龐華 智靜濤 邊建華 劉文杰

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,近年來發(fā)病率呈上升趨勢,男性發(fā)病率高于女性,中老年群體發(fā)病率高于年輕群體,手術、化療和免疫治療是主要治療方法,但會導致其預后不良,且復發(fā)率高[1-2]。因此,尋找新的有效的治療手段迫在眉睫。中醫(yī)藥具有增效減毒作用,在治療腫瘤方面應用越來越廣。膀胱癌屬尿血、血淋及癃閉范疇,以止血涼血、瀉火清熱和散結利濕治療為主[3]。

銀杏內(nèi)酯B 是一種從銀杏葉中提取的二萜內(nèi)酯,具有抗氧化、抗炎、清除自由基功效,此外銀杏內(nèi)酯B還有抗腫瘤活性,能有效抑制腫瘤細胞增殖,誘導其凋亡,還可提高化療藥物的有效性,降低耐藥發(fā)生,增強放療敏感性[4]。Wang等[5]報道銀杏內(nèi)酯B通過beclin-1依賴性自噬抑制肺癌細胞增殖,銀杏內(nèi)酯B 還可誘導人結腸癌SW480 細胞的凋亡[6],銀杏內(nèi)酯B還可以通過上調mi R-223-3p抑制ZEB1蛋白翻譯,從而抑制膀胱癌細胞的侵襲性[7],但其抗癌的作用機制尚不完全明確。

核轉錄因子-κB(nuclear transcription f actor-Κb,NF-κB)通路是活化的NF-κB 進入細胞核內(nèi)與DNA 結合,通過調控靶基因的轉錄,參與多種腫瘤增殖、凋亡等生物學行為,當外界刺激導致NF-κB通路被激活時,IKK 將NF-κB 家族的抑制蛋白IκB磷酸化,從而抑制蛋白失去活性,進一步導致NFκB核轉錄因子發(fā)生解離后進入細胞核后并且發(fā)揮對應的生物學機制[8-9]。據(jù)報道,苦參堿通過抑制toll樣受體4(toll-like receptor,TLR4)/NF-κB 通路減弱膀胱癌小鼠模型的腫瘤生長和誘導凋亡[10],但銀杏內(nèi)酯B 是否可以通過調控NF-κB 信號通路影響膀胱癌J82細胞的生物學行為尚未可知?；诖?本研究探討銀杏內(nèi)酯B干預對J82細胞增殖、凋亡的影響以及對NF-κB信號通路的調控機制,可為膀胱癌的治療研究提供新的理論參考?，F(xiàn)報告如下。

材料與方法

一、材料

人膀胱移行細胞癌細胞(J82)購自上海賽百慷生物技術股份有限公司。銀杏內(nèi)酯B、紫杉醇購自上海源葉生物科技有限公司,純度≥98%,NF-κB通路抑制劑BAY 11-7082購自上海源葉生物科技有限公司,純度≥99%,NF-κB 信號通路激活劑Prostratin購自Aladdin公司,純度≥98%,胎牛血清和高糖DMEM 培養(yǎng)液購自美國Gibco 公司,CCK-8試劑盒購自上海翌圣生物科技有限公司,5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷(5-et hynyl-2′-deoxyuridine,Ed U)細胞增殖檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司,Hoechst 33258 染色試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司,逆轉錄試劑盒、SYBR Pre mix Ex TaqⅡ試劑盒購自杭州主諾生物技術有限公司,RIPA 裂解液購自美國abw 公司,二喹啉甲酸蛋白試劑盒購自英國Abca m 公司,鼠抗人[IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65、Caspase-3、D1及β-actin一抗、辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠Ig G(二抗)購自美國CST 公司。

MF52-N 型倒置熒光顯微鏡購自廣州市明美光電技術有限公司;H WO301型二氧化碳培養(yǎng)箱購自美國FORMA 公司;Multiskan Ascent型酶標儀購自美國Ther mo公司;7500 型實時熒光定量PCR儀器購自美國ABI公司,Gel Doc 2000型凝膠成像系統(tǒng)購自美國Back man公司。

