康澤輝，孫麗娟，鄭桂玲，張 曉

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山東青島 266109）

0 引言

普通昆蟲學(xué)是植物保護(hù)專業(yè)的入門課程，是學(xué)習(xí)昆蟲學(xué)的基礎(chǔ)，也為后續(xù)多門課程打下重要基礎(chǔ)，是植物保護(hù)專業(yè)高水平、高質(zhì)量人才培養(yǎng)的關(guān)鍵課程之一［1-2］。該門課程具有很強(qiáng)的實(shí)踐性，通過實(shí)驗(yàn)教學(xué)可以使學(xué)生深入了解理論知識，同時也能提高實(shí)驗(yàn)技能和科研能力［3］。隨著科技的發(fā)展，昆蟲學(xué)研究的方法和技術(shù)也在不斷更新和發(fā)展，然而，在實(shí)際的教學(xué)過程中，很多實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容都比較傳統(tǒng)，尤其是分類學(xué)部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容比較單一，缺乏創(chuàng)新性和前沿性，嚴(yán)重限制了學(xué)生對昆蟲學(xué)研究的探索和發(fā)展［4-6］。

DNA條形碼技術(shù)是一種基于DNA 序列的物種鑒定方法，該方法可以應(yīng)用于各種生物樣本，只需極少量的樣本即可獲得高保真度的DNA條形碼序列，而且處理過程簡單、速度快，可以實(shí)現(xiàn)高精度的物種鑒定。此外，DNA條形碼技術(shù)具有高度的可重復(fù)性和可比性，不受環(huán)境因素的影響，具有較高的鑒定準(zhǔn)確性［7］。DNA條形碼技術(shù)在人們的生產(chǎn)生活各個領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用，隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和應(yīng)用的不斷拓展，DNA條形碼技術(shù)將會在未來的研究和應(yīng)用中發(fā)揮更加重要的作用。因此，在普通昆蟲學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中融入DNA條形碼技術(shù)非常必要。

昆蟲分類是普通昆蟲學(xué)課程的重要組成部分，也是教學(xué)中的重點(diǎn)和難點(diǎn)，這方面的教學(xué)交流和研討一直是一個熱點(diǎn)。此前的很多研究圍繞提高標(biāo)本質(zhì)量、運(yùn)用多媒體技術(shù)、改革教學(xué)模式（如翻轉(zhuǎn)課堂、互動教學(xué)）等方面提出了很多建議［1-3］，但融合最新科研成果和技術(shù)方面的研究相對較少［4-6］。利用DNA條形碼技術(shù)開展分子鑒定在一些生物學(xué)、動物學(xué)實(shí)驗(yàn)課程研究和改革中有所涉及［8-9］，但在普通昆蟲學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的研究還很少。對利用DNA 條形碼開展分子鑒定的流程進(jìn)行全面分析和優(yōu)化基礎(chǔ)上，本文設(shè)計(jì)了開展DNA條形碼專題實(shí)驗(yàn)或者將其與傳統(tǒng)分類實(shí)驗(yàn)結(jié)合的實(shí)施和考核方案，以期為改變普通昆蟲學(xué)實(shí)驗(yàn)傳統(tǒng)教學(xué)模式、探索創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)教學(xué)提供思路。

1 DNA條形碼技術(shù)

DNA條形碼技術(shù)可以用于農(nóng)作物品種鑒定，通過對農(nóng)作物DNA 測序，可以快速、準(zhǔn)確地鑒定不同品種之間的差異和相似性，從而實(shí)現(xiàn)對農(nóng)作物品種的優(yōu)化和改良［10］。還可以通過對農(nóng)產(chǎn)品DNA 進(jìn)行測序，可以快速、準(zhǔn)確地鑒定農(nóng)產(chǎn)品的品種和來源，從而實(shí)現(xiàn)對農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量控制和溯源管理。此外，DNA 條形碼技術(shù)可以通過對不同農(nóng)作物樣本進(jìn)行DNA測序，了解不同品種之間的遺傳關(guān)系，從而為農(nóng)作物的遺傳改良提供科學(xué)依據(jù)［11-12］。相比傳統(tǒng)的鑒定方法，DNA條形碼技術(shù)可以通過測序物種特定基因的序列來確定物種的身份，從而避免了傳統(tǒng)鑒定方法中可能存在的誤判或漏判等問題。比如有些物種在形態(tài)上非常相似，很難通過傳統(tǒng)的鑒定方法來區(qū)分它們，而DNA條形碼技術(shù)可以通過測序物種特定基因的序列，來確定物種的身份，從而對于難以區(qū)分的物種具有更加明顯的優(yōu)勢。

