李 鑫，徐文濤，吉雅圖，段麗萍，趙 貝，楊 丹，董科學(xué)，狄棟棟，范偉興

（1.烏拉特后旗動物疫病預(yù)防控制中心，巴彥淖爾 015000；2.烏拉特中旗溫更鎮(zhèn)綜合保障和技術(shù)推廣中心，巴彥淖爾 015000；3.天康生物制藥有限公司，蘇州 215000；4.金宇生物技術(shù)股份有限公司，呼和浩特 010000；5.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，青島 266000）

布魯菌?。˙rucellosis）是由布魯菌引起的人、畜共患傳染病。在家畜中，牛、羊、豬最易發(fā)生，且可由牛、羊、豬傳染給人和其他動物。其特征是生殖器官和胎膜發(fā)炎，引起流產(chǎn)、不育和各種組織的局部病灶[1]。其中羊種布魯菌的毒力最強，對人具有高度的致病性。人感染后常表現(xiàn)為持續(xù)性感染、間歇性發(fā)熱，稱作“波狀熱”，多汗、關(guān)節(jié)痛、神經(jīng)痛及肝臟、脾臟腫大等癥狀，重者喪失勞動力[2]，甚至威脅生命[3]。據(jù)報道，目前有170多個國家和地區(qū)有該病的發(fā)生和流行，其中123個國家和地區(qū)存在該病的感染。布病是一種廣泛流行于世界各地的人畜共患慢性傳染病[4]，世界動物衛(wèi)生組織（World Organization for Animal Health, WOAH）將該病定為必須報告的B類傳染病，我國將其列為二類動物疫病[4-5]。該病一旦發(fā)生會造成巨大經(jīng)濟損失[6]。

目前，布魯菌病在全球呈現(xiàn)上升態(tài)勢，每年約有50萬人感染布病，嚴(yán)重危害人類健康[7]。一方面未消滅布魯菌病的國家和地區(qū)沒有得到有效控制，仍在繼續(xù)流行；另一方面已控制和消滅布魯菌病的國家和地區(qū)，也出現(xiàn)了疫情反彈。在我國，布魯菌病正處于歷史高發(fā)期。究其原因，一是動物的流動性增大，檢疫不到位，交易過程中不申報不檢疫現(xiàn)象普遍存在；二是屠宰檢疫手段落后，導(dǎo)致部分隱性感染的病畜進(jìn)入流通環(huán)節(jié)，引發(fā)新的感染；三是基層獸醫(yī)隊伍不健全，新的檢測與防控技術(shù)不能及時應(yīng)用和推廣。

近年來，烏拉特后旗在畜間布魯菌病防控方面采取免疫、監(jiān)測、消毒、撲殺等綜合性防控措施，已達(dá)到了自治區(qū)控制區(qū)標(biāo)準(zhǔn)。但由于烏拉特草原北鄰蒙古國，再加之國內(nèi)目前動物流通環(huán)節(jié)的檢疫不能及時到位，直接導(dǎo)致境內(nèi)外傳入疫情的風(fēng)險仍然較大。因此，盡快建成烏拉特草原牛羊免疫無布魯菌病區(qū)，保障人畜安全和邊疆繁榮穩(wěn)定，意義重大。

1 材料與方法

1.1 疫苗 布魯氏菌病活疫苗（Rev.1株），批號：20220306，布魯氏菌病活疫苗（S2株），批號：22930501，布魯氏菌基因缺失活疫苗（M5-90Δ26株），批號：22950502，均購自金宇保靈生物藥品有限公司，布魯氏菌病活疫苗（A19株），批號：2022002，布魯氏菌病活疫苗（M5株），批號：2021010，布魯菌病活疫苗（A19-ΔVirB12株），批號：2022001，均購自天康生物制藥有限公司。