二、實驗方法

1.人膀胱癌J82細胞培養(yǎng):在37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),將人膀胱癌J82 細胞培養(yǎng)于高糖DMEM 培養(yǎng)液(含10%胎牛血清,1%青-鏈霉素)中,待細胞貼壁達80%以上時進行細胞傳代,取第4代對數(shù)期生長J82細胞用于實驗。

2.分組及給藥:選取第4代對數(shù)期生長的膀胱癌J82細胞,調整密度至2×105個/ml,接種到96孔板中,每孔100μl。將膀胱癌J82細胞分為①對照組、低/中/高濃度實驗組和陽性藥物組;②對照組、銀杏內(nèi)酯B組、激活劑組和抑制劑組,對照組細胞不做干預,低/中/高濃度實驗組分別加入5、10和20μmol/L銀杏內(nèi)酯B[11]進行干預,陽性藥物組用100 n mol/L 紫杉醇[12]進行干預,銀杏內(nèi)酯B組是用20μmol/L銀杏內(nèi)酯B進行干預,激活劑組是在20μmol/L銀杏內(nèi)酯B 基礎上加入1μmol/L NFκB通路激活劑Prostratin,抑制劑組是在20μmol/L銀杏內(nèi)酯B基礎上加入5μmol/L NF-κB通路抑制劑BAY 11-7082,干預24 h。每組設置3個復孔,后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3.CCK-8法測定J82細胞的活力:細胞分組與給藥方法同上,選取第4代對數(shù)期生長的細胞,調整密度至2×105個/ml,接種到96 孔板中,每孔加100μl,實驗重復3 次。各組干預24 h 后,加 入CCK-8溶液10μl,繼續(xù)孵育2 h,使用酶標儀測定各組光密度(OD)值(450 n m)。細胞活力=(低/中/高濃度實驗組或陽性藥物組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)×100%。

4.Ed U 法測定J82細胞的增殖能力:細胞分組與給藥方法同上,干預24 h后,收集細胞,用完全細胞培養(yǎng)液重懸,以2×105個/孔的密度接種于12孔板,于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,進行Ed U 處理,去除培養(yǎng)液,用0.5 ml 4%多聚甲醛固定,室溫15 min,再用0.5 ml 3%BSA 洗滌3次;用0.5 ml 0.3%Triton X-100去除BSA,室溫10 min,再用BSA 洗滌3次;12孔板中每孔加200μl Click反應液,室溫避光孵育30 min,3%BSA 洗滌3次去除Click反應液;每孔加入0.5 ml Hoechst,室溫避光孵育10 min;再用3%BSA 洗滌3次去除Hoechst;裝片,熒光顯微鏡拍照,再用I mage J軟件處理圖片。Ed U 陽性染色細胞(紅色)占總細胞(藍色)的百分比表示細胞增殖率。

5.Hoechst 33258染色法測定J82細胞凋亡情況:細胞分組與給藥方法同上,干預24 h后,將J82細胞接種到12 孔板中,每孔加約2×105個細胞,PBS洗滌細胞2次(每次5 min)加入新鮮配置4%多聚甲醛,4℃固定10 min。PBS洗滌3次(5 min/次),加Hoechst 33258染液(5 mg/L)10μl/孔,避光孵育10 min,PBS洗滌3次(5 min/次),封固后,用熒光顯微鏡對細胞凋亡情況進行拍照。凋亡細胞的形態(tài)特征是細胞核染色不均濃染且所發(fā)熒光較強,呈亮藍色。I mage-J圖像分析軟件計算凋亡細胞數(shù)。細胞凋亡率= 凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

