柳方遠(yuǎn)，李雙星，印春生，吉 婧,3，朱明哲,3，劉業(yè)兵

（1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京10081；2.張家港市畜牧獸醫(yī)站，張家港 215600；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，青島 266109）

剛地弓形蟲（Toxoplasmagondii）是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲，對人、動物健康帶來嚴(yán)重影響。全球約三分之一的人感染弓形蟲，我國弓形蟲陽性率約為8%[1]。健康人群感染弓形蟲通常不會造成明顯的臨床癥狀，免疫缺陷者感染會造成嚴(yán)重的后果，甚至死亡，孕婦感染弓形蟲會垂直傳播給下一代，甚至?xí)斐商毫鳟a(chǎn)、死胎[2-3]。弓形蟲也廣泛感染動物，其中豬的感染率為25.8%，山羊的感染率為3.9%～19.2%，牛的感染率為0.2%～43%，雞的感染率為15%～20%，犬的感染率為3.69%～43%，貓的感染率可高達(dá)70%[4-5]。對畜牧業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失，犬貓等寵物感染還會給人類公共健康造成隱患。

犬感染弓形蟲病通常是由于吞食了含有弓形蟲滋養(yǎng)體及包囊的肉、內(nèi)臟、排泄物等，此時犬體內(nèi)會產(chǎn)生子孢子或滋養(yǎng)體，最終形成包囊并在機體組織中長時間停留，成為弓形蟲傳播的中間宿主[6]。大多數(shù)健康的成年犬感染弓形蟲后為隱性感染，少部分犬癥狀類似犬瘟熱和犬傳染性肝炎，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、精神萎靡、虛弱、呼吸困難，甚至出現(xiàn)劇烈的出血性腹瀉，嚴(yán)重會致死[7]。如果犬感染弓形蟲沒有被及時發(fā)現(xiàn)，會對人和動物造成嚴(yán)重的健康威脅。ChineseⅠ蟲株是我國人和動物感染的主要基因型，關(guān)于該蟲株的致病機理和入侵規(guī)律尚不清楚，我國關(guān)于犬弓形蟲感染的相關(guān)研究較少，且尚未發(fā)現(xiàn)以犬為模型探索弓形蟲速殖子在其體內(nèi)的分布規(guī)律的研究報道。因此，高效檢測犬的弓形蟲感染、摸清弓形蟲在犬體內(nèi)的組織分布對預(yù)防和控制弓形蟲的傳播具有重要意義。本研究旨在建立一種適合犬弓形蟲感染的組織檢測方法，以期為犬弓形蟲病的致病機理和病理學(xué)診斷提供試驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞、蟲株及試驗動物 弓形蟲ChineseⅠ蟲株、Vero細(xì)胞均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供；牛巴貝斯蟲、環(huán)形泰勒蟲、犬新孢子蟲基因組由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所饋贈；比格犬在華派生物工程集團有限公司動物房飼養(yǎng)試驗。

1.2 主要儀器與試劑 Percol l純化液購自索萊寶公司；血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒購自TIANGEN公司；ExTaq聚合酶、DNA Marker購自TaKaRa公司；DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；超微量分光光度計購自德國Colibri公司；高速離心機購自美國Sigma公司；凝膠成像系統(tǒng)購自美國BIORAD公司；梯度PCR儀購自德國耶拿公司；核酸電泳儀購自北京六一儀器廠。

