李楊楊 辛慧珍 郭柄軒 王慧娟 宋樹言 李洪濤 李冬妹 潘澤民

摘要：目的 探討HPV16 （Human Papillomavirus Type 16）E6-295T/G和E6-350T/G變異位點(diǎn)對(duì)IFNκ、MHC-Ⅰ、STAT1和IRF9蛋白質(zhì)表達(dá)的影響。方法 在宮頸癌細(xì)胞C33A（HPV陰性）中分別轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體295G/350G-GV230、295T/350G-GV230和295T/350T-GV230作為實(shí)驗(yàn)組，以NC-GV230作為對(duì)照組。通過免疫組織化學(xué)法、Western blot方法檢測(cè)HPV16 E6 295T/G、350T/G不同變異位點(diǎn)對(duì)IFNκ、MHC-Ⅰ、STAT1和IRF9蛋白質(zhì)表達(dá)的影響。通過IBM SPSS Statistics 26軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，免疫組織化學(xué)法定量采用image J軟件進(jìn)行陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果 Western blot結(jié)果顯示，免疫分子干擾素κ （Interferon Kappa，IFNκ）的表達(dá)，HPV16 E6-295G/350G變異組較HPV16 E6-295T/350T原型組和HPV16 E6-295T/350G組降低（P<0.01，P<0.05）。HPV16 E6-295G/350G變異組的免疫分子主要組織相容性復(fù)合體I類 （Major Histocompatibility Complex Class I，MHC-I）的表達(dá)顯著低于 HPV16 E6-295T/350T原型組和HPV16 E6-295T/350G組（P<0.05）。HPV16 E6-295G/350G變異組的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子1 （Signal Transducer and Activator of Transcription 1，STAT1）表達(dá)顯著低于 HPV16 E6-295T/350T原型組和 HPV16 E6-295T/350G組（P<0.05，P<0.01）。變異組HPV16 E6-295G/350G與 HPV16 E6-295T/350T原型組和HPV16 E6-295T/350G變異組相比，干擾素調(diào)節(jié)因子9 （Interferon Regulatory Factor 9，IRF9）表達(dá)顯著降低（P<0.05，P<0.01）。結(jié)論 HPV16病毒E6蛋白質(zhì)可以降低IFNκ、MHC-Ⅰ、STAT1和IRF9的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，E6基因T295G/T350G變異降低這些分子的表達(dá)作用最強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：宮頸癌；HPV16；E6基因；基因變異；蛋白質(zhì)表達(dá)

中圖分類號(hào)：中圖分類號(hào)R737.33文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

Study on the influence of HPV16 E6-295T/G and E6-350T/G variation

sites on the protein expression of IFNκ、MHC-Ⅰ、STAT1 and IRF9

LI? Yangyang 1，XIN? Huizhen2，GUO Bingxuan1，WANG Huijuan1，SONG Shuyan1，

LI Hongtao3，LI Dongmei1，PAN Zemin1*

（1 Department of Biochemistry and Molecular Biology，School of Medicine/Key Laboratory of Xinjiang Endemic and

Ethnic Diseases，Shihezi University，Shihezi，Xinjiang 832002，China;

2 Department of Biology， School of Basic Medicine，

Xinjiang Medical University， Urumqi， Xinjiang 830017， China;

