李冰心，龔淑影，許丹寧，李婉雁，曹 楠，付新亮，江丹莉，洪龍勝，余梓榆，白帥飛，田允波

（仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，廣東廣州 510225）

白術(shù)多糖（Polysaccharide ofAtractylodes macrocephalaKoidz，PAMK）是中藥白術(shù)最主要的有效生物活性成分之一。研究表明，白術(shù)多糖具有抗炎、抗氧化、降血糖與免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性[1-3]。在免疫方面，PAMK 通過改善肝脂代謝和增加抗氧化酶活性，有效地保護(hù)肝臟免受高能量低蛋白飲食引起的損傷，進(jìn)一步減輕肝臟負(fù)擔(dān)，從而顯著提升免疫系統(tǒng)的功能[4]，并通過介導(dǎo)信號(hào)通路減輕肝臟炎癥損傷和氧化應(yīng)激[5]。此外，PAMK 還可以通過提高白細(xì)胞數(shù)量、修復(fù)骨髓、脾臟及胸腺的組織結(jié)構(gòu)、提高白細(xì)胞功能等途徑減輕環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠白細(xì)胞的抑制和破壞作用，并對(duì)正常小鼠的淋巴細(xì)胞功能具有明顯的提升作用[6]。

腎臟是哺乳動(dòng)物重要的排泄器官，在維持體內(nèi)平衡中起著至關(guān)重要的作用。環(huán)磷酰胺（Cyclophosphamide，CTX）是一種常用的抗癌藥物，但它也會(huì)產(chǎn)生許多副作用，包括尿毒性或腎毒性[7]。CTX 的代謝轉(zhuǎn)化導(dǎo)致兩種代謝物的形成：磷酰胺芥末和丙烯醛，磷酰胺芥被認(rèn)為具有抗腫瘤活性，而丙烯醛作為一種生物半衰期短的高活性代謝物，可能是CTX 誘導(dǎo)腎損傷的原因[8-9]。丙烯醛可以產(chǎn)生高活性氧（ROS），干擾組織抗氧化防御系統(tǒng)，對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有致突變性[10-12]，為了避免這些氧化毒性副作用，當(dāng)前常用抗氧化劑對(duì)丙烯醛進(jìn)行解毒，比如芍藥苷已被用于緩解CTX 引起的腎損害[13]。Gunes 等[14]發(fā)現(xiàn)香芹酚能夠作為一種抗氧化劑，保護(hù)生物分子，如膜脂，免受自由基誘導(dǎo)的損傷，并且能夠減少CTX 注射后大鼠的氧化應(yīng)激的反應(yīng)。然而，PAMK對(duì)CTX 誘導(dǎo)的小鼠腎損傷的影響尚未見報(bào)道。

本研究擬通過注射CTX 建立小鼠腎損傷模型，以探究PAMK 對(duì)CTX 誘導(dǎo)的小鼠腎損傷的影響，并通過轉(zhuǎn)錄組測序掌握PAMK 緩解CTX 誘導(dǎo)的小鼠腎損傷的作用機(jī)制，為后續(xù)研究PAMK 緩解CTX誘導(dǎo)的機(jī)體損傷提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

PAMK 純度95%，中國西安楊凌慈源生物技術(shù)公司；注射用環(huán)磷酰胺國藥準(zhǔn)字H14023686 山西普德藥業(yè)股份有限公司；SPF 級(jí)C57BL/6 雄性小鼠 42～43 日齡，100 只，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、總抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA）、過氧化氫酶（CAT）試劑盒 南京建成生物工程研究所；預(yù)混型定量用反轉(zhuǎn)錄試劑盒 日本TAKARA 公司；Trizol 試劑 美國Thermo Fisher 公司；SYBR Green Master Mix PCR 中國康潤生物技術(shù)公司。

