王娜,楊迷玲,楊金花,郝義彬

[河南中醫(yī)藥大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院(鄭州人民醫(yī)院) 病理科,河南 鄭州 450053]

胃癌是起源于胃黏膜上皮細(xì)胞的一種惡性腫瘤,發(fā)病率和病死率在中國(guó)所有惡性腫瘤中分別居第2位和第3位,近年來(lái)發(fā)病人數(shù)還在不斷增加,并逐漸向年輕化趨勢(shì)發(fā)展[1-2]。手術(shù)是胃癌患者可能獲得根治的唯一方法,但受腫瘤分期、分化程度等影響,患者整體治療效果欠佳,預(yù)后較差[3]。一項(xiàng)全國(guó)多中心研究顯示,腹腔鏡遠(yuǎn)端胃癌根治術(shù)患者10 a總生存率僅為46.1%[4]。由此可見(jiàn),胃癌患者腹腔鏡遠(yuǎn)端根治術(shù)的遠(yuǎn)期預(yù)后較差。因此,探討胃癌發(fā)病的分子機(jī)制,對(duì)改善患者遠(yuǎn)期預(yù)后具有重要意義。突觸融合蛋白6(syntaxin 6,STX6)是一種囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,在腎透明細(xì)胞癌[5]、肝癌[6]等多種腫瘤組織中均呈高表達(dá)。最近研究發(fā)現(xiàn),P53基因調(diào)控著細(xì)胞凋亡相關(guān)基因gm1、bax、P2xm、pag608和killer/dr5表達(dá),而STX6是P53的直接作用靶點(diǎn),能促進(jìn)P53依賴型癌細(xì)胞生長(zhǎng),導(dǎo)致癌癥復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[7]。然而,STX6在胃癌組織中的表達(dá)及作用機(jī)制尚不清楚?；诖?本研究采用回顧性分析方法,探討胃癌術(shù)后腫瘤組織中STX6表達(dá)水平與臨床病理特征、遠(yuǎn)期預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性納入2019年6月至2022年6月在河南中醫(yī)藥大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院(鄭州人民醫(yī)院)接受手術(shù)的82例胃癌患者的臨床資料,其中男48例,女34例;年齡46～70(54.60±5.38)歲;體重指數(shù)20～26(22.57±2.10)kg·m-2。

1.2 入選標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn):胃癌經(jīng)手術(shù)病理、影像學(xué)等檢查后確診;病理資料、實(shí)驗(yàn)室檢查資料及隨訪資料完整;年齡40～62歲;術(shù)前未接受過(guò)其他抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn):伴有其他惡性腫瘤;主要器官功能受損;伴有精神功能障礙;患有嚴(yán)重急慢性疾病或感染性疾病;術(shù)后出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥。

1.3 研究方法

STX6檢測(cè):采用免疫組織化學(xué)En Vision法染色,4 μm石蠟切片在60 ℃下烘烤2 h,加入二甲苯和梯度乙醇脫蠟至水,采用檸檬酸熱修復(fù)法抗原修復(fù),加入3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))過(guò)氧化氫封閉,一抗4 ℃孵育過(guò)夜,滴加HRP標(biāo)記的二抗,室溫孵育30 min,常規(guī)DAB顯色,設(shè)置PBS代替一抗作為陰性對(duì)照組,已知陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照組。安排兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師采用雙盲法評(píng)價(jià)STX6表達(dá)情況,于400倍視野鏡下觀察胃癌組織和癌旁組織的腫瘤細(xì)胞及染色程度,參照馬麗等[8]研究評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞和染色程度,腫瘤細(xì)胞:0分(無(wú)陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞)、1分(<10%陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞)、2分(11%～35%陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞)、3分(36%～70%陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞)、4分(>70%陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞)。染色程度:1分(淡黃色)、2分(黃棕色)、3分(棕褐色)。將陽(yáng)性比例和染色程度得分相乘即得到最終得分,0分為STX6陰性表達(dá),1～12分為STX6陽(yáng)性表達(dá)。

蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn):采用蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)STX6表達(dá)情況,操作如下。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)要求提取胃癌組織蛋白,采用BCA法測(cè)定總蛋白濃度,蛋白提取完成后放置于-80 ℃冰箱保存。采用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠配制100 g·L-1的分離膠和80 g·L-1的濃縮膠進(jìn)行電泳,電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜1.5 h,用磷酸鹽吐溫緩沖液洗膜,洗膜后用50 g·L-1的脫脂牛奶封閉;一抗是STX6抗體(Abcam公司,ab140607),抗體在4 ℃環(huán)境下孵育過(guò)夜,二抗室溫孵育30 min;最后,于暗室曝光顯影,分析STX6相對(duì)表達(dá)量。

1.4 臨床病理資料收集、隨訪及預(yù)后監(jiān)測(cè)

查閱胃癌患者電子病例檔案,收集腫瘤部位、腫瘤直徑、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、人類表皮生長(zhǎng)因子受體-2(human epidermal growth factor receptor-2,HER-2)等病理資料。所有患者出院后均接受隨訪,每3個(gè)月進(jìn)行1次電話隨訪或門診復(fù)查,門診復(fù)查內(nèi)容主要包括胸部CT、胃鏡、腫瘤標(biāo)志物等,隨訪時(shí)間截至2023年6月31日,記錄患者生存時(shí)間。

1.5 觀察指標(biāo)