3 Department of Anatomy and Histology and Embryology，

School of Medicine，Shihezi University，Shihezi，Xinjiang 832002，China）

Abstract：? Objective To explore the effect of variation sites E6-295T/G and E6-350T/G on the protein expression of? IFNκ、MHC-Ⅰ、STAT1 and IRF9. Methods Cervical cancer cells C33A were transfected with eukaryotic expression vectors 295G/350G-GV230， 295T/350G-GV230， 295T/350T-GV230 as the experimental group and NC-GV230 as the control group. Immunohistochemistry and Western blot methods were used to detect the effects of HPV16 E6 295T/G and 350T/G variation sites on IFNκ、MHC-Ⅰ、STAT1 and IRF9. IBM SPSS Statistics 26 software was used for statistical analysis of the experimental results. P<0.05 was considered statistically significant. Immunohistochemical method was used to quantitatively count positive cells by image J software. Results The results of Western blot showed that the expression of IFNκ was decreased in the HPV16 E6-295G/350G variant group compared with the HPV16 E6-295T/350T prototype group and HPV16 E6-295T/350G （P<0.05， P<0.01）. The expression of MHC-I in the HPV16 E6-295G/350G variants was significantly lower than that of HPV16 E6-295T/350T prototype group and HPV16 E6-295T/350G （P<0.05）. The expression of STAT1 was significantly lower in HPV16 E6-295G/350G variant group than in HPV16 E6-295T/350T prototype group and HPV16 E6-295T/350G （P<0.01， P<0.05）. IRF9 in HPV16 E6-295G/350G was significantly decreased than that of HPV16 E6-295T/350T prototype group and HPV16 E6-295T/350G （P<0.05，P<0.01）. Conclusion HPV16 E6 protein can reduce the expression of IFNκ， MHC-Ⅰ， STAT1 and IRF9， and E6 gene 295G/350G variation has the strongest effect on reducing the expression of these molecules.

Key words： cervical cancer;HPV16;E6 gene;gene variation;protein expression

宮頸癌是危害女性健康的主要惡性腫瘤之一［1］，感染高危型人乳頭瘤病毒（HR-HPV）是造成宮頸癌發(fā)生的主要原因［2］。

迄今為止，人類已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了200多種HPV類型［3］ ，其中主要分為高危（HR）和低危（LR）2種類型，其中HPV16型是最常見的HR型［4］。HPV主要編碼8個(gè)開放閱讀框（ORF），該病毒表達(dá)“早期”E1、E2、E4、E5、E6和E7蛋白質(zhì)，以及“晚期”衣殼蛋白質(zhì)L1和L2［5］。除了宮頸癌，相當(dāng)大比例的外陰、陰道、陰莖、肛門和口咽癌都是由HPV引起的［6］，HPV陽性癌細(xì)胞的生長(zhǎng)取決于病毒E6和E7 癌基因的持續(xù)表達(dá)［7］ 。E6和E7的靶標(biāo)分別是p53腫瘤抑制蛋白質(zhì)和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤腫瘤抑制蛋白質(zhì)pRB［8］ ，HPV癌蛋白質(zhì)能夠通過促進(jìn)增殖，抑制細(xì)胞凋亡以及阻止上皮細(xì)胞分化，從而驅(qū)使感染的細(xì)胞向腫瘤發(fā)展［9］ ，全球HPV相關(guān)癌癥的發(fā)病率仍然很高，特別是在亞洲和撒哈拉以南非洲，盡管有預(yù)防感染的疫苗可用，但是疫苗并不能治愈既定的感染或疾?。?］。

據(jù)相關(guān)報(bào)道宮頸癌在新疆高發(fā)［10］。有研究表明，E6和E7基因的多重變異能夠致使HPV16病毒抗原性、免疫原性以及易感性產(chǎn)生變化［11］。新的證據(jù)表明，抑制E6和E7可以重新激活宿主的先天免疫反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)適合病毒持續(xù)感染和腫瘤發(fā)生的細(xì)胞狀態(tài)［12］。破壞不同的免疫逃避機(jī)制是宮頸癌治療的一個(gè)重要方向，為了深入探究E6和E7誘導(dǎo)的免疫逃避和宮頸癌進(jìn)展之間的關(guān)系。前期研究新發(fā)現(xiàn)了宮頸癌中HPV16病毒E6基因295T/G、350T/G變異位點(diǎn)。

本研究旨在通過真核轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，研究HPV16 E6-295T/G和E6-350T/G變異位點(diǎn)對(duì)IFNκ、MHC-Ⅰ、STAT1和IRF9蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，為預(yù)防和治療宮頸癌奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來源