Epoch 超微量微孔板分光光度計(jì) 美國伯騰儀器有限公司；7500 REAL TIME PCR SYSTEM 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀、VERITI 梯度PCR 儀 美國ABI 公司；Micro 21R 高速冷凍離心機(jī) 美國Thermo Fisher 公司；Bioanalyzer 2100 2100 生物分析系統(tǒng) 美國Agilent 公司；NovaSeq 6000 基因DNA 測序儀 美國Illumina 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品采集 100 只42～43 日齡雄性C57BL/6 小鼠被隨機(jī)分為四組，分別為對(duì)照組（Control）、環(huán)磷酰胺組（CTX）、白術(shù)多糖組（PAMK）、白術(shù)多糖+環(huán)磷酰胺組（PAMK+CTX），25 只/組，每組5 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5 只。實(shí)驗(yàn)期間，PAMK 組和PAMK+CTX 組灌胃200 mg/kg PAMK 1 次/d；Control 組和CTX 組給予等量的生理鹽水。實(shí)驗(yàn)第25～27 d，CTX 組和PAMK+CTX 組腹腔注射100 mg/kg CTX 1 次/d；Control 組和PAMK 組注射等量生理鹽水。實(shí)驗(yàn)第35 d，每組隨機(jī)選取5 只小鼠采集腎臟組織，取部分腎臟組織立即凍入液氮，-80 ℃保存?zhèn)溆?；剩余組織樣品于10%中性緩沖福爾馬林中固定保存。本試驗(yàn)所有小鼠均接受人道處理，試驗(yàn)經(jīng)仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)協(xié)議號(hào)為：2023030501。

1.2.2 腎臟組織學(xué)及超微形態(tài)學(xué)觀察 腎臟組織在10%中性緩沖福爾馬林溶液中固定48 h，包埋石蠟，切成5～6 μm 厚的切片。常規(guī)組織學(xué)檢查，石蠟切片蘇木精-伊紅染色法（HE 染色），HE 染色切片在光學(xué)顯微鏡下觀察并用Case Viewer 軟件進(jìn)行圖像采集。

1.2.3 腎臟抗氧化指標(biāo)檢測 取0.2 g 腎臟組織加入1.8 mL 磷酸鹽緩沖液（PBS），經(jīng)組織破碎儀破碎制成10%組織勻漿，3000 r/min 離心10 min，取上清待測（n=5）。按照試劑盒的說明，檢測組織中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、總抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA）、過氧化氫酶（CAT）含量。

1.2.4 RNA 提取及文庫構(gòu)建 用Trizol 試劑提取腎臟組織總RNA，利用NanoDrop ND-1000 分析總RNA 質(zhì) 量和 純度（濃度＞50 ng/μL、RIN 值＞7.0、OD260/280＞1.8），并通過Bioanalyzer 2100 儀器檢測RNA 完整性。每個(gè)樣本分別取5 μg RNA 用于轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建，運(yùn)用Epicenter Ribo-Zero Gold 試劑盒去除樣本中的核糖體RNA（rRNA），剩余RNA 純化后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以構(gòu)建cDNA 文庫。通過聯(lián)川生物技術(shù)有限公司的Illumina Novaseq? 6000 平臺(tái)對(duì)構(gòu)建的小鼠腎組織cDNA 文庫進(jìn)行雙端測序，測序模式為PE150。測序完成后，使用Cutadapt 軟件刪除包含連接物污染、低質(zhì)量堿基和未定義堿基讀數(shù)的原始數(shù)據(jù)（raw reads）。利用FastQC 軟件（http://www.bioinformatics babraham.ac.uk/projects/fastqc/）獲得高質(zhì)量的clean reads，并且將該數(shù)據(jù)與小鼠（Mus musculus）基因組序列進(jìn)行序列比對(duì)。利用Tophat2檢測測序數(shù)據(jù)的飽和度，同時(shí)對(duì)比對(duì)上的reads 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以評(píng)估clean reads 在內(nèi)含子（intron）、外顯子（exon）和基因間隔區(qū)（intergenic）的分布情況。