(1)不同臨床病理特征患者胃癌組織中STX6表達(dá)情況;(2)胃癌患者的遠(yuǎn)期預(yù)后;(3)胃癌患者臨床病理特征、遠(yuǎn)期預(yù)后與STX6表達(dá)的關(guān)聯(lián)性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織中STX6表達(dá)情況

免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果顯示,胃癌組織STX6表達(dá)陽(yáng)性率為65.85%(54/82),高于癌旁組織中50.00%(41/82)(χ2=4.228,P=0.040)。

2.2 胃癌組織中STX6表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

胃癌組織中STX6表達(dá)與腫瘤部位、腫瘤直徑及分化程度無(wú)相關(guān)性(P>0.05),但與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及HER-2表達(dá)相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 胃癌組織中STX6表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3 STX6陽(yáng)性表達(dá)和STX6陰性表達(dá)患者的總生存期比較

隨訪結(jié)果顯示,STX6陽(yáng)性表達(dá)和STX6陰性表達(dá)患者的總生存率分別為74.07%、92.86%(χ2=4.142,P=0.042)。經(jīng)log-rankχ2檢驗(yàn),STX6陽(yáng)性表達(dá)者的總生存時(shí)間較STX6陰性表達(dá)者短(χ2=16.346,P<0.001)。見(jiàn)圖1。

圖1 STX6陽(yáng)性表達(dá)和STX6陰性表達(dá)患者的生存曲線

2.4 胃癌組織中STX6表達(dá)與遠(yuǎn)期預(yù)后的關(guān)系分析

經(jīng)一般雙變量Pearson相關(guān)性分析顯示,胃癌組織中STX6表達(dá)與患者總生存期呈負(fù)相關(guān)(r=-0.508,P<0.001)。

3 討論

現(xiàn)階段,臨床對(duì)胃癌多采用以手術(shù)為主的綜合治療策略,但難早期診斷、術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高等導(dǎo)致胃癌患者總體預(yù)后較差[9]。STX6是突觸前膜中的一類特殊蛋白,可通過(guò)介導(dǎo)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)和膜融合參與多種惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程[10-11]。目前研究顯示,STX6是一種潛在的致癌基因,影響著食管癌[12]、前列腺癌[13]等多種惡性腫瘤的預(yù)后轉(zhuǎn)歸。。

本研究結(jié)果顯示,STX6在胃癌組織和癌旁組織中存在差異表達(dá),且在胃癌組織中的表達(dá)更高。胃癌的進(jìn)展與原癌基因或抑癌基因的異常表達(dá)有關(guān),STX6作為一種促癌基因,可維持人體內(nèi)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2水平,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移和血管生成,最終導(dǎo)致胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[14]。研究發(fā)現(xiàn),抑制STX6功能可阻斷血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2功能,阻礙新生血管生成[10]。提示STX6對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2的調(diào)控機(jī)制可能是胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的重要因素之一。既往大量文獻(xiàn)報(bào)道,P53是迄今為止與人類腫瘤關(guān)系最密切的基因之一,P53基因的突變和功能喪失會(huì)導(dǎo)致新生血管生成,有利于腫瘤快速生長(zhǎng)[15-16]。而STX6是P53基因的作用靶點(diǎn)之一,STX6在腫瘤組織中呈高表達(dá)會(huì)增強(qiáng)P53家族對(duì)血管生成基因Smad4的刺激能力,最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力增強(qiáng),增加患者預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)[17-18]。一項(xiàng)針對(duì)乳腺癌細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn),STX6敲低后可阻礙細(xì)胞黏附,引起腫瘤細(xì)胞周期停滯并加快腫瘤細(xì)胞凋亡,進(jìn)而對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖產(chǎn)生抑制作用[19]?？梢?jiàn)STX6在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中扮演重要角色。Zhou等[20]研究發(fā)現(xiàn),STX6能通過(guò)激活USF2/LC3B軸改變腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性,最終促進(jìn)惡性腫瘤進(jìn)展。提示對(duì)于胃癌根治術(shù)后仍接受化療的患者來(lái)說(shuō),STX6改變癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性也可能是胃癌轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的一個(gè)關(guān)鍵因素。本研究經(jīng)Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)顯示,胃癌組織中STX6表達(dá)與患者總生存期呈負(fù)相關(guān)。這與上述觀點(diǎn)相符。

本研究還顯示,TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HER-2陽(yáng)性的胃癌組織中STX6陽(yáng)性比率較高,與馬麗等[8]研究結(jié)果大致相符。TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和HER-2陽(yáng)性往往預(yù)示著腫瘤浸潤(rùn)程度較深、惡性程度較高,因此具有上述病理特征的胃癌患者STX6陽(yáng)性表達(dá)占比較高。提示在臨床工作中,可以根據(jù)STX6表達(dá)情況篩選出術(shù)后高復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的胃癌患者,并針對(duì)此類患者開(kāi)展相應(yīng)的治療,可能對(duì)改善患者遠(yuǎn)期預(yù)后有積極意義。

4 結(jié)論

胃癌患者的臨床病理特征和遠(yuǎn)期預(yù)后與STX6表達(dá)存在密切相關(guān)性,但本研究作為回顧性、單中心研究,病例數(shù)量有限,所得結(jié)論仍有待大樣本、多中心的前瞻性研究加以驗(yàn)證。此外,目前STX6在胃癌中的研究證據(jù)有限,其在胃癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用機(jī)制還有待深入研究。