宮頸癌C33A細(xì)胞（HPV陰性）株由本實(shí)驗(yàn)室保存提供。

1.2 質(zhì)粒的構(gòu)建

HPV16 E6原型和變異型真核表達(dá)載體均由上海吉?jiǎng)P基因公司進(jìn)行設(shè)計(jì)構(gòu)建，分別構(gòu)建HPV16 E6 原型 295T/350T-GV230、HPV16 E6 變異型 295G/350G-GV230 和 295T/350G-GV230 表達(dá)載體，其中以NC-GV230作為對(duì)照。

1.3 主要試劑

主要試劑詳見表1。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

將宮頸癌細(xì)胞C33A培養(yǎng)在CO2含量為5%的37℃恒溫培養(yǎng)箱中，用含量為90%DMEM+10%胎牛血清+1%雙抗（青霉素+鏈霉素）的完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞傳代至3代以后，等到細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到90%左右時(shí)用含0.25%乙二胺四乙酸的胰蛋白酶消化后離心。將離心后的細(xì)胞沉淀使用DMEM重懸后計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)結(jié)束后計(jì)算每孔接種細(xì)胞數(shù)為4×104的體積，按照計(jì)算出的體積將C33A細(xì)胞接種于六孔培養(yǎng)皿中置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日至細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到約30%時(shí)，使用FuGENEHD轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將不同處理組做上標(biāo)記，轉(zhuǎn)染后4～6 h換液，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)用以接下來的實(shí)驗(yàn)。

1.5 qRT-PCR檢測(cè)HPV16 E6的表達(dá)

先用Trizol法在冰上提取各組細(xì)胞的總RNA，加入少量無酶水溶解提取的RNA，之后使用Takara的TB Green Premix Ex Ta試劑擴(kuò)增內(nèi)參基因GAPDH以及HPV16 E6基因。得到擴(kuò)增數(shù)據(jù)，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。將內(nèi)參基因設(shè)置為基準(zhǔn)，擴(kuò)增數(shù)據(jù)通過歸一化處理之后利用2-ΔΔCT的方法進(jìn)行計(jì)算，得到各組的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，利用GraphPad Prism 8軟件作圖。擴(kuò)增所用序列詳見表2。

1.6 Western blot實(shí)驗(yàn)

在細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h之后使用RIPA裂解液提取細(xì)胞的總蛋白質(zhì) ，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離提取好的細(xì)胞總蛋白質(zhì)樣品，提前配置好聚丙烯酰胺凝膠，按照順序在膠孔中加入適量提取的細(xì)胞總蛋白質(zhì)，將穩(wěn)壓儀的電壓先調(diào)至80V電泳30 min，蛋白質(zhì)電泳出濃縮膠后，電壓調(diào)大到110V繼續(xù)電泳1 h左右；蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜條件為110V半干轉(zhuǎn)1 h（轉(zhuǎn)膜全程冰浴防止電轉(zhuǎn)過程中過熱）。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后使用1×TBST配置含5%脫脂奶粉的封閉液，將電轉(zhuǎn)好的膜置于封閉液中常溫封閉2h。提前稀釋好一抗（IFNκ1∶500，MHC-I 1∶1 000，STAT1 1∶1 000，IFR9 1∶1 000）后裁好條帶，一抗覆蓋至相應(yīng)泳道位置后，置于冰箱中4℃孵育過夜12～16h（以GAPDH作為內(nèi)參）。次日，按類別回收一抗，條帶使用1×TBST 洗滌3次，提前稀釋好二抗（山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG均按照1∶5 000稀釋）常溫下孵育相應(yīng)的二抗2 h，結(jié)束以后用1×TBST洗滌帶3次后利用化學(xué)成像發(fā)光系統(tǒng)對(duì)目的分子的條帶進(jìn)行曝光檢測(cè)其蛋白質(zhì)表達(dá)，保存好數(shù)據(jù)，用于后續(xù)處理。