1.2.5 差異表達(dá)基因GO 功能及KEGG 通路富集分析 采用DESeq2 軟件對(duì)兩組間基因差異表達(dá)進(jìn)行分析，以P＜0.05 且|log2（Fold change）|≥1 為閾值，篩選差異表達(dá)基因。利用Goseq R 軟件包和Kobas 在線工具（http://kobas.cbi.pku.edu.cn/genelist/）分別對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 功能和KEGG 功能富集通路分析。GO 功能富集包括生物過程、細(xì)胞成分和分子功能。以P＜0.05 作為篩選顯著富集的GO 條目或KEGG 信號(hào)通路的標(biāo)準(zhǔn)。利用在線網(wǎng)站Venny 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）對(duì)兩組KEGG 富集的通路進(jìn)行交集分析。

1.2.6 轉(zhuǎn)錄組測序基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR 檢測 根據(jù)RNA-Seq 結(jié)果挑選花生四烯酸通路相關(guān)基因CYB2B9、CYP2C65、NF-κB、PTGS1、ALOX5、ALOX12、BCL6、MFSD2A進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。使用Trizol 試劑，嚴(yán)格按照說明書提取相同批次的RNA，按照TaKaRa 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)GenBank 中各基因序列，利用Oligo 7 軟件設(shè)計(jì)引物，引物信息見表1。引物均由上海生工生物工程有限公司合成。在實(shí)時(shí)定量PCR 采用SYBR Green 嵌合熒光法，反應(yīng)體系包括SYBR Green Master Mix 10 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，cDNA 1 μL，RNase free ddH2O 8 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性2 min；95 °C 變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物信息Table 1 Information of the primers

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、作圖。根據(jù)one-way ANOVA 比較平均值，并通過Tukey 檢驗(yàn)進(jìn)行組間多重比較，數(shù)值以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 PAMK 對(duì)CTX 誘導(dǎo)的小鼠腎臟組織結(jié)構(gòu)的影響

各組小鼠的腎組織切片如圖1 所示，Control 組和PAMK 組小鼠腎臟結(jié)構(gòu)更為完整，腎小管包括近曲小管及遠(yuǎn)曲小管各部位上皮細(xì)胞無變性，排列有序，腎小囊明顯，腎小體、腎小球等結(jié)構(gòu)均正常，管腔形態(tài)大小正常，未見異狀。CTX 組出現(xiàn)了明顯的病理現(xiàn)象，如腎小球萎縮、腎小管上皮細(xì)胞脫落、周圍有少許出血點(diǎn)和炎性細(xì)胞浸潤；與CTX 組相比，PAMK+CTX 組腎組織病變明顯好轉(zhuǎn)。

圖1 小鼠腎臟組織病理學(xué)變化（H&E 染色，100×，400×）Fig.1 Histopathological changes of mouse kidney (H&E staining,100×，400×)

2.2 PAMK 對(duì)CTX 誘導(dǎo)的小鼠腎臟抗氧化指標(biāo)的影響

腎臟組織中MDA 含量、GSH-Px、SOD、CAT活性和總抗氧化能力檢測結(jié)果如圖2 所示，與Control 組相比，注射CTX 后的小鼠腎組織的SOD、GSH-Px 活性顯著降低（P＜0.05）；MDA 含量顯著升高（P＜0.05）；相較于CTX 組，CTX+PAMK 組小鼠腎組織的GSH-Px、SOD、CAT 活性和總抗氧化能力顯著升高（P＜0.05）；MDA 含量顯著下降（P＜0.05）。與Control 組相比，PAMK 組小鼠腎組織中的總抗氧化能力顯著升高（P＜0.05），GSH-Px、SOD、CAT 活性無顯著差異。

圖2 PAMK 對(duì)小鼠機(jī)體中氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響Fig.2 Effects of PAMK on oxidative stress indexes in mice