DNA條形碼技術(shù)在其他領(lǐng)域也有著廣泛的應(yīng)用，可以幫助生態(tài)學(xué)家準(zhǔn)確地鑒定和分類生物物種，從而更好地研究生物群落結(jié)構(gòu)、物種多樣性、生態(tài)系統(tǒng)功能等生態(tài)學(xué)問題。例如，在研究食物鏈中的物種關(guān)系時，DNA條形碼技術(shù)可以確定食物鏈中不同物種的身份和數(shù)量，從而更好地研究食物鏈的穩(wěn)定性和影響因素。DNA條形碼技術(shù)在食品鑒定中也有廣泛的應(yīng)用。通過對食品中的DNA 序列進(jìn)行分析，可以快速、準(zhǔn)確地鑒定食品中是否含有非法添加物或雜質(zhì)。例如，在魚類鑒定實(shí)驗(yàn)中，可以通過對魚類DNA 序列進(jìn)行分析，判斷魚類是否為野生或人工養(yǎng)殖的，是否含有添加物或雜種等。DNA 條形碼技術(shù)在醫(yī)學(xué)中也有著廣泛的應(yīng)用，可以幫助進(jìn)行疾病診斷、藥物研發(fā)等方面的研究。例如，利用DNA條形碼技術(shù)可以對不同癌癥樣本進(jìn)行測序，了解它們之間的遺傳關(guān)系，為癌癥的診斷和治療提供科學(xué)依據(jù)。此外，DNA 條形碼技術(shù)在犯罪偵查中也有著重要的應(yīng)用價值，可以幫助進(jìn)行身份鑒定、證據(jù)分析等方面的工作。

DNA條形碼技術(shù)是生命科學(xué)領(lǐng)域的前沿技術(shù)，掌握該技術(shù)可以使學(xué)生了解和掌握最新的科技發(fā)展動態(tài)，提高科技創(chuàng)新能力和創(chuàng)新意識。作為未來的創(chuàng)新型人才，植物保護(hù)專業(yè)學(xué)生需要掌握DNA 條形碼技術(shù)，以更好地應(yīng)對未來的挑戰(zhàn)和機(jī)遇。

2 DNA條形碼實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.1 可行性分析

DNA條形碼序列應(yīng)保證序列信息豐富度和可分辨性，同時應(yīng)具有一定的保守性，即同一物種的DNA條形碼序列應(yīng)高度相似，而不同物種的DNA條形碼序列應(yīng)有明顯差異，以確保物種的可識別性。此外，DNA條形碼的分子標(biāo)記應(yīng)具有廣泛性，以確保能夠鑒定到盡可能多的物種。關(guān)于DNA 條形碼的分子標(biāo)記選擇已有大量討論和比較分析研究，從目前的研究結(jié)果來看，昆蟲的標(biāo)記選擇趨向于線粒體細(xì)胞色素C 氧化酶亞單位I基因（COI基因）［13］。

線粒體COI基因在昆蟲綱多個目的DNA 條形碼分子鑒定中已有廣泛應(yīng)用，相關(guān)鑒定流程較為成熟，主要包括樣品處理、DNA提取、PCR擴(kuò)增、測序及結(jié)果分析。此外，對該技術(shù)應(yīng)用較成熟的檢驗(yàn)檢疫部門已在2016年頒布了《DNA條形碼物種鑒定操作規(guī)程》（SN/T4626—2016）。

目前已有較多DNA 條形碼序列豐富的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫可供使用，如BOLD 數(shù)據(jù)庫（Barcode of Life Data Systems，http：//www.boldsystems.org/）、NCBI（National Center for Biotechnology Information，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的GenBank數(shù)據(jù)庫等，其中BOLD 數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)有超過1 000 萬個DNA 條形碼數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)庫包含了充足的線粒體COI 基因序列數(shù)據(jù)和相關(guān)信息，足夠覆蓋普通昆蟲學(xué)涉及昆蟲類群的數(shù)據(jù)比對和分析。