1.7 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)IFNκ、MHC-Ⅰ、STAT1和IRF9的表達(dá)

制作細(xì)胞滴片步驟是：洗掉培養(yǎng)基，使用胰酶消化細(xì)胞，收集好細(xì)胞，使用PBS重懸細(xì)胞，3 000 r·min-1離心后棄上清。向細(xì)胞沉淀加入500 μL的4%多聚甲醛后靜置20min。離心3 000 r·min-1時(shí)間5min，加入PBS重懸。棄上清后離心3 000 r·min-1時(shí)間5min，加入500 μL的0.1%TritonX-100后靜置15min。離心3 000 r·min-1時(shí)間5min，加入PBS重懸。棄上清后離心3 000 r·min-1時(shí)間5min，加入適量PBS重懸，取適量懸液滴至載玻片，于顯微鏡下觀察細(xì)胞密度，以細(xì)胞單層且密度60%～80%為宜，靜置數(shù)分鐘后放入通風(fēng)櫥干燥后冷凍。

次日將準(zhǔn)備好的凍細(xì)胞滴片取出靜置，平衡至室溫使之融化，使用1×PBS洗滌細(xì)胞滴片3次，每次 5 min。

提前稀釋好一抗（IFNκ1∶100，MHC-I 1∶800，），將洗滌后的滴片置于濕盒內(nèi)使用免疫組織化學(xué)法專用油性筆將每個(gè)細(xì)胞范圍圈住防止液體流出，每孔滴加適量一抗，蓋嚴(yán)濕盒，放在冰箱中4℃孵育過夜12～16 h（濕盒內(nèi)加水要防止干燥）。第二天早上復(fù)溫，將濕盒輕緩取出并置于37℃烘箱中30 min。用1×PBS緩沖液充分洗滌細(xì)胞滴片3次，每次5 min，擦拭凈滴片上多余的1×PBS，滴加適量的對(duì)應(yīng)的二抗，在37℃烘箱中反應(yīng)30 min。1×PBS洗滌細(xì)胞滴片上多余的二抗3次，每次5 min，擦拭凈滴片上多余的1×PBS，滴加DAB液進(jìn)行顯色反應(yīng)。顯色合適后用水沖掉DAB顯色液從而終止顯色反應(yīng)。將顯完色的滴片浸入蘇木素染液中進(jìn)行3 min的復(fù)染操作，用自來水沖洗，酸化置于鹽酸酒精中4～6s立即取出，再用自來水沖洗幾次，而后置于自來水中5 min。將處理好的細(xì)胞滴片順次放于70%、85%、90%和無水乙醇，分別脫水5 min，再將滴片順次放入二甲苯I，II中各5 min，后室溫或者65℃烘箱中靜置待干，最后在滴片上滴加適量中性樹膠，蓋上蓋玻片封好滴片。在顯微鏡下觀察染色結(jié)果，采圖做好記錄。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)處理均使用IBM SPSS Statistics 26軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，對(duì)服從正態(tài)分布且方差齊的多組比較采用方差分析，運(yùn)用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 過表達(dá)質(zhì)粒變異位點(diǎn)的檢測(cè)

構(gòu)建295G/350G、295T/350G、295T/350T過表達(dá)質(zhì)粒并對(duì)其中突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)得到295G/350G、295T/350G、295T/350T位點(diǎn)的測(cè)序峰圖（圖1）。

2.2 qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染過表達(dá)質(zhì)粒后HPV16 E6基因的mRNA表達(dá)

在宮頸癌細(xì)胞C33A中轉(zhuǎn)染295G/350G、295T/350G、295T/350T表達(dá)質(zhì)粒作為實(shí)驗(yàn)組，以NC-GV230作為對(duì)照組。選擇從mRNA水平上采用qRT-PCR來檢測(cè)HPV16 E6基因的mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示與對(duì)照組相比各實(shí)驗(yàn)組的HPV16 E6基因的mRNA表達(dá)水平明顯增高，證明在轉(zhuǎn)染過表達(dá)真核載體后，HPV16 E6基因成功表達(dá)（圖2）。