2.3 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析

本研究構(gòu)建的9 個(gè)cDNA 文庫中獲得了37125316～43483558 條清潔讀數(shù)（clean reads），有效比對(duì)率在94.36%以上，所有樣本的Q20%值均＞99.90%，Q30%值均＞97.81%，GC 含量（RNA 序列中，含有鳥嘌呤（Guanine，簡稱G）和胞嘧啶（Cytosine，簡稱C）這兩種堿基的比例在47.50%～50.00%，說明測序質(zhì)量的錯(cuò)誤率低，數(shù)據(jù)可靠性高，可用于后續(xù)分析。通過對(duì)各樣本的mRNA 區(qū)域分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，發(fā)現(xiàn)各樣本中外顯子（exon）、內(nèi)含子（intron）和基因間隔區(qū)域（intergenic）所占比例相似，其中由外顯子轉(zhuǎn)錄而來的mRNAs 片段比例最高，占95%以上（圖3）。

圖3 小鼠腎臟組織中mRNAs 分布統(tǒng)計(jì)Fig.3 Distribution statistics of mRNAs in bursae of Fabricius of mouse

2.4 差異表達(dá)基因分析

通過DESeq2 軟件對(duì)轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Control 組vs CTX 組共獲得493 個(gè)差異表達(dá)基因，其中236 個(gè)基因上調(diào)，257 個(gè)基因下調(diào)（圖4A～圖4B）；CTX 組vs PAMK+CTX 組共獲得333個(gè)差異表達(dá)基因，其中184 個(gè)基因上調(diào)，149 個(gè)基因下調(diào)（圖4C～圖4D）。

圖4 差異表達(dá)基因火山圖和熱圖Fig.4 Volcano map and heatmap of differentially expressed genes

2.5 差異表達(dá)基因GO 功能與KEGG 通路富集分析

GO 功能富集分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因多富集在與炎癥和免疫反應(yīng)相關(guān)的GO 條目，其中Control組vs CTX 組主要富集在環(huán)氧合酶P450 途徑、花生四烯酸環(huán)氧合酶活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)DNA 結(jié)合的負(fù)調(diào)控等途徑（圖5A）；CTX 組vs PAMK+CTX 組主要富集在花生四烯酸環(huán)氧合酶活性、細(xì)胞色素P450 途徑、絲氨酸型肽酶活性等途徑（圖5C）。KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示，Control 組vs CTX 組差異表達(dá)基因主要富集在花生四烯酸代謝（T 細(xì)胞受體、NFκB 等信號(hào)通路（圖5B）；CTX 組vs PAMK+CTX 組主要富集在花生四烯酸代謝、亞油酸代謝、TRP 通道的炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)等信號(hào)通路（圖5D）。表2 和圖6 結(jié)果顯示，Control 組vs CTX 組、CTX vs PAMK+CTX組的KEGG 富集通路中有交集的通路有7 個(gè)。其中花生四烯酸代謝通路在Control 組vs CTX 組和CTX 組 vs PAMK+CTX 組中的富集最顯著。

圖5 差異表達(dá)基因GO 功能（A、C）和KEGG 通路（B、D）富集分析Fig.5 GO function (A,B) and KEGG pathway (B,D) enrichment analysis of differentially expressed genes

圖6 Control vs CTX 和CTX vs PAMK+CTX KEGG 富集通路交集維恩圖Fig.6 Gene intersection Venn diagram of Control vs CTX and CTX vs PAMK+CTX KEGG enrichment pathway

表2 Control vs CTX 和CTX vs PAMK+CTX KEGG交集通路Table 2 Intersection pathways of Control vs CTX,CTX vs PAMK+CTX KEGG

