王伸盛,張新中,張岱男,岳雙柱,楊衛(wèi)瀧,李文超
新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 河南省神經(jīng)修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 新鄉(xiāng) 453100
創(chuàng)傷性腦損傷是指由外部物理力量引起的大腦神經(jīng)功能障礙[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì),全世界每年有5 000 多萬(wàn)人遭受顱腦損傷[2]。顱腦損傷包括原發(fā)性和繼發(fā)性,原發(fā)性損傷與大腦的原發(fā)外部影響直接相關(guān),繼發(fā)性損傷在原發(fā)性損傷后幾分鐘到幾天內(nèi)發(fā)生,通過(guò)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等機(jī)制,進(jìn)一步損害神經(jīng)細(xì)胞,破壞血腦屏障,引起嚴(yán)重腦水腫[3]。研究發(fā)現(xiàn),繼發(fā)性腦損傷在很大程度上決定了顱腦損傷患者的預(yù)后情況[4]。
新橙皮苷是一種二氫黃酮苷類(lèi)化合物,作為一種傳統(tǒng)中藥枳實(shí)的主要成分,具有抗氧化[5]、降低炎性反應(yīng)[6]、抗凋亡[7]等作用。研究表明,新橙皮苷可以穿透血腦屏障[8],即使在大鼠中每天750 mg/kg劑量持續(xù)91 d 未見(jiàn)明顯毒性反應(yīng)[9]。新橙皮苷在腦缺血實(shí)驗(yàn)中通過(guò)抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡和氧化應(yīng)激,減輕神經(jīng)元損傷,增強(qiáng)大腦的抗氧化能力,從而減輕腦缺血再灌注損傷,顯著改善神經(jīng)功能[10],但對(duì)大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。
網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以廣泛的數(shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ),已成為系統(tǒng)揭示復(fù)雜生物系統(tǒng)功能和行為的有力工具,可全面揭示多成分藥物植物中多成分-多靶點(diǎn)-多通路的作用機(jī)制[11],本研究利用通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討新橙皮苷治療創(chuàng)傷性腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制,為后續(xù)藥物研發(fā)的開(kāi)展提供依據(jù)。
SPF 級(jí)SD 雄性大鼠72 只,體質(zhì)量(200±20)g,購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司,動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)SCXK(魯)20220006,此實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理批文號(hào)EC-022-206。
新橙皮苷(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥97%,批號(hào)N886330)購(gòu)于上海麥克林生化科技股份有限公司;ELISA 試劑盒購(gòu)自武漢菲恩生物科技有限公司;TUNEL 試劑盒購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司;PCR 引物購(gòu)自上海生工公司;RNA 提取及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)公司;倒置熒光顯微鏡成像系統(tǒng)購(gòu)自德國(guó)Carl Zeiss 公司,Quantitation DX 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀購(gòu)自美國(guó)ABI 公司。
1.3.1 新橙皮苷靶點(diǎn)的預(yù)測(cè) 使用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)、Pharmmapper數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)、BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/)和SwissTargetPrediction 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.swisstargetprediction.ch/),并查閱相關(guān)文獻(xiàn),對(duì)新橙皮苷的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè),在去重后,經(jīng)Uniprot 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.uniprot.org/)將靶點(diǎn)信息進(jìn)行規(guī)范化處理。