6.RT-qPCR 測 定J82 細 胞 中Cyclin D1 和Caspase 3 mRNA 相對表達量:細胞分組與給藥方法 同上,干 預24 h 后,將J82 細 胞 接 種 到12 孔 板中,每孔加約2×105個細胞,Trizol試劑盒提取總RNA,按逆轉錄試劑盒說明進行逆轉錄反應,獲取c DNA 模版。參照SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒說明書進行RT-q PCR 擴增。反應條件為:94℃預變性5 min;94℃變性35 s,58℃退火35 s,72℃延伸35 s,設置40 次循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參,2-△△CT法計算Cyclin D1和Caspase 3相對表達量。引物序列見表1。

表1 RT-q PCR 引物序列

7.Western blotting 法 檢 測J82 細 胞 中Caspase-3、Cyclin D1和NF-κB 通路相關蛋白的表達水平:細胞分組與給藥方法同上,干預24 h時,收集各組細胞于RIPA 液在冰上進行裂解,4℃、12 000 r/min 離心20 min,取上清進行蛋白變性后,制膠,上樣,進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠電泳,300 mA 恒流轉聚偏二氟乙烯膜,使用5%脫脂牛奶封閉2 h,然后參照抗體說明書加入一定稀釋比例的一抗(IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65、Caspase-3、Cyclin D1及β-actin),4℃孵育過夜,TBST 洗滌3次后加入辣根過氧化物酶標記山羊抗鼠Ig G 二抗,孵育2 h 后棄去液體,TBST 洗滌3次,最后加顯影液,使用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。蛋白灰度值用G 表示,蛋白相對表達量=G目的蛋白/G內(nèi)參蛋白(β-actin)。

三、統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計分析,符合正態(tài)分布且方差齊性,數(shù)據(jù)以(±s)表示。多組間比較采用單因素方差分析法,進一步兩組間比較Dunnett'st檢驗,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。使用Graph Pad Pris m 8軟件進行作圖,I mage J計算細胞增殖、凋亡細胞數(shù)和蛋白灰度值。

結 果

一、銀杏內(nèi)酯B抑制J82細胞的活力和增殖誘導其凋亡

分別使用CCK-8、Ed U 和Hoechst法檢測銀杏內(nèi)酯B對J82細胞活力、增殖和凋亡的影響(圖1～圖3),實驗結果顯示,干預24 h時,對照組、低/中/高濃度實驗組和陽性藥物組的細胞活力分別為(100±8.61)%、(90.97±5.94)%、(83.84±5.20)%、(68.13±4.29)%、(67.17±3.90)%,細胞增殖率分別為(38.76±1.47)%、(33.27±3.58)%、(28.93±2.51)%、(20.20±2.89)%、(18.20±3.36)%,細胞凋亡率分別為(1.72±0.55)%、(2.82±0.41)%、(7.49±1.76)%、(12.16±1.93)%、(12.17±1.41)%,各組細胞活力、細胞增殖率、細胞凋亡率之間均差異有統(tǒng)計學意義(F活力=18.084、F增殖=27.604、F凋亡=39.829,均P<0.001)。與對照組相比,低/中/高濃度實驗組和陽性藥物組細胞活力和增殖率降低,細胞凋亡率升高,其中低濃度實驗組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),中/高濃度實驗組和陽性藥物組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與陽性藥物組相比,低/中/高濃度實驗組細胞活力和增殖率升高,細胞凋亡率降低,其中高濃度實驗組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),低/中濃度實驗組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),所以選擇與陽性藥物組效果相當?shù)母邼舛葘嶒灲M加上NF-κB 通路激活劑和抑制劑分別作為激活劑組和抑制劑組進行后續(xù)通路的驗證實驗。