2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測

用實(shí)時(shí)熒光定量檢測Control 組vs CTX 組和CTX 組vs PAMK+CTX 組關(guān)鍵基因CYP2C65、CYP2B9、PTGS1、ALOX5、ALOX12、NF-κB和抗氧化基因BCL6、MFSD2A。由圖7 可知，與Control組相比，CTX 組Cyp2b9、PTGS1、NF-κB和Mfsd2amRNA 表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），BCL6mRNA 表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），Cyp2c65、ALOX5和ALOX12mRNA 表達(dá)量無顯著差異（P＞0.05）；與CTX 組相比，PAMK+CTX 組Cyp2c65、BCL6mRNA 表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），Cyp2b9、PTGS1和Mfsd2amRNA表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）；ALOX5、ALOX12和NFκBmRNA 表達(dá)量無明顯差異。

圖7 PAMK 對(duì)CTX 處理下小鼠腎臟組織相關(guān)基因的mRNA 相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.7 Effect of PAMK on the relative expression of mRNA for genes in mouse kidney tissue treated with CTX

3 討論與結(jié)論

腎臟能清除有毒物質(zhì)，如果腎臟功能不正常，會(huì)影響機(jī)體有害物質(zhì)的排泄，使毒素的積累不能立即清除，從而可能導(dǎo)致各種疾病。目前腎臟疾病的防治已成為眾多學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)[15]。通過觀察小鼠腎組織病理切片，HE 染色結(jié)果顯示CTX 組腎小球萎縮，腎小管腔變形，周圍有少許出血點(diǎn)并有炎性細(xì)胞浸潤，導(dǎo)致腎組織出現(xiàn)明顯的病理損傷。與CTX 組相比，經(jīng)白術(shù)多糖治療后，腎臟損傷程度明顯改善，主要表現(xiàn)為腎小管結(jié)構(gòu)清晰，周圍炎性細(xì)胞明顯減少，表明PAMK 治療逆轉(zhuǎn)了CTX 致腎臟組織炎癥損傷。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CTX 處理后，MDA 含量增加、SOD、GSH-Px、CAT 活性降低。經(jīng)過PAMK 治療后，MDA 的積累減少，小鼠機(jī)體內(nèi)SOD、GSH-Px、CAT 活性和總抗氧化能力顯著提高。CTX 的使用與機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激密切相關(guān)，有研究表明CTX 會(huì)引起動(dòng)物體內(nèi)MDA 升高，抑制GSH-Px、CAT 和SOD 的活性，削弱機(jī)體的抗氧化能力，破壞氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)的平衡，導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激現(xiàn)象[16]。氧化應(yīng)激反應(yīng)是一種高響應(yīng)性的防御機(jī)制，如果長期處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，可能會(huì)導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生[17]。SAKR 等[18]發(fā)現(xiàn)了注射環(huán)磷酰胺可引起大鼠腎血管的擴(kuò)張和充血，腎小管上皮細(xì)胞的空泡化以及腎小球的萎縮，并推測引起這些病理變化的原因可能是環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激造成的。說明了CTX 處理的小鼠產(chǎn)生了氧化應(yīng)激反應(yīng)。近些年來，中藥白術(shù)中的主要活性物質(zhì)白術(shù)多糖被證明有抗氧化、抗炎及免疫調(diào)節(jié)等作用，如陳浩祥等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)嶺南黃雞飼喂白術(shù)多糖可顯著提高血清中SOD 與GSH-Px 的活性，降低機(jī)體MDA 含量，從而緩解CTX 引起的機(jī)體氧化應(yīng)激與肝細(xì)胞凋亡情況。上述結(jié)果表明了PAMK 能增強(qiáng)CTX 處理下的抗氧化能力，減少脂質(zhì)過氧化程度，緩解由CTX 引起的氧化應(yīng)激。