1.3 弓形蟲DNA的制備 使用含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)Vero細(xì)胞，置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1～2 d換一次液。待Vero細(xì)胞長滿70%～80%細(xì)胞瓶時，更換2%胎牛血清細(xì)胞維持培養(yǎng)基待用。復(fù)蘇凍存的弓形蟲ChineseⅠ株，接種入Vero細(xì)胞中培養(yǎng)。培養(yǎng)1周左右，待細(xì)胞基本脫落且蟲體大量溢出時，收集弓形蟲速殖子，并使用Percol l試劑純化。將純化后的弓形蟲速殖子按血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行基因提取，經(jīng)核酸蛋白測定儀測定濃度后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 組織樣品的準(zhǔn)備 弓形蟲感染比格犬：選擇日齡一致，體格相似的SPF比格犬6只，試驗犬編號為2117、2118、2119、2120、2076，2123。將2×104個/mL弓形蟲速殖子耳緣靜脈注射比格犬5只，每只注射0.5 mL，設(shè)置1只空白對照犬，攻蟲42 d后解剖。犬的解剖和組織采樣：將攻蟲犬和空白對照犬心臟采血后處死，使用解剖器具將犬進(jìn)行解剖，取腦、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腹膜肌、舌肌、淋巴結(jié)、睪丸。分別從組織四周及中央剪取5個點的病料組織塊，每點組織塊約1 cm×1 cm×1 cm大小。犬生殖器（睪丸或子宮）取整體的1/3，犬頸下淋巴結(jié)取全部。將每種組織病料置于研磨缽中剪碎，混合均勻，加入液氮輔助研磨成粉狀，裝入自封袋，做好標(biāo)記，使用試劑盒提取DNA。

1.5 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank（登錄號：DQ779191.1）發(fā)表的弓形蟲529 bp重復(fù)序列，通過Primer Premier 5.0軟件設(shè)計巢式PCR引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 529 bp 重復(fù)序列基因引物設(shè)計Table 1 Primers specif ic for 529 bp repetitive sequence gene

1.6 PCR擴增 第1輪PCR反應(yīng)體系：2×ExTaq酶10 μL，Toxo-outF/R各1 μL，弓形蟲DNA模板5 μL，ddH2O 3 μL。反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性5 min；共95℃變性1 min，64℃退火1 min，72℃延伸2 min，35個循環(huán)；72℃再延伸10 min。第2輪PCR反應(yīng)體系：2×ExTaq酶10 μL，Toxo-innerF/R各1 μL，第1輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物5 μL，ddH2O 3 μL。反應(yīng)條件：98℃預(yù)變性5 min；95℃變性1 min，66℃退火1 min，72℃延伸2 min，共30個循環(huán)；72℃再延伸10 min。

1.7 特異性試驗 用建立的巢式PCR方法檢測弓形蟲、牛巴貝斯蟲、環(huán)形泰勒蟲、犬新孢子蟲基因組，使用ddH2O作陰性對照，檢測巢式PCR方法特異性，瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.8 靈敏度檢測 使用超微量分光光度計測出弓形蟲DNA的濃度，然后使用ddH2O將其連續(xù)10倍比稀釋，以此作為模板，使用國標(biāo)PCR方法（GB/T 18448.2，2008）和所建立的巢式PCR方法進(jìn)行檢測比較。統(tǒng)計可檢測出的弓形蟲DNA的最低濃度。國標(biāo)PCR方法引物序列見表2，反應(yīng)體系為：2×ExTaq酶25 μL，引物各1 μL，樣品2 μL，ddH2O 21 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸2 min，共30個循環(huán)；72℃再延伸8 min。

表2 國標(biāo)PCR 引物序列Table 2 National standard PCR primer sequence

1.9 重復(fù)性試驗 將弓形蟲DNA作為模板，按照1.5 PCR擴增的條件和方法做3組重復(fù)試驗，驗證該方法的重復(fù)性。

1.10 臨床檢測 將研磨后的組織按照血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行操作。將提取的60份犬的組織DNA樣品稀釋成同濃度，作為模板，用建立的巢式PCR方法進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 特異性試驗 利用本研究所建立的巢式PCR方法對牛巴貝斯蟲、環(huán)形泰勒蟲、犬新孢子蟲基因組和空白對照組進(jìn)行擴增，無條帶出現(xiàn)，而對弓形蟲陽性對照組的擴增在529 bp處有明顯的條帶，與目的片段的大小一致（圖1），說明該方法的特異性高。