綜上，目前昆蟲在DNA 條形碼分子標(biāo)記的篩選、分子鑒定操作流程、基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫建設(shè)等方面已較為完善，這些都為本實(shí)驗(yàn)的順利設(shè)計(jì)提供了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

2.2 實(shí)驗(yàn)方案

在整合大量文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，通過驗(yàn)證和摸索，優(yōu)化了以COI基因序列作為DNA條形碼開展分子鑒定的具體流程（見圖1），以便在普通昆蟲學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中開展DNA條形碼專題實(shí)驗(yàn)或者將其與傳統(tǒng)分類實(shí)驗(yàn)結(jié)合。

圖1 普通昆蟲學(xué)DNA條形碼分子鑒定實(shí)驗(yàn)流程圖

（1）樣品保存。將獲取的新鮮昆蟲樣品浸泡于無水乙醇中，置于-20 ℃冰箱中保存，避免樣本腐爛和DNA降解。

（2）DNA提取。DNA提取是DNA條形碼分析的關(guān)鍵步驟之一，DNA提取的方法選擇會直接影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和效果。對于昆蟲樣本的DNA 提取有以下幾種方法：①酚氯仿法。是一種傳統(tǒng)的DNA提取方法，該方法具有操作簡單、成本低等優(yōu)點(diǎn)，但是提取的DNA 質(zhì)量和純度較低，容易受到污染，不同實(shí)驗(yàn)人員操作重復(fù)性差，不利于保護(hù)RNA，很難進(jìn)行微量化的操作，且實(shí)驗(yàn)過程中會接觸苯酚、氯仿等試劑，毒性較大。②離心柱法。優(yōu)點(diǎn)是比傳統(tǒng)的酚氯法提取的質(zhì)量和純度高，有利于保護(hù)RNA，能進(jìn)行微量操作，且價格低廉，操作便捷，提取過程不使用苯、氯仿等有毒試劑，逐漸取代了傳統(tǒng)DNA 提取方法，是目前較為通用的DNA提取方法。③磁珠法。操作簡單快速，能實(shí)現(xiàn)高通量、自動化操作，提取效率高且安全無毒。提取過程中只需微量的樣本，提取的核酸純度高、濃度大，且靈敏度高，但該方法依賴于磁力分離裝置或自動提取儀，目前價格依然很高。

綜合來看，離心柱法更適合于普通昆蟲學(xué)實(shí)驗(yàn)，以天根公司的TIANamp Genomic DNA Kit血液/細(xì)胞/組織基因組DNA 提取試劑盒（離心柱型）為例，該方法的具體操作如下：

①選用昆蟲胸部肌肉或者足，個體較小時可利用除腹部和翅以外的全部蟲體。將選取的昆蟲組織放入1.5 mL離心管中，加入200 μL 緩沖液GA，使用研磨棒進(jìn)行充分研磨。

②加入20 μL 蛋白酶K 溶液，充分混勻。放入56 ℃水浴鍋中消化過夜，直至組織溶解。

③取出離心管，加入200 μL 緩沖液GB，充分顛倒混勻，70 ℃水浴10 min，簡短離心。

④加入200 μL無水乙醇，充分震蕩約15 s，混勻并簡短離心。

⑤將上一步所得溶液轉(zhuǎn)入組裝好的吸附柱中，12 000 r/min離心1 min，廢液倒掉，將吸附柱放回收集管中。

⑥向吸附柱中加入500 μL緩沖液GD（需提前按要求加入無水乙醇），12 000 r/min離心1 min，廢液倒掉，將吸附柱放回收集管中。

⑦向吸附柱中加入700 μL漂洗液PW（需提前按要求加入無水乙醇），12 000 r/min離心1 min，廢液倒掉，將吸附柱放回收集管中。

⑧向吸附柱中加入500 μL 漂洗液PW，12 000 r/min離心1 min，廢液倒掉。

⑨將吸附柱放回收集管中，12 000 r/min 離心2 min，廢液倒掉。將吸附柱打開蓋子置于超凈工作臺中，吹15 min，徹底晾干吸附柱。

⑩將吸附柱轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加入50 μL洗脫緩沖液TE，室溫放置2～5 min，12 000 r/min離心2 min，將溶液收集到離心管中。DNA產(chǎn)物保存在-20 ℃冰箱中，防止DNA降解。