1.3.2 創(chuàng)傷性腦損傷靶點(diǎn)的收集 基于OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.omim.org/)和TCMIP 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.tcmip.cn/TCMIP/index.php)[12]、Drug Bank 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://go.drugbank.com/)、Pharmgkb數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.pharmgkb.org/)、TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)(http://db.idrblab.net/ttd/ )、GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/),以關(guān)鍵詞“traumatic brain injury”進(jìn)行檢索,獲得創(chuàng)傷性腦損傷的疾病靶點(diǎn),合并數(shù)據(jù)去重后,利用UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)將靶點(diǎn)信息進(jìn)行規(guī)范化處理。
1.3.3 蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和核心靶點(diǎn)篩選 使用Venny 2.1.0 獲得新橙皮苷、創(chuàng)傷性腦損傷的交集靶點(diǎn)并繪制Venn 圖,并導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cn.string-db.org/)中,設(shè)置種屬為“Home sapiens”,得到PPI 網(wǎng)絡(luò),利用Cytoscape 3.8.0的Network Analysis 插件對(duì)得到的PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?,?yīng)用CytoHubba 插件基于最大團(tuán)中心性(MCC)算法來(lái)確定PPI 排名前10 位的節(jié)點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)。
1.3.4 靶點(diǎn)基因本體(GO)功能與京都基因與基因組百科全書(shū)(KEGG)通路富集分析 利用David 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp),對(duì)新橙皮苷-創(chuàng)傷性腦損傷交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能與KEGG通路富集分析,設(shè)置物種為“Homo sapiens”,其中GO 功能分析包括生物功能(BP)、細(xì)胞成分(CC)、分子功能(MF)3 部分,將結(jié)果導(dǎo)入微生信軟件,畫(huà)圖并分析。
1.3.5 分子對(duì)接[13]驗(yàn)證新橙皮苷與核心靶點(diǎn)的結(jié)合能力 在PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取新橙皮苷的結(jié)構(gòu)式,將1.3.3 項(xiàng)下篩選的核心靶點(diǎn)作為分子對(duì)接的靶點(diǎn)蛋白,靶點(diǎn)蛋白結(jié)構(gòu)從PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)獲得PDB ID,在PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載蛋白3D 結(jié)構(gòu)。用Pymol和Autodock 軟件對(duì)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行去水、去配體、加氫、分配電荷處理,采用AutoDockTools 1.5.7 軟件完成分子對(duì)接,最后利用PyMol 軟件處理結(jié)果。
1.4.1 分組、造模與給藥 將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后,隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和新橙皮苷組,每組24 只。模型組和新橙皮苷組采用改良Feeney's 法造模,即沿頭部中線切開(kāi)皮膚,分離皮下組織暴露顱骨,定位右側(cè)中線旁2.5 mm,冠狀縫后1.5 mm處,使用顱骨磨鉆打開(kāi)直徑約5 mm 骨窗,保持硬腦膜完整,調(diào)節(jié)自由落體打擊裝置,對(duì)準(zhǔn)骨窗,于30 cm 處使用20 g 砝碼自由落體打擊骨窗,假手術(shù)組只頭皮切開(kāi)、游離骨膜、打開(kāi)骨窗,不進(jìn)行自由落體打擊。腦損傷大鼠出現(xiàn)短暫的呼吸暫停、四肢抽搐且昏迷2 h 以上者為造模成功[14]。新橙皮苷組于腦損傷后ip 生理鹽水稀釋的新橙皮苷40 mg/kg,給藥劑量參考文獻(xiàn)報(bào)道[11]設(shè)置,假手術(shù)組和模型組給予ip 等量的生理鹽水,1 次/d,共給藥7 d。