為了探究PMAK 對(duì)CTX 誘導(dǎo)的腎臟損傷的基因調(diào)控機(jī)制，本研究進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序分析。研究結(jié)果顯示，存在大量與抗氧化相關(guān)的DEGs，其中BCL6、Mfsd2a在本實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中有顯著性差異。BCL6的表達(dá)水平相對(duì)于CTX 組顯著上調(diào)，這種上調(diào)的程度與CTX 誘導(dǎo)的小鼠氧化應(yīng)激的減輕呈正相關(guān)，同時(shí)PAMK 具有抗氧化的功能，BCL6的上調(diào)可能與PAMK 抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的激活相關(guān)，從而減輕了CTX 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。并且，有研究發(fā)現(xiàn)BCL6通過負(fù)調(diào)控NLRP3轉(zhuǎn)錄來減輕血管緊張素 II 或脂多糖誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞炎癥，BCL6在自發(fā)性高血壓大鼠中的過表達(dá)降低了SHR 的血壓、NLRP3的表達(dá)和腎皮質(zhì)炎癥[20]。另外，有研究表明，主要Mfsd2a的下調(diào)可能通過抑制Caveola 介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，維持血腦屏障的完整性和抗氧化功能，從而保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常功從而維持了血腦屏障的完整性和抗氧化功能[21]。本實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果與該研究一致，進(jìn)一步支持了Mfsd2a下調(diào)有助于PAMK 緩解CTX 誘導(dǎo)的小鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)。綜上，表明PAMK 通過調(diào)節(jié)抗氧化途徑來發(fā)揮其保護(hù)作用，從而減輕小鼠腎臟氧化損傷。

為了進(jìn)一步探究PAMK 緩解CTX 誘導(dǎo)的腎損傷的機(jī)制，本研究進(jìn)一步將兩組DEGs 進(jìn)行富集分析發(fā)現(xiàn)，兩組交集通路中最顯著的是花生四烯酸代謝通路，其中花生四烯酸代謝通路已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)與炎癥發(fā)生與緩解密切相關(guān)?；ㄉ南┧幔ˋA）作為細(xì)胞膜脂質(zhì)的主要成分，是細(xì)胞膜脂含量的主要組成部分，主要由三種酶代謝：環(huán)氧合酶、脂氧合酶和細(xì)胞色素P450（CYP450）酶[22]?；谶@三種代謝途徑，AA 可以轉(zhuǎn)化為各種代謝產(chǎn)物，引發(fā)不同的炎癥反應(yīng)。在腎臟中，前列腺素、血栓素、白三烯和羥基二碳四烯酸（HETEs）是AA 產(chǎn)生的主要代謝物。前列腺素和白三烯水平升高導(dǎo)致腎臟炎癥損傷[23-25]。花生四烯酸可以通過花生四烯酸5-氧化酶的催化轉(zhuǎn)化為5-羥基花生四烯酸，然后5-羥基花生四烯酸可以進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為白三烯，白三烯是一類強(qiáng)炎癥介質(zhì)，能夠引起血管擴(kuò)張、增加血管通透性和促進(jìn)炎癥細(xì)胞的吸附和遷移[26]。PTGS1（也稱為COX-1）是一種環(huán)氧合酶酶類，它參與花生四烯酸的代謝，催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素H2 的反應(yīng)，PTGS1可能導(dǎo)致前列腺素和血栓素的過量產(chǎn)生，引發(fā)炎癥反應(yīng)和相關(guān)病理變化[27]。實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果顯示，PTGSI、ALOX5和ALOX12CTX 組中mRNA 的表達(dá)量均呈現(xiàn)增高的趨勢。表明了CTX 可能通過氧合酶和脂氧合酶途徑誘導(dǎo)小鼠腎臟炎癥損傷。此外，NF-κB是調(diào)控機(jī)體炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子，有研究發(fā)現(xiàn)缺血再灌注所致急性腎損傷大鼠的腎組織NF-κB 信號(hào)通路相關(guān)基因NF-κB表達(dá)量顯著上升[28]。提示CTX 可能激活腎臟內(nèi)的NF-κB通路導(dǎo)致小鼠腎臟損傷，上述結(jié)果證實(shí)，在PAMK+CTX 組中PTGS1、AOLX5、ALOX12、NF-κB的mRNA 表達(dá)量均有下降的趨勢，PAMK 在CTX 誘導(dǎo)的腎損傷中發(fā)揮了關(guān)鍵的腎臟保護(hù)作用。