（3）PCR擴(kuò)增。

①引物選擇。DNA條形碼序列主要利用COI 基因序列5′端位于輕鏈1 490 和重鏈2 198 之間目的片段。目前LCO1490（5′-GGTCAACAAATCATAAAGATA TTGG-3′）和HCO2198（5′-TAAACTTCAGGGTGACCAA AAAA TCA-3′）為最為通用的昆蟲COI 基因序列擴(kuò)增的引物［14］，在此基礎(chǔ)上改造的LepF1（5′-ATTCAAC CAATCATAAAGATATTGG-3′）和LepR1（5′-TAAACTT CTGGATGTCCAAAAAATCA-3′）目前也較為廣泛應(yīng)用［15］。

②PCR擴(kuò)增體系和條件。將提取的DNA作為模板，使用COI基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。參考生工Taq PCR Master Mix 的建議用量，摸索出最適PCR的反應(yīng)體系Taq PCR Master Mix 12.5 μL，DNA 模板1 μL，上、下游引物分別為1 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性，4 min。30 個擴(kuò)增循環(huán)：94 ℃變性，30 s，45～55 ℃復(fù)性，30 s，72 ℃延伸，1 min；72 ℃終延伸10 min；10 ℃保溫。反應(yīng)結(jié)束后及時取出放入4 ℃冰箱保存。

（4）電泳檢測。將PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用Gold View 型核酸染色劑染色，上樣3 μL的PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，確認(rèn)PCR 擴(kuò)增是否成功并檢測DNA 的大小和純度。凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察并拍照保存。具體步驟如下：

①1%的瓊脂糖凝膠制備。稱取0.4 瓊脂糖置于錐形瓶中，加入40 mL的1*TBE 緩沖液，微波爐中高火加熱煮沸至瓊脂糖全部融化并搖勻。將凝膠沖水冷卻至60 ℃，不燙手時加入4 μL的Gold View型核酸染色劑并混合均勻。

②膠板制備。取洗凈晾干的制膠槽放入制膠玻璃板，將梳子放入固定好，將上述凝膠倒入內(nèi)槽玻璃板上，使膠液緩慢展開，不要產(chǎn)生氣泡，直到整個玻璃板表面形成均勻膠層。室溫下靜置30 min，至膠完全凝固后垂直輕拔梳子，將凝膠及內(nèi)槽放入電泳槽中。添加1*TBE至沒過膠板。

③加樣。吸取3 μL的PCR產(chǎn)物加入膠板的槽孔里，另加入5 μL Marker作為對照。

④電泳。加樣完畢后，立刻通電進(jìn)行電泳，電壓160 V，電流60 mA，樣品從負(fù)極向正極方向移動，電泳30 min。

⑤觀察拍照。電泳完畢后取出凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)觀察并拍照保存。

（5）測序和分析。將PCR 產(chǎn)物送至測序公司進(jìn)行測序。通常使用Sanger測序方法，核苷酸雙向測序結(jié)果以SEQ 和ABI 格式輸出。使用CONTIG 序列編輯軟件對測序的COI 結(jié)果進(jìn)行編輯、修剪和校正，輸出FASTA 格式序列。序列上傳至BOLD 數(shù)據(jù)庫的IDENTIFICATION 板塊或NCBI 中的BLAST 進(jìn)行比對，找出序列相似度最高的物種信息。

2.3 評價考核

本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)培養(yǎng)學(xué)生的動手能力、科學(xué)素養(yǎng)和創(chuàng)新精神。在實(shí)驗(yàn)過程中，要鼓勵學(xué)生進(jìn)行討論和交流，分享彼此的觀察和發(fā)現(xiàn)，讓學(xué)生在互相學(xué)習(xí)和交流中不斷提高。在實(shí)驗(yàn)完成后，要對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行詳細(xì)的分析和解讀，將實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對比和驗(yàn)證。通過分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，讓學(xué)生更深入地了解基本原理，并能夠加深對科研成果的理解和應(yīng)用。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，要求學(xué)生撰寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告，在報(bào)告中應(yīng)詳細(xì)描述實(shí)驗(yàn)的過程、結(jié)果和分析。通過撰寫實(shí)驗(yàn)報(bào)告，讓學(xué)生能夠更全面地理解實(shí)驗(yàn)過程和原理，同時也能夠提高學(xué)生的科學(xué)寫作能力。

