陳世鈺，蔣亞君，鑫 婷，崔 帥，王 洋，郭曉宇，賈 紅，朱鴻飛

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193）

非洲豬瘟（african swine fever, ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）引起的豬的急性、熱性、高度接觸性傳染病，可感染不同年齡段、不同品種的豬，其中家豬最易感[1-2]。1921年在非洲肯尼亞發(fā)現(xiàn)該病疫情，之后傳播至歐洲、拉丁美洲和亞洲等60多個國家[3-4]。2018年8月3號，我國首次報道在沈陽沈北新區(qū)發(fā)生非洲豬瘟疫情，疫點(diǎn)內(nèi)913頭生豬被撲殺和無害化處理[5-6]。

非洲豬瘟病毒屬于非洲豬瘟病毒科、非洲豬瘟病毒屬成員[7]，為類似二十面體對稱結(jié)構(gòu)，有包囊。該病毒是目前唯一的DNA蟲媒病毒[8]。不同毒株的病毒基因組大小有些許差異，長度為170～193 kb，含有150多個開放閱讀框，共編碼200多種蛋白質(zhì)[9-10]。ASFV MGF360-13L屬于多基因家族的一員，基因全長為1061 bp，編碼353個氨基酸[11]。MGF360、530/505能夠抑制Ⅰ型干擾素表達(dá)，同時抑制干擾素的抗病毒效應(yīng)，并通過延長感染細(xì)胞的存活時間來提高病毒在宿主細(xì)胞中的增殖效率和數(shù)量[12-14]。此前，軍獸研以我國流行毒株（SY-18）為親本通過同源重組構(gòu)建MGF和CD2V雙缺疫苗候選株，結(jié)果顯示，該候選株具有良好的攻毒保護(hù)效果[15]。由此可見，MGF基因可能在未來基因缺失苗研發(fā)中作為重要靶點(diǎn)。

因此，本研究合成了ASFV MGF360-13L基因，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后獲得重組蛋白并制備多克隆抗體，以期為闡述13L蛋白質(zhì)生物學(xué)功能和非洲豬瘟新型疫苗研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒及實(shí)驗(yàn)動物 pET-32a質(zhì)粒由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所獸醫(yī)公共衛(wèi)生安全與管理團(tuán)隊(duì)保存；大腸桿菌DH5α和BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；SPF級6～8周齡BALB/c雌鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司；ASFV陽性血清來自中國動物疫病預(yù)防與控制中心攻毒豬滅活血清。

1.2 試劑BamHⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、2× PrimeSTAR HS DNA Polymerase均購自TaKaRa公司；PBS緩沖液購自Gibco公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）購自天根生化科技（北京）有限公司；SDS-PAGE Gel Kit、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒及DAB顯色試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；His Trap FFcrude預(yù)裝柱購自GE公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑均購自Sigma公司；HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Trans2K Plus DNA Marker、Trans8K DNA Marker均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)（26616）購自Thermo公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 MGF360-13L多基因家族序列比較與分析 查詢并下載NCBI數(shù)據(jù)庫中31株ASFV毒株基因組數(shù)據(jù)，選擇其中的所有MGF360-13L基因序列，利用DNAstar7.1、SnapGene3.2.1和BioEdit等分析軟件對所有MGF360-13L基因序列進(jìn)行多序列比對、構(gòu)建基因進(jìn)化樹、結(jié)構(gòu)同源性分析等。

1.4 MGF360-13L基因的合成及重組質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)ASFV Georgia 2007/1株MGF360-13L基因序列（GenBank登錄號：FR682468.1）進(jìn)行密碼子優(yōu)化后合成該基因，連接至pUC57質(zhì)粒，命名為pUC57-13L，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計相關(guān)引物，13L-F：5'-cgcggatccATGTCGTTGCCGCTCT-3'；13L-R：5'-ccgctcgagTTATAGTATATTATGAGAA TATTCCC-3'。上、下游引物的劃線部分為引入的BamHⅠ、XhoⅠ內(nèi)切酶位點(diǎn)，并加入保護(hù)性堿基，引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。用該對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：Master Mix 25 μL，上、下游引物各1 μL，質(zhì)粒DNA 2 μL，ddH2O 21 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3 min；95℃變性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸20 s，共35個循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收PCR產(chǎn)物，與pET32a質(zhì)粒分別經(jīng)BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切后，回收酶切產(chǎn)物，采用T4 DNA連接酶連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取單菌落送至擎科生物進(jìn)行測序，用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，采用BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，將測序及雙酶切鑒定正確的陽性重組質(zhì)粒命名為pET32a-13L。