1.2 血清與菌株 布魯菌試管凝集抗原、琥紅平板凝集抗原及標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性血清購自禾旭生物技術(shù)有限公司（批號：20220817）；無菌從受試羊頸靜脈采血作為待檢血清，分離血清，-20℃保存?zhèn)溆?；?.5%碳酸的（10%氯化鈉溶液）作為血清稀釋液，本實驗室配制，高壓滅菌后，4℃下保存?zhèn)溆?。羊種強毒株M28，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.3 實驗動物 從烏拉特后旗6個蘇木/鎮(zhèn)（獲各琦蘇木、巴音前達(dá)門蘇木、烏蓋蘇木、潮格溫都爾鎮(zhèn)、呼和溫都爾鎮(zhèn)、巴音寶力格鎮(zhèn)），隨機選擇80～100日齡健康的烏拉特土種綿羊羔和二狼山白絨山羊羔，共計660只（其中綿羊羔385只，山羊羔275只），在免疫前，常規(guī)采血，分離血清，經(jīng)琥紅平板凝集試驗（rose bengal plate test, RBPT）和試管凝集試驗（serum tube agglutination test, SAT）檢測均為陰性。此外，試驗羊除接種本次試驗所用的6種布病疫苗外，不接種其他任何疫苗。

1.4 免疫試驗 隨機分為7個組，每組60～120只。其中：第1組M5組，綿羊60只，山羊60只，每只羊皮下注射1.0×1010CFU，試驗地點巴音寶力格鎮(zhèn)浩日格嘎查；第2組ReV.1組，綿羊60只，山羊60只，每只羊點眼1.0×1010CFU，地點呼和溫都爾鎮(zhèn)西補隆嘎查；第3組M5-90Δ26組，綿羊55只，山羊65只，每只羊皮下注射1.0×109CFU，地點潮格溫都爾鎮(zhèn)西日淖爾嘎查；第4組A19ΔVirB12組，綿羊60只，點眼30只，每只羊點眼1.0×1010CFU，皮下注射30只，每只3.0×1010CFU，地點巴音前達(dá)門蘇木巴音高勒嘎查；第5組S2組，綿羊60只，山羊60只，每只灌服1.0×1010CFU，地點獲各琦蘇木前達(dá)門嘎查；第6組A19組，綿羊60只，點眼30只，每只羊點眼1.0×1010CFU，皮下注射30只，每只3.0×1010CFU，地點烏蓋蘇木和豐村；第7組為對照組，綿羊30只，山羊30只，地點巴音寶力格鎮(zhèn)五支渠村。以上疫苗免疫劑量全部根據(jù)疫苗使用說明書所規(guī)定的劑量進(jìn)行免疫。

1.5 實驗室檢測

1.5.1 琥紅平板凝集試驗（rose bengal plate test,RBPT） 用定量移液器將琥紅平板抗原分別滴入64格玻璃板各30 μL，然后按編號順序滴入待檢血清30 μL，充分混合均勻，最后加入標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清作為對照。置室溫下4 min，判定結(jié)果。

1.5.2 試管凝集試驗（serum tube agglutination test,SAT）用血清學(xué)反應(yīng)管將被檢血清按照1∶12.5、1∶25、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800稀釋，按照抗原使用說明稀釋抗原，依次加入已經(jīng)稀釋的血清反應(yīng)管中，稀釋滴度變?yōu)?∶25、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600，同時設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)陽性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清和比濁管對照，置37℃溫箱孵育18～24 h，判定結(jié)果。

1.6 免疫后攻毒試驗 免疫后攻毒試驗所采用的方法和攻毒劑量是根據(jù)《獸用生物制品規(guī)程》。分別在天康生物制藥有限公司和金宇生物制品有限公司研發(fā)中心完成。用于攻毒試驗的羊，均隨機選取6種疫苗免疫后的羊群。