評價考核主要通過觀察實(shí)驗(yàn)過程，結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果和實(shí)驗(yàn)報(bào)告進(jìn)行，重點(diǎn)關(guān)注以下幾個方面：①實(shí)驗(yàn)操作技能，包括實(shí)驗(yàn)操作的規(guī)范性、熟練性和正確性等指標(biāo)；②實(shí)驗(yàn)報(bào)告能力，包括實(shí)驗(yàn)報(bào)告的完整性、規(guī)范性、清晰性和邏輯性等指標(biāo)；③實(shí)驗(yàn)思維能力，包括實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的合理性、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析能力和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的解釋能力等指標(biāo)；④實(shí)驗(yàn)安全意識，包括實(shí)驗(yàn)安全規(guī)定的遵守程度、實(shí)驗(yàn)安全操作的正確性和實(shí)驗(yàn)安全問題的處理能力等指標(biāo)；⑤綜合素質(zhì)，包括學(xué)生的學(xué)習(xí)態(tài)度、團(tuán)隊(duì)合作能力、創(chuàng)新能力和解決問題的能力等指標(biāo)。

經(jīng)評價考核，若學(xué)生已經(jīng)充分掌握了知識內(nèi)容，并熟練運(yùn)用知識點(diǎn)內(nèi)容設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，并能夠在完成基本實(shí)驗(yàn)要求的情況下表現(xiàn)出較強(qiáng)的實(shí)際動手能力，則評判為A檔；若學(xué)生基本掌握了知識點(diǎn)，完成了實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，表現(xiàn)出了一定的學(xué)習(xí)能力，則評判為B 檔；若學(xué)生對知識點(diǎn)內(nèi)容沒有完全理解，不能根據(jù)原理和知識點(diǎn)完成實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，則評判為C 檔，并要求學(xué)生繼續(xù)學(xué)習(xí)相關(guān)知識，熟悉實(shí)驗(yàn)操作流程，提升自身的整體能力。

3 結(jié)語

將DNA條形碼技術(shù)融入普通昆蟲學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)可以提高學(xué)生的科研能力和綜合素質(zhì)，促進(jìn)植物保護(hù)專業(yè)本科教學(xué)的發(fā)展。為了實(shí)現(xiàn)這個目標(biāo)，需要拓寬教學(xué)內(nèi)容、創(chuàng)新教學(xué)方式，即引入更多的分子生物學(xué)知識和技術(shù)，如DNA條形碼技術(shù)與PCR技術(shù)、基因測序技術(shù)等，從而更好地了解這些技術(shù)的原理和應(yīng)用，并采取更加生動、直觀的教學(xué)方法，可以通過講解案例、實(shí)驗(yàn)操作和課堂討論等方式，使學(xué)生更好地了解DNA條形碼技術(shù)的原理和應(yīng)用。還需要加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)，提供先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)備和技術(shù)支持，如PCR 擴(kuò)增儀、DNA 測序儀等先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，為學(xué)生提供更好的實(shí)驗(yàn)條件和技術(shù)支持。此外，還要加強(qiáng)師資隊(duì)伍建設(shè)，培養(yǎng)更多的專業(yè)教師和科研人才，尤其是具有分子生物學(xué)背景和實(shí)驗(yàn)技能的教師，為學(xué)生提供更好的教學(xué)和指導(dǎo)。

通過這些努力，在DNA條形碼技術(shù)融入普通昆蟲學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的基礎(chǔ)上，未來可以將更多科研成果和技術(shù)融入植物保護(hù)專業(yè)的實(shí)驗(yàn)和實(shí)踐課程中，能夠進(jìn)一步提高學(xué)生的科學(xué)素養(yǎng)和實(shí)踐能力，同時也能夠激發(fā)學(xué)生的創(chuàng)新能力，讓學(xué)生能夠更好地應(yīng)用科學(xué)知識解決實(shí)際問題。相信按照該模式可以培養(yǎng)更多的創(chuàng)新型人才，進(jìn)一步發(fā)展植物保護(hù)事業(yè)，為守護(hù)國家糧食安全做出更大的貢獻(xiàn)。