此外，AA 還可以通過細(xì)胞色素P450 單加氧酶產(chǎn)生的19-HETE 和20-HETE 調(diào)節(jié)腎離子運(yùn)輸；由CYP450 酶產(chǎn)生的環(huán)氧二十碳三烯酸（EETs）也在炎癥過程中腎臟損傷中起著重要作用，CYP450 途徑產(chǎn)生的EETs 能夠促進(jìn)腎小管細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)腎損傷后的修復(fù)。研究發(fā)現(xiàn)，EETs 還具有抗炎和抗氧化作用，可以減輕腎損傷引起的炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，有助于保護(hù)腎臟免受進(jìn)一步的損傷用[29-31]。并且，顯著富集通路中的DEGs，大多參與CYP450 通路，通過對(duì)腎臟的轉(zhuǎn)錄組分析，共同調(diào)控基因可能是PAMK 的調(diào)控靶點(diǎn)，兩組相關(guān)的關(guān)鍵基因Cyp2c65、Cyp2b9mRNA表達(dá)量呈相反的趨勢與測序結(jié)果一致。Cyp2b9是細(xì)胞色素P450 家族的一員，眾所周知，它通過產(chǎn)生超氧化物自由基而產(chǎn)生氧化應(yīng)激[32]。Lu 等[33]研究結(jié)果表明，肝臟在HFD（高脂飲食）的作用與Cyp2b家族相關(guān)。此外，研究發(fā)現(xiàn)LPS 誘導(dǎo)肝臟和十二指腸中Cyp2c、Cyp2j總含量的強(qiáng)烈抑制；同樣處理?xiàng)l件下，在十二指腸，Cyp2c65和Cyp2j6的表達(dá)顯著減少[34]。這與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，CTX 組Cyp2c65表達(dá)量顯著減少，PAMK+CTX組表達(dá)量顯著上升，說明了PAMK 可以通過Cyp2c65、Cyp2b9調(diào)控花生四烯酸代謝通路影響代謝性產(chǎn)物，緩解CTX 誘導(dǎo)的小鼠腎損傷。P450 酶具有許多生理相關(guān)功能，包括調(diào)節(jié)心臟血管張力[35-36]，腎臟離子轉(zhuǎn)運(yùn)介導(dǎo)[37]，血管抗炎特性[38]，以及控制胰腺肽激素的分泌[39]。CYP2J 成員已被證明在AA 和亞油酸以及各種外源性藥物的代謝中具有活性[40-41]。有研究發(fā)現(xiàn)CYP2J 酶可能參與脂肪酸代謝，并可能影響許多心血管和腎臟代謝過程[42-43]。同時(shí)PAMK 具有調(diào)節(jié)脂代謝酶的活性，提高抗氧化能力，PAMK 對(duì)CTX 所致的炎癥和氧化應(yīng)激有正向的調(diào)節(jié)作用[44]。另外，細(xì)胞色素P450 途徑產(chǎn)生的EETs 加快對(duì)腎臟損傷細(xì)胞的增殖分化，促進(jìn)血管新生，恢復(fù)腎臟基本功能，及時(shí)將代謝廢物和有害物質(zhì)排出體外[45]。以上結(jié)果表明，在CTX 誘導(dǎo)的小鼠腎損傷過程中，PAMK可能通過影響花生四烯酸環(huán)氧合酶的活性緩解小鼠腎臟損傷。

綜上所述，本研究結(jié)果表明PAMK 可能通過調(diào)節(jié)花生四烯酸代謝通路，緩解小鼠腎臟的氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而降低CTX 引起的腎臟損傷。這一發(fā)現(xiàn)揭示了PAMK 在維持腎臟形態(tài)和結(jié)構(gòu)完整性方面的重要作用，這些結(jié)果為進(jìn)一步探索PAMK 的調(diào)控機(jī)制以及開發(fā)相關(guān)治療方法提供參考依據(jù)。

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