1.6.1 布氏菌病活疫苗A19株、A19-ΔVirB12株、Rev.1株攻毒試驗 依據(jù)《獸用生物制品規(guī)程》[8]，通過田間實驗樣效力檢驗，分析3種疫苗免疫效果。隨機從巴音鎮(zhèn)、烏蓋蘇木、巴音前達(dá)門受試羊群中選取免疫后270 d山羊6只、綿羊30只、未免疫綿羊6只，分為6個試驗組，1個對照組，每組6只。用羊種強毒菌株M28培養(yǎng)菌液稀釋至0.5億CFU/0.1 mL，試驗組和對照組左右眼各滴入50 μL菌液，感染后用酒精棉球擦拭眼睛周圍。感染后30～35 d，剖檢試驗組和對照組全部羊只，分別取頜下淋巴、肩前淋巴、腹股溝淋巴、脾臟，在生物安全柜中，剪取病料組織0.5 g，用PBS沖洗3～5遍，放入2 mL無菌EP管中，再加入2顆鋼珠及1 mL液體培養(yǎng)基，用組織研磨機50Hz、300 s研磨。取研磨液100 μL，均勻的涂布于布魯菌選擇培養(yǎng)基上，置含5% CO2、37℃恒溫培養(yǎng)中，培養(yǎng)5～7 d，觀察有無布魯菌疑似菌生長。提取疑似菌單菌落，加入50 μL滅菌蒸餾水，65℃滅活3 h后為模板，分別用M-PCR、B4B5-PCR進(jìn)行鑒定。目的條帶分別為731 bp和223 bp。擴增采用25 μL體系，擴增參數(shù)為：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性60 s，58℃退火60 s，72℃延伸60 s，35個循環(huán)；72℃終末延伸10 min。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測并記錄結(jié)果。

1.6.2 布魯氏菌病活疫苗Rev.1株、S2株、M5-90Δ26株、攻毒試驗 依據(jù)《獸用生物制品規(guī)程》，通過田間試驗效力檢驗，分析3種疫苗免疫效果。隨機選取免疫后270 d的山羊15只，綿羊10只，未免疫山羊5只，分為5個試驗組和1個對照組。用羊種強毒菌株M28培養(yǎng)菌液稀釋至0.5億CFU/0.1 mL，試驗組和對照組左右眼各滴入50 μL菌液，感染后用酒精棉球擦拭眼睛周圍。感染后30～35 d，剖檢試驗組和對照組全部羊只，分別取頜下淋巴、肩前淋巴、腹股溝淋巴、脾臟，在生物安全柜中，剪取病料組織0.4～0.5 g，用PBS沖洗3～5遍，放入2 mL無菌EP管中，再加入2顆鋼珠及1 mL液體培養(yǎng)基，用組織研磨機50 Hz、300 s研磨。取研磨液100 μL，均勻的涂布于布魯菌選擇培養(yǎng)基上，置5% CO2、37℃恒溫培養(yǎng)5～7 d，觀察有無布魯菌疑似菌生長。挑取疑似菌單菌落，加入50 μL滅菌蒸餾水，65℃滅活3 h后為模板，分別用M-PCR、B4B5-PCR進(jìn)行鑒定。目的條帶約為731 bp和223 bp。擴增采用25 μL體系，擴增參數(shù)為：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性60 s，58℃退火60 s，72℃延伸60 s，35個循環(huán)；終末延伸72℃10 min。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳檢測并記錄。

1.7 6種疫苗對山羊與綿羊生長發(fā)育的影響 通過對6個試驗組與對照組在接種疫苗前、后稱重及體格檢查，觀察疫苗對羊體生長發(fā)育是否有影響。采用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。P＞0.05，差異不顯著，不具有統(tǒng)計學(xué)意義；P＜0.05表示差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義；P＜0.01表示差異極顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對照組檢測結(jié)果 對照組的30只綿羊和30只山羊分別在7～270 d 11個時間段靜脈采血，分離血清，用RBPT和SAT檢測，均未檢測到相應(yīng)抗體。

2.2 試驗組山羊轉(zhuǎn)陽檢測結(jié)果 各試驗組山羊在接種疫苗之前用RBPT和SAT檢測，均為陰性，接種疫苗后7 d開始出現(xiàn)陽性。其中M5組RBPT和SAT檢測，陽性率一致，達(dá)到78%；M5-90Δ26組 RBPT檢測，陽性率達(dá)到81%，SAT檢測陽性率為75%；S2組RBPT檢測陽性率52%，SAT檢測陽性率為32%。接種后21d，達(dá)到峰值，其中M5組RBPT檢測，陽性率82%，SAT檢測陽性率為80%；Rev.1組RBPT和SAT檢測陽性率相一致，高達(dá)98%；M5-90Δ26組與S2組經(jīng)RBPT和SAT 檢測，兩組陽性率相一致，高達(dá)100%（表1）。

表1 試驗組山羊轉(zhuǎn)陽率Table 1 The positive conversion rate of goats in the experimental group