1.4.2 大鼠神經(jīng)功能評(píng)估 于造模后第1、2、3、5、7 天對(duì)各組大鼠采用神經(jīng)功能缺損(mNSS)法進(jìn)行評(píng)估,mNSS 評(píng)分包括運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、反射和平衡測(cè)試,評(píng)分越高表明大鼠神經(jīng)功能障礙越嚴(yán)重。
1.4.3 大鼠腦組織病理觀察 采用尼氏染色法進(jìn)行觀察。每組選取造模后3 d 大鼠5 只,ip 戊巴比妥鈉麻醉,用生理鹽水和4%多聚甲醛心臟灌注后斷頭取腦,用4%多聚甲醛固定液固定,石蠟包埋切片,行尼氏染色,鏡下觀察腦組織神經(jīng)元細(xì)胞病理形態(tài)學(xué),并拍照記錄。
1.4.4 大鼠腦組織凋亡細(xì)胞情況 采用TUNEL 染色法進(jìn)行觀察。取1.4.3 項(xiàng)下腦組織石蠟切片,參照TUNEL 試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行檢測(cè),依次采用TUNEL 反應(yīng)混合液、DAPI 染色,封片后使用熒光顯微鏡觀察損傷灶及周?chē)X組織并拍照,每張切片中隨機(jī)取6 個(gè)視野,使用Image J 圖像分析軟件計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞和總細(xì)胞(結(jié)果取平均值),計(jì)算凋亡率。
1.4.5 大鼠腦組織中炎癥因子含量測(cè)定 每組選取造模后3 d 大鼠5 只,ip 戊巴比妥鈉麻醉,斷頭取腦,取損傷灶及邊緣2 mm 區(qū)域,按照腦濕質(zhì)量與生理鹽水100 mg∶0.9 mL 的比例進(jìn)行組織勻漿,經(jīng)研磨儀破碎處理,離心后取其上清液,采用ELISA法檢測(cè)腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-1β 含量,具體操作參照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)。
1.4.6 qRT-PCR法檢測(cè)大鼠腦組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、酪氨酸蛋白激酶(SRC)、蛋白激酶B1(Akt1)mRNA 表達(dá)水平 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作從受損腦組織中提取RNA。經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增后,采用熒光定量PCR 儀(QuantStudio DX)進(jìn)行常規(guī)溶解曲線分析,測(cè)定Ct 值,采用2-ΔΔCt法計(jì)算各組目的基因的表達(dá)水平,結(jié)果以β-actin 作為內(nèi)參基因,引物序列見(jiàn)表1。
表1 PCR 引物序列Table 1 PCR primer sequence
1.4.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 結(jié)果采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析,計(jì)量資料采用表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)。
通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索并經(jīng)過(guò)查閱文獻(xiàn)報(bào)道[15]補(bǔ)充相關(guān)作用靶點(diǎn),比較分析去除重復(fù)值后獲得322 個(gè)作用靶點(diǎn)。
基于使用OMIM、TCMIP、DrugBank、TTD、GeneCards 等數(shù)據(jù)庫(kù),獲取創(chuàng)傷性腦損傷的作用靶點(diǎn),合并數(shù)據(jù)庫(kù)去除重復(fù)值后,獲得創(chuàng)傷性腦損傷疾病相關(guān)作用靶點(diǎn)1 470 個(gè)。
通過(guò)Venny 圖獲得新橙皮苷治療創(chuàng)傷性腦損傷的交集靶點(diǎn)85 個(gè),見(jiàn)圖1。利用Cytoscape 3.8.0 軟件構(gòu)建“新橙皮苷-靶點(diǎn)-創(chuàng)傷性腦損傷”關(guān)系網(wǎng)絡(luò),見(jiàn)圖2。
圖1 Venn 圖Fig.1 Venn diagram
圖2 新橙皮苷-靶點(diǎn)-創(chuàng)傷性腦損傷復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Neohesperidin -target-traumatic brain injury complex network
將85 個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖3,該網(wǎng)絡(luò)共有85 個(gè)節(jié)點(diǎn)和362 條邊,使用Cytoscape 3.8.0 的CytoHubba 插件基于MCC 算法來(lái)確定PPI 排名前10 位的節(jié)點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)有基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)、環(huán)加氧酶2(PTGS2)、過(guò)氧化物酶體增殖激活受體γ(PPARG)、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)8、IL-6、SRC、MAPK14、TNF、Akt1,見(jiàn)圖4。