圖1 銀杏內(nèi)酯B對J82細胞活力的影響

圖2 銀杏內(nèi)酯B對J82細胞增殖的影響

圖3 銀杏內(nèi)酯B對J82細胞凋亡的影響

二、銀杏內(nèi)酯B通過抑制NF-κB 通路抑制J82細胞的活力和增殖誘導其凋亡

為了驗證銀杏內(nèi)酯B 是否通過NF-κB 通路影響J82細胞的活力、增殖和凋亡,在20μmol/L銀杏內(nèi)酯B基礎上加入NF-κB 通路抑制劑和激活劑作為激活劑組和抑制劑組,結果顯示,對照組、銀杏內(nèi)酯B 組、激活劑組、抑制劑組的細胞活力分別為(100.27±6.35)%、(61.58±7.24)%、(86.06±9.26)%、(34.21±8.77)%,細胞增殖率分別為(38.76±2.46)%、(25.87±2.16)%、(33.27±3.58)%、(18.38±1.68)%,細胞凋亡率分別為(1.72±0.55)%、(12.16±1.93)%、(7.42±1.31)%、(24.67±2.70)%,各組細胞活力、細胞增殖率、細胞凋亡率之間均差異有統(tǒng)計學意義(F活力=39.544、F增殖=35.825、F凋亡=87.829,均P<0.001)。與銀杏內(nèi)酯B 組相比,激活劑組細胞活力和增殖率顯著升高,細胞凋亡率顯著降低,而抑制劑組細胞活力和增殖率顯著降低,細胞凋亡率顯著升高(P<0.05),見圖4～6。

圖4 銀杏內(nèi)酯B通過NF-κB通路對J82細胞活力的影響

圖5 銀杏內(nèi)酯B通過NF-κB通路對J82細胞增殖的影響

圖6 銀杏內(nèi)酯B通過NF-κB通路對J82細胞凋亡的影響

三、銀杏內(nèi)酯B通過抑制NF-κB 通路抑制J82細胞Cyclin D1表達誘導Caspase-3表達

分別用RT-qPCR 和Wester n bl otting 法對Caspase-3和Cyclin D1 mRNA 和蛋白表達水平進行檢測,結果如圖7所示,對照組、銀杏內(nèi)酯B 組、激活劑組、抑制劑組細胞中Caspase-3 mRNA 表達水平分別為(1.00±0.04)、(1.76±0.16)、(1.10±0.06)、(2.27±0.21),Cyclin D1 mRNA 表達水平分別為(1.00±0.04)、(0.49±0.08)、(0.78±0.07)、(0.22±0.03),Caspase-3蛋白表達水平分別為(0.64±0.03)、(1.01±0.1)、(0.76±0.09)、(1.32±0.11),Cyclin D1 蛋白表達水平分別為(1.04±0.04)、(0.58±0.06)、(0.87±0.05)、(0.26±0.04),各組Caspase-3、Cyclin D1 mRNA 和蛋白表達水平之間均差異有統(tǒng)計學意義(FCaspase-3mRNA=56.944、FCyclinD1mRNA= 100.543、FCaspase-3蛋白=34.916、FCyclinD1蛋白=151.344,均P<0.001)。與對照組相比,銀杏內(nèi)酯B 組Caspase-3 mRNA 和蛋白表達水平顯著升高,而Cyclin D1 mRNA 和蛋白表達水平顯著降低(P<0.05);與銀杏內(nèi)酯B組相比,激活劑組Caspase-3 mRNA 和蛋白表達水平顯著降低,而Cyclin D1 mRNA 和蛋白表達水平顯著升高(P<0.05),與之相反,抑制劑組Caspase-3 mRNA 和蛋白表達水平顯著升高,Cyclin D1 mRNA和蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。