2.3 試驗組綿羊轉(zhuǎn)陽檢測結(jié)果 各試驗組山羊在接種疫苗之前用RBPT和SAT檢測，均為陰性，接種疫苗后7 d開始出現(xiàn)陽性。其中M5組RBPT和SAT檢測，陽性率一致，達(dá)到82%；M5-90Δ26組RBPT檢測，陽性率達(dá)到81%，SAT檢測陽性率為75%；S2組RBPT檢測，陽性率52%，SAT檢測陽性率為32%。接種后21 d，達(dá)到峰值，其中M5組RBPT檢測，陽性率82%，SAT檢測陽性率為80%；Rev.1組RBPT和SAT檢測陽性率相一致，高達(dá)98%；M5-90Δ26組與S2組經(jīng)RBPT和SAT檢測，兩組陽性率相一致，高達(dá)100%（表2）。由表1、表2可看出，接種后第7 d，6個試驗組山羊轉(zhuǎn)陽率最高的是M5-90Δ26組，達(dá)到81%；綿羊轉(zhuǎn)陽率最高是A19組，達(dá)到100%；第二是M5組，達(dá)到82%，最低的是Rev.1組，山羊未轉(zhuǎn)陽，綿羊轉(zhuǎn)陽率僅為1.66%。接種第21 d，所有疫苗轉(zhuǎn)陽率達(dá)到高峰，其中M5-90Δ26組山羊100%，綿羊98%；S2組山羊100%，綿羊85.18%；A19綿羊達(dá)到97%；Rev.1山羊98%，綿羊75%；接種第60 d，轉(zhuǎn)陽率逐漸下降；第150 d，所有疫苗組轉(zhuǎn)陽率均下降到50%以下；第180 d，S2組山羊下降到35.6%，綿羊下降到3.7%，M5組山羊下降到18.2%，綿羊下降到33%，其余均下降到20%以下；到240 d，S2山羊的轉(zhuǎn)陽率由180 d的35.6%回升至50.84%，到270 d，回升至76.4%，即出現(xiàn)翹尾現(xiàn)象；M5-90Δ26、A19-ΔVirB12組也有小幅度的翹尾現(xiàn)象。

表2 試驗組綿羊轉(zhuǎn)陽率Table 2 The positive conversion rate of sheep in the experimental group

2.4 抗體效價檢測結(jié)果 接種疫苗后14 d，效價達(dá)到峰值，其中抗體效價最高組為M5-90Δ26，山羊達(dá)到1∶494，綿羊達(dá)到1∶315，其次是S2組，山羊達(dá)到1∶447，綿羊達(dá)到1∶185，M5組山羊達(dá)到1∶406，綿羊達(dá)到1∶266；較低是Rev.1組，山羊為1∶164，綿羊為1∶155；接種疫苗后21 d，僅有S2組，山羊上升到1∶473，其余各試驗組山羊和綿羊均漸進(jìn)性下降；接種疫苗后120 d，僅有M5組的綿羊凝集價在1∶50以上，為1∶77.3，M5-90Δ26組的山羊為1∶56，S2組的綿羊為1∶50（表3）。

表3 抗體效價檢測結(jié)果Table 3 The results of antibody titer test

2.5 免疫攻毒試驗結(jié)果

2.5.1 布氏菌病活疫苗A19株、A19-ΔVirB12株、Rev.1株攻毒試驗結(jié)果 判定標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)《獸用生物制品規(guī)程》中的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。A19組點眼免疫綿羊和Rev.1組點眼免疫山羊效力較好，保護(hù)比例均達(dá)到4/6：最差的是M5組皮下免疫山羊，保護(hù)比例為0/6（表4）。

表4 布氏菌病活疫苗M5 株、A19 株、A19ΔVirB-12 株免疫攻毒實驗Table 4 Post-immunization challenge test of Brucellosis vaccine, Live (Strain M5, A19, A19ΔVirB-12)

2.5.2 布魯氏菌病活疫苗Rev.1株、S2株、M5-90Δ26株、攻毒試驗結(jié)果 判定標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)《獸用生物制品規(guī)程》中的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行。M5-90Δ26組皮下免疫綿羊和Rev.1組點眼免疫山羊效力較好，保護(hù)比例均達(dá)到4/5；最差的是S2組灌服免疫綿羊，保護(hù)比例僅為1/5，詳見表5。