圖1 特異性試驗結(jié)果Fig.1 The result of specif icity test

2.2 靈敏度檢測 將10倍系列稀釋的基因組作為模板，分別采用建立的巢式PCR方法和國標(biāo)PCR方法進(jìn)行檢測。巢式PCR方法對弓形蟲529 bp重復(fù)序列的最低檢測量是0.134 pg，國標(biāo)PCR方法最低檢測濃度為13.4 pg，說明建立的PCR方法檢測靈敏度較高，比國標(biāo)PCR高100倍（圖2，圖3）。

圖2 國標(biāo)PCR 靈敏度檢測結(jié)果Fig.2 Result of national standard PCR

圖3 巢式PCR 靈敏度檢測結(jié)果Fig.3 Result of Nested PCR

2.3 重復(fù)性試驗 使用巢式PCR做3組重復(fù)試驗，加入模板的泳道均能擴增出529 bp的條帶，且條帶清晰，易于觀察。說明建立的巢式PCR方法重復(fù)性較好（圖4）。

圖4 重復(fù)性試驗結(jié)果Fig.4 Result of repeatability test

2.4 臨床檢測結(jié)果 使用巢式PCR檢測方法檢測感染犬組織DNA樣品，在攻蟲犬2117的腦組織樣品，攻蟲犬2118的舌肌、脾臟，攻蟲犬2119的腎臟，攻蟲犬2120的心臟、睪丸，攻蟲犬2076的心臟、腹膜肌檢測出弓形蟲529 bp基因，陰性對照犬2123無條帶出現(xiàn)，未檢測出弓形蟲感染（圖5）。

圖5 臨床樣品檢測結(jié)果Fig.5 Result of samples test

3 討論

用于弓形蟲的檢測方法主要包括病原學(xué)檢測、免疫學(xué)檢測及分子生物學(xué)檢測等。病原學(xué)檢測應(yīng)用較少，免疫學(xué)檢測適用于弓形蟲的血清學(xué)檢測，靈敏度和特異性較高，應(yīng)用廣泛；分子生物學(xué)檢測主要有核酸探針、PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)等，被廣泛應(yīng)用于病原體檢測[8-9]。PCR技術(shù)在弓形蟲檢測中可以在較短的時間內(nèi)對弓形蟲基因組特定的片段進(jìn)行擴增，檢測速度快、靈敏度高、結(jié)果可靠[10]。

目前弓形蟲PCR檢測方法應(yīng)用較廣，常用的靶基因有B1、P30、529 bp重復(fù)序列等[11]，相對于其他基因，529 bp重復(fù)序列具備更高的拷貝數(shù)。本研究以重復(fù)序列529 bp基因為靶基因，建立了犬弓形蟲巢式PCR檢測方法[12]。結(jié)果顯示，最低檢出弓形蟲DNA濃度為0.134 pg，比國標(biāo)普通PCR檢測方法的靈敏度高100倍，因此本方法靈敏度較高。利用巢式PCR方法對其他常見寄生蟲的基因進(jìn)行擴增，結(jié)果無條帶，說明該方法特異性強。重復(fù)性試驗做了3次，表明該方法穩(wěn)定。對感染弓形蟲的犬組織DNA樣品檢測后發(fā)現(xiàn)，能夠在心臟、大腦、舌肌、脾臟、腎臟、睪丸、腹膜肌中檢測出弓形蟲DNA。以上數(shù)據(jù)表明本方法可用于臨床疑似弓形蟲感染樣品的檢測，為后續(xù)弓形蟲在宿主體內(nèi)的動態(tài)分布研究奠定技術(shù)方法。

隨著寵物犬?dāng)?shù)量不斷增多，研究發(fā)現(xiàn)犬感染弓形蟲的比例不斷增長，犬弓形蟲病對人和動物造成的健康威脅日益增大。弓形蟲進(jìn)入宿主體內(nèi)粘附、侵入和增殖的過程十分復(fù)雜，其在不同動物不同組織中的分布規(guī)律存在差異，目前對于中國流行株弓形蟲ChineseⅠ的致病性及組織分布研究較少。因此，探討弓形蟲對犬組織嗜性研究，建立快速有效的檢測方法將有助于對弓形蟲感染機制的理解，為弓形蟲的檢測與診斷提供新的思路。