圖3 交集靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 PPI network diagram of intersection target
圖4 核心靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Core target PPI network diagram
GO 富集分析結(jié)果表明,CC 主要涉及質(zhì)膜、胞外區(qū)、膜筏;生物過(guò)程主要涉及對(duì)細(xì)胞凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控、對(duì)異種刺激的反應(yīng)、蛋白水解作用;MF 主要涉及相同蛋白結(jié)合、酶結(jié)合、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白激酶活性,根據(jù)Count 值篩選出每個(gè)模塊的前10 個(gè)項(xiàng)目,并將其可視化,見(jiàn)圖5。
圖5 GO 功能富集分析Fig.5 GO functional enrichment analysis histogram
KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示,新橙皮苷治療創(chuàng)傷性腦損傷的關(guān)鍵靶點(diǎn)可能主要集中在內(nèi)分泌抵抗、VEGF 信號(hào)通路、TNF 通路、Rap1 信號(hào)通路等,其可能主要通過(guò)抗炎、抗凋亡途徑起到保護(hù)神經(jīng)作用,根據(jù)P值選出前20 項(xiàng)結(jié)果,并繪制氣泡圖,見(jiàn)圖6。
圖6 KEGG 通路富集分析Fig.6 KEGG pathway enrichment analysis bubble diagram
將新橙皮苷與10 個(gè)核心靶點(diǎn)分別進(jìn)行分子對(duì)接。分子對(duì)接的穩(wěn)定性一般通過(guò)結(jié)合能的大小來(lái)體現(xiàn),結(jié)合能越小,結(jié)合兩者的能量所需越少,結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定。當(dāng)結(jié)合能小于-5.0 kcal/mol(1cal=4.2 J)表示具有較好的結(jié)合能力,結(jié)果表明,新橙皮苷與10 個(gè)核心靶點(diǎn)之間結(jié)合活性良好,見(jiàn)表2,提示新橙皮苷可能通過(guò)作用于以上10 個(gè)核心靶點(diǎn)發(fā)揮治療創(chuàng)傷性腦損傷的作用,見(jiàn)圖7。
圖7 新橙皮苷與核心靶蛋白的分子對(duì)接圖Fig.7 Molecular docking diagram of neohesperidin and core target protein
表2 新橙皮苷與核心靶點(diǎn)的結(jié)合能Table 2 Binding energy between neohesperidin and core target
2.7.1 大鼠mNSS 評(píng)分 在第1~7 天,相較于假手術(shù)組,模型組大鼠mNSS 評(píng)分顯著升高(P<0.05),在第2~7 天時(shí),與模型組比較,新橙皮苷組大鼠mNSS 評(píng)分均顯著降低(P<0.05),見(jiàn)表3。
表3 各組大鼠神經(jīng)功能缺損mNSS 評(píng)分(,n =6)Table 3 mNSS score for neurological deficits in each group of rats (,n =6)
表3 各組大鼠神經(jīng)功能缺損mNSS 評(píng)分(,n =6)Table 3 mNSS score for neurological deficits in each group of rats (,n =6)
與假手術(shù)組比較:*P<0.05;與模型組比較:#P<0.05。*P < 0.05 vs sham-operation group;#P < 0.05 vs model group.
2.7.2 大鼠腦組織病理學(xué)變化 給藥3 d 后,尼氏染色顯示,假手術(shù)組神經(jīng)元細(xì)胞排列有序,細(xì)胞形態(tài)規(guī)則,染色較淡,核仁明顯;模型組腦組織損傷灶神經(jīng)元細(xì)胞排列紊亂而稀松,細(xì)胞固縮,神經(jīng)元數(shù)量減少;新橙皮苷組正常形態(tài)細(xì)胞較多,排列相對(duì)規(guī)則,固縮減輕,神經(jīng)元細(xì)胞及尼氏小體數(shù)量顯著增加,見(jiàn)圖8。
圖8 新橙皮苷對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷大鼠腦組織損傷灶病理變化的影響(尼氏染色,×400)Fig.8 Effect of neohesperidin on pathological changes of brain tissue injury foci in traumatic brain injury rats(Niss staining,×400)