表5 布魯氏菌病活疫苗S2 株、M5-90Δ26 株、Rev.1 株免疫攻毒實驗Table 5 Post-immunization challenge testof Brucellosis vaccine, Live (Strain S2, M5-90Δ26, Rev.1)

2.6 生長發(fā)育檢查結(jié)果 通過對試驗羊體格檢查和稱重，使用單因素方差分析和多重比較法進(jìn)行差異顯著性檢驗，其中M5皮下接種山羊和綿羊，與對照組相比較，P＜0.05，差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義；A19皮下接種綿羊,與對照組相比較，P＜0.05，差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義；A19點眼免疫綿羊，與對照組相比較，P＞0.05，差異不顯著，不具有統(tǒng)計學(xué)意義（表6）。

表6 試驗羊生長發(fā)育體重監(jiān)測結(jié)果Table 6 The results of growth and weight monitoring of sheep and goats in the experimental group

3 討論

布魯菌是革蘭氏陰性菌兼細(xì)胞內(nèi)寄生的細(xì)菌，具有獨特的細(xì)胞生存和免疫機制，是一種自然疫源性疾病。根據(jù)免疫學(xué)理論，布魯菌自然感染或人工免疫后，在動物體內(nèi)首先產(chǎn)生免疫球蛋白IgM抗體，隨后產(chǎn)生的免疫球蛋白IgG抗體，并且逐步升高，達(dá)到較高的水平并維持整個感染的過程。研究證實，RBPT主要檢測IgG類抗體，具有較高的敏感性，適用于大規(guī)模普查。SAT是以檢測免疫球蛋白IgM類抗體為主，對免疫球蛋白IgG類抗體幾乎不敏感，因此可以作為早期診斷[9]。羊在感染布魯菌后,會刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，激發(fā)體液免疫和細(xì)胞免疫。體液免疫是機體適應(yīng)性免疫應(yīng)答中的重要組成部分，在防御外來病原入侵發(fā)揮重要作用，而細(xì)胞免疫對于胞內(nèi)寄生菌的清除起著主要作用[10]。疫苗接種后通過特異性抗體檢測評價免疫效果是常用的方法。然而布魯菌病的免疫保護(hù)主要體現(xiàn)在細(xì)胞免疫水平。體液免疫水平的檢測只是對疫苗是否免疫成功的一個驗證，因此抗體水平高低與動物機體保護(hù)力不呈正相關(guān)[11]。

血清學(xué)檢測結(jié)果分析表明，M5-90Δ26和S2兩種疫苗免疫山羊與綿羊后，無論是轉(zhuǎn)陽率還是抗體效價均高于其余4種疫苗，其可刺激機體更早產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)，表現(xiàn)出良好的免疫原性；而且S2免疫山羊80 d后，抗體下降到35.6%，到270 d，回升至76.4%，即出現(xiàn)翹尾現(xiàn)象。這種現(xiàn)象可能是S2免疫山羊后出現(xiàn)的二次轉(zhuǎn)陽，檢測時應(yīng)加以區(qū)別。Rev.1免疫后120 d，血清學(xué)反應(yīng)未檢測到抗體。因而有利于對感染抗體的檢出，即對羊群中感染布魯菌病的篩查。

免疫攻毒試驗結(jié)果顯示，A19用于綿羊點眼免疫和A19ΔVirB12用于綿羊皮下注射免疫，二者的保護(hù)比例都達(dá)到了4/6；M5-90Δ26用于綿羊皮下注射免疫、Rev.1用于山羊點眼免疫，二者的保護(hù)比例均達(dá)到了4/5。

通過對6種疫苗免疫效力的比較，A19綿羊點眼免疫、A19ΔVirB12綿羊皮下注射免疫、M5-90Δ26綿羊皮下注射免疫、Rev.1山羊點眼免疫均適用于草原放牧羊的免疫。

在布魯菌病防控工作中，選擇具有良好免疫原性的疫苗接種易感動物，并且結(jié)合疫苗接種動物后的抗體消長規(guī)律，制定合理的免疫程序，對控制布魯菌病的流行至關(guān)重要。