2.3 不同HPV16 E6基因變異型對(duì)免疫相關(guān)分子IFNκ表達(dá)影響

在宮頸癌細(xì)胞C33A中轉(zhuǎn)染HPV16 295G/350G、295T/350G、295T/350T表達(dá)質(zhì)粒作為實(shí)驗(yàn)組，以NC-GV230作為對(duì)照組。利用免疫組織化學(xué)方法和 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)免疫分子IFNκ的表達(dá)水平，免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示HPV16 E6-295G/350G（圖3C）和 HPV16 E6-295T/350G（圖3D）變異組與 NC 組（圖3A）比較顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.001）（圖3E），Western blot 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的IFNκ結(jié)果顯示三個(gè)實(shí)驗(yàn)組與 NC 比較表達(dá)均顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01，P<0.001）（圖4），HPV16 E6-295G/350G 變異組與HPV16 E6 295T/350T 原型組比較顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），變異組HPV16 E6-295G/350G與HPV16 E6-295T/350G 相比，免疫分子IFNκ的表達(dá)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖4）。

2.4 不同HPV16 E6基因變異型對(duì)免疫相關(guān)分子MHC-I表達(dá)影響

在宮頸癌細(xì)胞C33A中轉(zhuǎn)染HPV16 295G/350G、295T/350G、295T/350T表達(dá)質(zhì)粒作為實(shí)驗(yàn)組，以NC-GV230作為對(duì)照組。利用免疫組織化學(xué)方法和 Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)免疫分子MHC-I的表達(dá)水平，免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示HPV16 E6-295G/350G（圖5C）和 HPV16 E6-295T/350G（圖5D）變異組與NC組（圖5A）比較表達(dá)水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）（圖5E）；Western blot 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的MHC-I表達(dá)水平，結(jié)果顯示3個(gè)實(shí)驗(yàn)組與NC組比較均顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，HPV16 E6-295G/350G變異組與HPV16 E6 295T/350T原型組比較MHC-I表達(dá)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），變異組HPV16 E6-295G/350G與HPV16 E6-295T/350G相比，MHC-I表達(dá)顯著降低（P<0.05）（圖6）。

2.5 不同HPV16 E6 基因變異型對(duì)STAT1表達(dá)的影響

在宮頸癌細(xì)胞C33A中轉(zhuǎn)染HPV16 295G/350G、295T/350G、295T/350T表達(dá)質(zhì)粒作為實(shí)驗(yàn)組，以NC-GV230作為對(duì)照組。

Western blot 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的STAT1的表達(dá)結(jié)果顯示HPV16 E6-295G/350G變異組、HPV16 E6-295T/350G變異組和HPV16 E6 295T/350T原型組與對(duì)照組之間相比較均顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001，P<0.05，P<0.01），變異組HPV16 E6-295G/350G與HPV16 E6-295T/350T和HPV16 E6-295T/350G相比STAT1表達(dá)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01） （圖7）。

2.6 不同HPV16 E6基因變異型對(duì)IRF9表達(dá)的影響

在宮頸癌細(xì)胞C33A中轉(zhuǎn)染HPV16 295G/350G、295T/350G、295T/350T表達(dá)質(zhì)粒作為實(shí)驗(yàn)組，以NC-GV230作為對(duì)照組。

Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的IRF9的表達(dá)結(jié)果顯示：HPV16 E6-295G/350G變異組、HPV16 E6-295T/350G變異組和HPV16 E6 295T/350T原型組與對(duì)照組之間比較均有明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001，P<0.05，P<0.001），且變異組HPV16 E6-295G/350G與HPV16 E6-295T/350G和HPV16 E6-295T/350T相比IRF9表達(dá)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，P<0.05）（圖8）。