圖7 銀杏內(nèi)酯B通過NF-κB通路對J82細胞Caspase-3和Cyclin D1表達水平的影響

四、銀杏內(nèi)酯B抑制J82細胞NF-κB通路的活化

為了確定銀杏內(nèi)酯B 對NF-κB 信號通路活化狀態(tài)的影響,本研究檢測了該通路的關鍵性蛋白IκBα、p-IκBα、NF-κB p65和p-NF-κB p65的表達水平(圖8 A),蛋白定量分析結果顯示(圖8B),對照組、銀杏內(nèi)酯B組、激活劑組、抑制劑組細胞中IκBα蛋白表達水平分別為(0.39±0.01)、(0.39±0.01)、(0.43±0.02)、(0.44±0.04),p-IκBα蛋白表達水平分別為(0.70±0.05)、(0.47±0.04)、(0.66±0.07)、(0.31±0.04),NF-κB p65蛋白表達水平分別為(0.83±0.04)、(0.82±0.02)、(0.80±0.06)、(0.86±0.05),p-NF-κB p65蛋白表達水平分別為(1.05±0.07)、(0.76±0.07)、(1.04±0.10)、(0.43±0.02),各組IκBα和NF-κB p65蛋白表達水平之間差異無統(tǒng)計學意義(FIκBα=3.773,PIκBα=0.059;FNF-κBp65=0.926,PNF-κBp65=0.471);各組p-IκBα和p-NF-κB p65蛋白表達水平之間均差異有統(tǒng)計學意義(Fp-IκBα=36.868、Fp-NF-κBp65=50.891,均P<0.001)。與對照組相比,銀杏內(nèi)酯B組p-IκBα和p-NF-κB p65蛋白表達水平顯著降低(P<0.05);與銀杏內(nèi)酯B 組相比,激活劑組p-IκBα 和p-NF-κB p65蛋白表達水平顯著升高(P<0.05),而抑制劑組p-IκBα和p-NF-κB p65蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。

圖8 銀杏內(nèi)酯B對J82細胞NF-κB信號通路相關蛋白表達的影響

討 論

膀胱癌是一種常發(fā)生于男性老年群體的惡性腫瘤,隨著老齡化出現(xiàn)發(fā)病率也在逐漸上升,目前治療膀胱癌的方法仍是手術、放化療,但治療效果不理想,治療后病情易反復甚至加劇,且患者生活質量低下[13-14],開發(fā)新的藥物尤為迫切。中醫(yī)藥可降低手術創(chuàng)傷及毒副作用,中醫(yī)學認為膀胱癌發(fā)病機理與濕熱久郁、膀胱熱度郁結相關,當以養(yǎng)陰益氣為主,配合利濕[15]。銀杏內(nèi)酯B 是銀杏葉提取物的主要活性成分,目前已被用作抗癌劑,例如王懷安等[16]證明了銀杏內(nèi)酯B 可以用于治療多種惡性腫瘤,Kawasaki等[17]研究發(fā)現(xiàn)銀杏內(nèi)酯B可以增強口腔癌患者的化療效果,Zhi等[18]報道銀杏內(nèi)酯B 可抑制膀胱癌細胞的侵襲能力,說明銀杏內(nèi)酯B具有抑癌作用,然而,其對膀胱癌的抑癌作用機制仍尚不完全清楚,因此本實驗研究了銀杏內(nèi)酯B對膀胱癌細胞的惡性生物學行為,并發(fā)現(xiàn)與對照組相比,中/高濃度實驗組和陽性藥物組細胞活力、增殖率顯著降低,細胞凋亡率顯著升高,提示中/高濃度實驗組可抑制J82細胞增殖促進J82細胞凋亡;與陽性藥物組相比,低/中/高濃度實驗組細胞活力和增殖率升高,細胞凋亡率降低,但高濃度實驗組差異無統(tǒng)計學意義,說明了高濃度實驗組與陽性藥物組對J82細胞的抑增殖和促凋亡作用相當,所以選擇高濃度實驗組進行后續(xù)通路驗證實驗,以上結果證明了銀杏內(nèi)酯B可以抑制J82細胞的增殖促進其凋亡,有良好的醫(yī)學前景。腫瘤生長是細胞過度增殖和逃避凋亡的結果。Cyclin D1是一種在細胞周期進程中起關鍵作用的細胞周期蛋白依賴性激酶調節(jié)蛋白,可作為膀胱癌的增殖標志物[19]。Caspase-3的過表達被認為與膀胱組織的腫瘤發(fā)生和凋亡密切相關[20]。Cyclin D1 和Caspase-3 作為膀胱癌增殖和凋亡標志性蛋白,在膀胱癌細胞增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用,因此,我們檢測了Caspase-3 和Cyclin D1 的mRNA 和蛋白表達,結果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,銀杏內(nèi)酯B組Caspase-3 mRNA 和蛋白表達水平顯著升高,而Cyclin D1 mRNA 和蛋白表達水平顯著降低,提示銀杏內(nèi)酯B可以抑制J82細胞的Cyclin D1表達,促進Caspase-3表達。綜上,銀杏內(nèi)酯B可能是通過下調Cyclin D1、上調Caspase-3 來抑制J82細胞的增殖促進其凋亡的。