1.5 13L蛋白的最佳誘導(dǎo)條件及可溶性分析 將pET32a-13L按以上方法轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞。挑取單菌落，標(biāo)記為pET32a-13L/BL21，接種至5 mL氨芐抗性（50 μg/mL）的LB培養(yǎng)基中，置37℃搖床中過夜培養(yǎng)，培養(yǎng)后的菌液再按1∶100比例接種至50 mL氨芐抗性（50 μg/mL）的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待OD600值達(dá)到0.6～0.8時（約2 h），每管培養(yǎng)基加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)劑分別在16℃和37℃下誘導(dǎo)15 h，10 000 ×g離心5 min，收集菌體，進(jìn)行超聲破碎，10 000 ×g離心10 min后分別收集上清液與沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析表達(dá)產(chǎn)物可溶性。

1.6 蛋白純化及鑒定 取pET32a-13L/BL21按1∶100比例接種至1 L氨芐抗性（50 μg/mL）的LB培養(yǎng)基中，置37℃搖床培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.6～0.8后按比例加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)劑，16℃誘導(dǎo)12 h后收集菌體，進(jìn)行超聲破碎，10 000 ×g離心10 min后收集沉淀。將沉淀先用8 mol/L脲素變性，再進(jìn)行梯度復(fù)性，具體純化步驟參考文獻(xiàn)[16]純化方法。

取純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，300 mA 70 min轉(zhuǎn)NC膜，5%脫脂乳4℃封閉過夜，洗滌后加入1∶100稀釋的ASFV陽性滅活血清，37℃孵育1～2 h，PBST洗滌3次后加入1∶5000稀釋的羊抗豬二抗，37℃孵育1 h，洗滌后ECL化學(xué)發(fā)光顯色。

1.7 制備重組蛋白多克隆抗體 將純化后的蛋白與弗氏完全佐劑按1∶1比例混合均勻后超聲乳化，按照50 μg/只劑量免疫BALB/c小鼠，對照組注射等體積的PBS。間隔2周后用同劑量蛋白與弗氏不完全佐劑1∶1混勻乳化后進(jìn)行二免，共免疫3次，于三免后1周采血，離心分離血清，用于抗體特異性及效價檢測。采用方陣滴定法測定多克隆抗體效價。具體步驟為：將所純化的13L蛋白（0.223 mg/mL）進(jìn)行倍比稀釋包被ELISA板，100 μL/孔，4℃包被過夜；洗板后用5%脫脂乳封閉，200 μL/孔，37℃封閉2 h；PBST洗滌3次；將分離血清倍比稀釋后加入反應(yīng)孔，100 μL/孔，37℃反應(yīng)1 h；洗滌3次，加入1∶5000稀釋的辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L），100 μL/孔，37℃孵育1 h；PBST洗滌3次，加入TMB顯色液顯色，100 μL/孔，室溫顯色20 min，加入1 mol/L HCl終止液，50 μL/孔，待穩(wěn)定后測定OD450吸光值。

1.8 Western blot檢測 取純化后的蛋白進(jìn)行SDSPAGE電泳，300 mA 70 min轉(zhuǎn)NC膜，5%脫脂乳4℃封閉過夜；PBST洗滌3次，加入稀釋血清37℃孵育1 h；PBST洗滌3次，加入1∶5000稀釋的辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L），37℃孵育1 h；洗滌后ECL化學(xué)發(fā)光顯色。

2 結(jié)果與討論

2.1 MGF360-13L多基因家族序列比較 利用NCBI在線數(shù)據(jù)庫檢索ASFV基因組，共獲得31株不同毒株基因組序列，詳見表1。其中僅有18株ASFV擁有該基因，長度均約1062 kb。目前，NCBI數(shù)據(jù)庫內(nèi)中國所提交的毒株均屬于基因Ⅱ型，通過DNAStar序列比對，MGF360-13L基因高度保守，且基因Ⅰ型和Ⅱ型ASFV毒株的核苷酸序列具有約97%的同源性，與Ⅰ型和Ⅱ型ASFV毒株遺傳進(jìn)化上的結(jié)果接近。而與Ⅲ型和Ⅸ型的兩株核苷酸序列相差較大，僅有88%左右的相似性。

圖1 ASFV 毒株MGF360-13L 基因遺傳進(jìn)化樹Fig.1 Evolution tree of MGF360-13L gene of ASFV strain

表1 不同ASFV 毒株MGF360-13L 基因存在信息Table1 Information on MGF 360-13L genes diff erent ASFV strains

2.2 MGF360-13L重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 將構(gòu)建的pET32a-13L重組質(zhì)粒用BamHⅠ、XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，結(jié)果顯示大小分別為6000 bp和1100 bp兩條帶，與載體5900 bp和目的片段1074 bp的大小相符（圖2）。測序結(jié)果與ASFV Georgia 2007/1株MGF360-13L基因序列一致，表明pET32a-13L重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2 pET32a-13L 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.2 Double enzyme digestion of the recombinant plasmid pET32a-13L