2.7.3 大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況 給藥3 d 后,相較于假手術(shù)組,模型組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡率明顯上調(diào)(P<0.05),與模型組比較,新橙皮苷組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡率的顯著降低(P<0.05),見(jiàn)圖9、10。
圖9 給藥3 d 后各組大鼠腦組織損傷灶神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況(Tunel,×400)Fig.9 Neurocell apoptosis in the injury foci of rat brain tissue in each group after 3 d of drug administration(Tunel staining,×400)
圖10 各組大鼠腦組織損傷灶神經(jīng)元凋亡率Fig.10 Neuronal apoptosis rate of brain tissue injury lesion
2.7.4 大鼠腦組織炎癥因子含量比較 與假手術(shù)組相比,模型組大鼠損傷灶中炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α 的含量顯著升高(P<0.05),相較于模型組,新橙皮苷組大鼠損傷灶中炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α 的含量明顯下降(P<0.05),見(jiàn)圖11。
圖11 各組大鼠腦組織中IL-6、IL-1β、TNF-α 含量(,n =6)Fig.11 Levels of IL-6,IL-1β,and TNF-α in the brain tissue of rats in each group (,n =6)
2.7.5 大鼠腦組織VEGF、SRC、AKT1mRNA 表達(dá)量的比較 給藥3 d 后,相較于假手術(shù)組,模型組大鼠腦組織中SRC、Akt1mRNA 表達(dá)水平均顯著下調(diào),而VEGFmRNA 表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05),與模型組相比較,新橙皮苷組大鼠腦組織中VEGF、SRC、AKT1mRNA 表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05),見(jiàn)圖12。
圖12 新橙皮苷治療對(duì)大鼠腦組織VEGF、SRC、AKT1 mRNA 表達(dá)量的影響(,n =6)Fig.12 Effect of neohesperidin treatment on the expression of VEGF,SRC,and Akt1 mRNA in rat brain tissue (,n =6)
目前,創(chuàng)傷性腦損傷已成為全球第3 大死因[16]。全球每年有超過(guò)5 000 萬(wàn)人患有不同程度的創(chuàng)傷性腦損傷[17]。嚴(yán)重的創(chuàng)傷性腦損傷會(huì)導(dǎo)致癡呆、長(zhǎng)期殘疾或死亡,并且預(yù)后不良,給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[18]。創(chuàng)傷性腦損傷包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷。其中,由機(jī)械力造成的原發(fā)性神經(jīng)損傷通常為難逆甚至不可逆。因此,如何早期減輕繼發(fā)性腦損傷具有非常重要的意義[19]。本研究為探討新橙皮苷治療創(chuàng)傷性腦損傷的作用機(jī)制,通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選出新橙皮苷的主要作用靶點(diǎn),并應(yīng)用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了篩選的預(yù)測(cè)結(jié)果。
通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)篩選并驗(yàn)證了10 個(gè)核心靶基因,包括MMP9、PTGS2、PPARG、EGFR、MAPK8、IL-6、SRC、MAPK14、TNF、Akt1等,其中MMP9與腦水腫發(fā)生密切相關(guān),過(guò)度表達(dá)可導(dǎo)致血腦屏障通透性增加,加重腦水腫[20]。PTGS2 可將花生四烯酸轉(zhuǎn)化為生物活性前列腺素,腦損傷后急性炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮核心作用[21]。PPARG 具有保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用,表現(xiàn)為抑制炎癥、抑制神經(jīng)元凋亡、保護(hù)血腦屏障等[22]。EGFR信號(hào)通路激活,引起小膠質(zhì)細(xì)胞活化,產(chǎn)生IL-6、IL-1β 和TNF-α 等炎癥因子,從而加速神經(jīng)細(xì)胞損傷[23]。MAPK8 又稱(chēng)為JNK,屬于MAPK 家族,在炎癥與細(xì)胞凋亡等應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[24]。IL-6 在創(chuàng)傷性腦損傷后炎癥反應(yīng)、神經(jīng)創(chuàng)傷修復(fù)等方面起著重要作用,研究表明,IL-6 作為變化指標(biāo)能提高對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷不良預(yù)后的預(yù)測(cè)特異性和敏感性[25]。