NF-κB通路已廣泛參與癌癥的發(fā)展和進展,可參與調控多種癌細胞生長和分化[21]。靜息狀態(tài)下,存在于胞漿中,與IκBα結合,當炎癥或惡性行為發(fā)生時,特異性激酶可將IκBα磷酸化使其快速被蛋白小體降解,NF-KB 與IκB 解離并釋出,進入細胞核與靶基因啟動子區(qū)特定結合序列結合,增加相關基因轉錄速度。而銀杏內(nèi)酯B 具有抗炎和抗癌等生物活性,可抑制炎性介質釋放和腫瘤細胞的遷移、侵襲,從而阻斷NF-KB 通路的活化。因此,抑制NFKB為抗炎藥銀杏內(nèi)酯B 重要的作用靶點。NF-κB信號通路還參與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展,阻斷NF-k B可抑制膀胱癌的生長[22]。盧友路[23]報道尼古丁通過激活NF-κB通路促進膀胱癌細胞增殖、遷移和侵襲,還有研究表明,銀杏內(nèi)酯通過抑制NF-κB 信號通路對阿爾茨海默病細胞具有保護作用[24],銀杏內(nèi)酯B通過抑制NF-κB 信號通路抑制小膠質細胞的活化[25]。但關于銀杏內(nèi)酯B 對膀胱癌細胞中NFκB信號通路的調控作用未見報道,因此本研究分析了銀杏內(nèi)酯B對NF-κB通路關鍵蛋白的表達水平,結果顯示,與對照組相比,銀杏內(nèi)酯B 組p-IκBα和p-NF-κB p65蛋白表達水平顯著降低,提示銀杏內(nèi)酯B可能抑制了NF-κB 通路的信號轉導,與王瑾等[26]的研究相符。也進一步驗證了NF-k B 通路在各種細胞進程中起重要作用。在銀杏內(nèi)酯B 組中加入NF-κB 信號通路抑制劑和激活劑進行NF-κB通路驗證實驗,發(fā)現(xiàn)與銀杏內(nèi)酯B 組相比,激活劑組細胞凋亡率及Caspase-3 mRNA 和蛋白表達水平顯著降低,細胞活力、增殖率、Cyclin D1 mRNA和蛋白以及p-IκBα、p-NF-κB p65蛋白表達水平顯著升高,抑制劑組的這些指標變化趨勢與激活劑組相反,提示銀杏內(nèi)酯B是通過抑制NF-κB信號通路下調Cyclin D1、上調Caspase-3進而抑制細胞的增殖誘導其凋亡。

綜上所述,銀杏內(nèi)酯B 可抑制人膀胱癌J82細胞增殖促進其凋亡,其作用機制與抑制NF-κB信號通路的活化有關。本研究從細胞功能方面揭示了銀杏內(nèi)酯B對人膀胱癌系J82細胞增殖和凋亡的作用以及在NF-κB信號通路上的機制研究,但是本文僅在NF-κB信號通路上進行分析,是否存在其他通路參與膀胱癌的生物學過程還未研究。