2.3 蛋白的最佳誘導(dǎo)條件及可溶性分析 取pET32a-13L/BL21接種50 mL氨芐抗性（50 μg/mL）的LB培養(yǎng)基，加入終濃度1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)劑分別于16℃和37℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)，每隔3 h取樣1次，制備樣品進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。結(jié)果顯示于16℃誘導(dǎo)12 h時蛋白表達(dá)量較高（圖3A），雜蛋白量較少，且均為包涵體表達(dá)（圖4）。

圖3 不同溫度誘導(dǎo)的不同時間下13L 重組蛋白的表達(dá)情況Fig.3 Expression of recombinant protein 13L at diff erent temperatures and diff erent time

圖4 13L 重組蛋白的可溶性分析Fig.4 Solubility analysis of the recombinant protein 13L

2.4 13L蛋白的純化鑒定 將經(jīng)過包涵體變性和復(fù)性純化后的重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE和Western blot鑒定。結(jié)果顯示60 kDa左右處有一特異性條帶（圖5A），表明重組蛋白正確表達(dá)。經(jīng)Western blot檢測，該重組蛋白能夠與陽性滅活血清發(fā)生特異性反應(yīng)（圖5B）。

圖5 純化后重組蛋白13L 的SDS-PAGE（A）和陽性滅活血清Western blot（B）鑒定Fig.5 SDS-PAGE (A) analysis and positive inactivated serum Western blot (B) identif ication of the purif ied recombinant protein 13L

2.5 重組蛋白多克隆抗體效價檢測 13L重組蛋白免疫小鼠，三免1周后采血分離血清，利用間接ELISA檢測鼠源多克隆抗體的效價。結(jié)果表明，PBS對照組均為陰性，該多克隆抗體的效價高達(dá)1∶256 000（圖6）。

圖6 重組蛋白13L 鼠源多克隆抗體效價檢測Fig.6 Titer determination of mouse polyclonal antibody against recombinant protein13L

圖7 重組蛋白13L 鼠源多克隆抗體Western blot 鑒定Fig.7 Western blot identif ication of mouse polyclonal antibody against recombinant protein 13L

2.6 Western blot檢測 以制備的多克隆抗體為一抗進(jìn)行Western blot，在約60 kDa處出現(xiàn)特異性條帶（圖9），表明該多克隆抗體可特異性結(jié)合13L重組蛋白，具有良好的反應(yīng)性和特異性。陰性對照組無反應(yīng)。

2018年8月，我國首例非洲豬瘟疫情在遼寧沈陽暴發(fā)[6]，至今還未有商品化疫苗供應(yīng)，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了沉重的打擊和巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，建立快速有效的檢測方法極為重要[17]。目前常用的檢測手段主要分為兩大類：免疫學(xué)檢測方法和分子生物學(xué)檢測方法，包括免疫印跡法、酶聯(lián)免疫吸附法、免疫層析試紙條法和血吸附法、常規(guī)PCR、熒光定量PCR和數(shù)字PCR[18]。基于抗原抗體檢測的ELISA法因操作簡單、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)而廣泛應(yīng)用。其中，榮明軒等[19]以不含多聚組氨酸標(biāo)簽的ASFV p30抗原作為包被抗原，建立一種間接ELISA抗體檢測方法，消除了帶有His標(biāo)簽造成的假陽性反應(yīng)，具有良好的特異性、靈敏性和可重復(fù)性；庚辛等[20]成功表達(dá)ASFV p72蛋白并建立間接ELISA檢測方法，通過對該方法敏感性、特異性、重復(fù)性分析，證明該方法可用于臨床樣品檢測。本實(shí)驗(yàn)制備的MGF-13L重組蛋白為新的ELISA方法建立提供了候選可能。

本研究構(gòu)建了pET32a-13L原核表達(dá)載體，經(jīng)誘導(dǎo)后成功獲得包涵體形式表達(dá)的13L重組蛋白，大小為58.2 kDa，經(jīng)Western blot鑒定該蛋白能與陽性滅活血清反應(yīng)。13L蛋白免疫BALB/c小鼠制備多克隆抗體，ELISA檢測效價為1∶256 000，Western blot結(jié)果顯示其特異性良好。本研究所制備蛋白及多克隆抗體可繼續(xù)用于蛋白功能及重組活載體疫苗插入基因表達(dá)情況的特異性鑒定。

綜上，該研究制備的重組蛋白為進(jìn)一步研究MGF360-13L蛋白功能、相關(guān)血清學(xué)檢測方法等建立奠定基礎(chǔ)。