量，加熱回流60 min 后放冷，再次稱定加水補足至原重量后濾過，取5 ml續(xù)濾液水浴蒸干，殘渣以甲醇轉(zhuǎn)移至5 ml容量瓶超聲處理，定容后，作為參照物溶液。取澳洲茄堿、澳洲茄邊堿對照品適量，制成每1 ml各含160 μg的混合對照品溶液。

4.3.供試品溶液的制備 精密稱定研細的鮮龍葵果配方顆粒約0.2 g，置具塞錐形瓶中，加入甲醇20 ml，超聲下充分混勻后濾過，即得。

4.4.精密度試驗 取“4.3.”項的供試品溶液，按“4.1.”項的色譜條件重復進樣6次，以峰1為參照峰S，各特征峰的相對保留時間與峰面積RSD 均＜3.0%（表6），表明儀器精密度良好。

表6 鮮龍葵果標準湯劑各特征峰相對保留時間和峰面積RSD值（%）

4.5.重復性試驗 精密稱定研細的鮮龍葵果配方顆粒（20210311）約0.2 g，共6 份，按“4.3.”項的方法制備供試品溶液，按“4.1.”項的色譜條件進樣，以峰1 為參照峰S，各特征峰的相對保留時間與峰面積RSD 均＜3.0%（表6），表明該方法重復性良好。

4.6.穩(wěn)定性試驗 取“4.3.”項的供試品溶液，按“4.1.”項的色譜條件，分別在0、2、6、8、12、16、20 h進樣分析，以峰1為參照峰S，各特征峰的相對保留時間與峰面積RSD 均＜3.0%（表6），表明供試品溶液在20 h內(nèi)相對穩(wěn)定。

4.7.樣品測定 按“4.3.”項的方法，將鮮龍葵果對照藥材和3 批鮮龍葵果配方顆粒（20210311、20210315、20210321）制備成供試品溶液，按“4.1.”項的色譜條件進樣，得到鮮龍葵果對照藥材特征圖譜（圖2）和3 批樣品特征圖譜疊加圖（圖3），使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》［29］，將3個批次的UPLC圖譜進行匹配，以峰1為參照峰S，按平均數(shù)法生成鮮龍葵果配方顆粒對照特征圖譜（圖4）。并計算得到3 批鮮龍葵果配方顆粒各特征峰的相對保留時間范圍分別為1.128～1.129、1.700～1.709、1.807～1.846，RSD 值為0.04%、0.30%、1.12%，相對峰面積RSD 值為0.40%、1.23%、3.40%。上述研究結果顯示，3 批鮮龍葵果配方顆粒的特征圖譜具有與標準湯劑和對照藥材相同的4 個特征峰，以澳洲茄堿峰為參照物峰S，各特征峰與S 峰的相對保留時間均落在標準湯劑特征圖譜規(guī)定范圍內(nèi)。表明3 批配方顆粒與標準湯劑質(zhì)量的一致性。參照標準湯劑特征圖譜的研究結果，確定鮮龍葵果配方顆粒特征圖譜標準為：供試品色譜中應呈現(xiàn)4 個與對照藥材色譜圖對應的特征峰；以澳洲茄堿對應的峰為S 峰，峰2、峰3、峰4 的相對保留時間應在規(guī)定值1.13、1.70、1.85的±10%范圍內(nèi)。

圖2 鮮龍葵果對照藥材的特征圖譜

圖3 3批鮮龍葵果配方顆粒的特征圖譜

圖4 鮮龍葵果配方顆粒對照特征圖譜

討論

澳洲茄堿、澳洲茄邊堿為鮮龍葵果的主要活性成分，具有抗腫瘤、增強免疫功能、抗炎等作用［30-32］，與鮮龍葵果的臨床功效清熱解毒、消腫散結、消炎利尿、生津止渴一致［33］。

本研究以鮮龍葵果標準湯劑作為參照物，衡量鮮龍葵果配方顆粒與傳統(tǒng)湯劑的一致性。首先通過10 批鮮龍葵果樣品確定了鮮龍葵果標準湯劑的三大指標：出膏率、澳洲茄堿和澳洲茄邊堿含量以及特征圖譜標準；并以標準湯劑質(zhì)量指標為基準，指導鮮龍葵果配方顆粒生產(chǎn)工藝過程質(zhì)量控制，建立了與鮮龍葵果標準湯劑質(zhì)量指標一致的配方顆粒的質(zhì)量標準。根據(jù)鮮龍葵果標準湯劑的出膏率確定了配方顆粒的制成量；采用TLC 法對鮮龍葵果配方顆粒進行專屬性鑒別；采用UPLC 測定鮮龍葵果標準顆粒中澳洲茄堿、澳洲茄邊堿的含量，建立鮮龍葵果標準顆粒的特征圖譜，確定了4 個特征峰及其相對保留時間的規(guī)定范圍。此外，除進行定性定量分析外，經(jīng)方法學考察，檢測方法均符合要求，檢測數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠。3批配方顆粒各項關鍵指標均在規(guī)定的質(zhì)量范圍內(nèi)，即3 批配方顆粒傳遞過程與標準湯劑均一致。說明鮮龍葵果配方顆粒與鮮龍葵果標準湯劑物質(zhì)基礎一致。

本次研究所建立的質(zhì)量標準，能定性、定量地評價鮮龍葵果配方顆粒的質(zhì)量，為臨床配方提供了符合傳統(tǒng)湯劑劑量合理、準確，工藝規(guī)范、統(tǒng)一，質(zhì)量安全、優(yōu)良且穩(wěn)定的鮮龍葵果配方顆粒。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明楊娜：醞釀和設計試驗，實施研究，分析/解釋數(shù)據(jù)，起草文章，對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱，統(tǒng)計分析；宮暢：采集數(shù)據(jù)，統(tǒng)計分析，支持性貢獻；李楠：分析/解釋數(shù)據(jù)，統(tǒng)計分析，行政、技術或材料支持；張四喜：醞釀和設計試驗，實施研究，對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱，獲取研究經(jīng)費，行政、技術或材料支持，指導