SRC 是一種非受體蛋白酪氨酸激酶,可調(diào)節(jié)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶,繼而發(fā)揮腦保護(hù)作用[26]。MAPK14 是MAPKs 超家族的一員,在顱腦創(chuàng)傷后病情發(fā)展的信號(hào)傳遞過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[27]。Akt1 可以通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡過(guò)程參與細(xì)胞存活途徑,可以阻止細(xì)胞凋亡從而促進(jìn)細(xì)胞存活[28]。TNF是重要的免疫調(diào)節(jié)和炎癥因子,參與創(chuàng)傷性腦損傷后炎癥反應(yīng)等過(guò)程[29],TNF-α 在腦組織中高表達(dá)具有神經(jīng)毒性,可加速神經(jīng)細(xì)胞的死亡[30]。GO 生物過(guò)程富集分析結(jié)果顯示,新橙皮苷可能通過(guò)對(duì)細(xì)胞凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信號(hào)的正調(diào)控過(guò)程、蛋白水解作用參與生物過(guò)程。KEGG 通路富集分析發(fā)現(xiàn),新橙皮苷可能主要通過(guò)抗凋亡、抗炎等途徑治療創(chuàng)傷性腦損傷,保護(hù)神經(jīng)功能,主要涉及VEGF 信號(hào)通路、Rap1 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路等。新橙皮苷與MMP9、EGFR、MAPK8、IL-6、TNF、Akt1 等10 個(gè)核心靶點(diǎn)均具有較好的結(jié)合活性及穩(wěn)定性,具有良好的親和力。上述核心靶點(diǎn)與VEGF 信號(hào)通路明顯相關(guān),表明新橙皮苷可能通過(guò)VEGF 信號(hào)通路治療創(chuàng)傷性腦損傷。研究發(fā)現(xiàn),VEGF 信號(hào)通路在血管新生、血管通透性、增強(qiáng)神經(jīng)元細(xì)胞的再生與分化等方面發(fā)揮重要作用[31]。據(jù)報(bào)道,發(fā)生創(chuàng)傷性腦損傷后,腦組織損傷區(qū)域VEGF 表達(dá)上調(diào),促進(jìn)微血管發(fā)生,改善損傷大腦缺血缺氧狀態(tài),促進(jìn)腦損傷神經(jīng)修復(fù)。并且VEGF 可以通過(guò)參與損傷血管的修復(fù)與再生,可以加快損傷區(qū)域腦組織新血管的形成及微環(huán)境的構(gòu)建,從而達(dá)到修復(fù)受損神經(jīng)組織的目的[32]。SRC為VEGF 通路的下游基因。SRC 蛋白激活后會(huì)進(jìn)一步促使PI3K/Akt 通路激活[33],在PI3K 通路中,PI3K 激活后誘導(dǎo)Akt 自身磷酸化,來(lái)調(diào)節(jié)下游底物表達(dá),如Foxo、Caspase-9、mTOR 等,通過(guò)激活數(shù)個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮多重生物學(xué)效應(yīng),包括抗氧化、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、抗炎、抗凋亡等作用。基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果,通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明,新橙皮苷治療可以改善神經(jīng)功能缺損,減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷,抑制細(xì)胞凋亡,并且顯著抑制創(chuàng)傷性腦損傷大鼠腦組織中炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α 的表達(dá),同時(shí)明顯上調(diào)VEGF、SRC、Akt1mRNA 表達(dá)水平,從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。
綜上所述,本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)初步預(yù)測(cè)了新橙皮苷治療創(chuàng)傷性腦損傷關(guān)鍵靶點(diǎn)及通路。新橙皮苷可能通過(guò)MMP9、PTGS2、PPARG、EGFR、MAPK8、IL-6、SRC、MAPK14、TNF、Akt1 等核心靶點(diǎn),通過(guò)干預(yù)VEGF信號(hào)通路、TNF 通路、Rap1 信號(hào)通路等通路,進(jìn)而發(fā)揮治療創(chuàng)傷性腦損傷的作用,本研究可為新橙皮苷治療創(chuàng)傷性腦損傷的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)及臨床研究提供參考,但相關(guān)研究結(jié)果仍有待進(jìn)一步的生物學(xué)驗(yàn)證。
利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突