3 討論

HPV相關(guān)基因變異以及特定類型HPV感染易感性同宮頸病變進(jìn)展之間的關(guān)系尚不清楚［13］。有相關(guān)研究報(bào)道，在HPV感染的早期階段，HPV16病毒的E6致癌蛋白質(zhì)能夠抑制免疫分子基因蛋白質(zhì)的表達(dá)，使病毒可以逃脫免疫的抑制作用，進(jìn)而使得病毒不斷增殖，造成機(jī)體持續(xù)感染。研究發(fā)現(xiàn)，E6蛋白質(zhì)可以破壞免疫分子的表達(dá)，影響機(jī)體細(xì)胞清除HPV的感染。HPV整合到宿主細(xì)胞基因組中會(huì)導(dǎo)致E6表達(dá)上調(diào)，從而導(dǎo)致HPV感染的細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化［14］。

課題組前期在新發(fā)現(xiàn)的HPV16病毒基因組變異位點(diǎn)中，發(fā)現(xiàn)E6基因中的295T/G和350T/G致病變異位點(diǎn) 。通過構(gòu)建真核表達(dá)載體，選擇HPV陰性的宮頸癌C33A細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，在mRNA水平上通過qRT-PCR驗(yàn)證HPV16病毒癌基因E6的表達(dá)，利用免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)以及Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，增加HPV16病毒E6基因表達(dá)，可以降低IFNκ、MHC-Ⅰ、STAT1和IRF9的表達(dá)，且HPV16病毒E6-295G/350G位點(diǎn)的變異對(duì)這些基因蛋白質(zhì)表達(dá)抑制作用最強(qiáng)。病毒與免疫系統(tǒng)的斗爭(zhēng)一直在進(jìn)行中，為了能夠成功感染宿主，病毒進(jìn)化出了能夠?qū)λ拗鬟M(jìn)行免疫逃逸并持續(xù)感染的策略，一旦逃脫了免疫分子的抑制作用，病毒便可不斷增殖。因此，通過探究HPV16的致病變異位點(diǎn)對(duì)免疫相關(guān)分子表達(dá)的影響對(duì)宮頸癌的防治具有十分重要的意義。

相關(guān)研究表明免疫分子IFNκ在正常角質(zhì)形成細(xì)胞中表達(dá)，HPV16病毒的E6和E7兩個(gè)癌蛋白質(zhì)都能夠抑制IFN的表達(dá)，而E6抑制程度較大［15］。MHC- I在大多數(shù)有核細(xì)胞表面呈遞多肽，使免疫系統(tǒng)能夠檢測(cè)和清除感染或惡性轉(zhuǎn)化的細(xì)胞［16］。研究發(fā)現(xiàn)，STAT1蛋白質(zhì)通過在細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)I型、II型和III型IFN信號(hào)，在針對(duì)病毒和其他病原體的免疫反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。STAT1激活了數(shù)百個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄，其中一些基因已經(jīng)被很好地描述為抗病毒特性［17］。IRF9在調(diào)節(jié)I型干擾素和干擾素刺激基因（interferon-stimulated genes，ISG）在相關(guān)信號(hào)通路中的表達(dá)方面發(fā)揮重要作用［18］。

研究表明當(dāng)干擾素表達(dá)被抑制，IFNκ的非磷酸干擾素刺激基因因子3（unphosphorylated interferon-stimulated gene factor 3，U-ISGF3）復(fù)合物作用途徑可以影響抗病毒的免疫分子的表達(dá)［19］。據(jù)報(bào)道高危HPV病毒癌基因E6的作用途徑在角質(zhì)形成細(xì)胞中靶向作用IFNκ，使得干擾素信號(hào)途徑中U-ISGF3復(fù)合物的 STAT1和IRF9基因表達(dá)水平降低，進(jìn)而影響細(xì)胞抗病毒狀態(tài)［20］。在本項(xiàng)研究中，通過檢測(cè)IFNκ、MHC-I、STAT1和IRF9的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，可以觀察到轉(zhuǎn)染HPV16病毒不同變異位點(diǎn)的E6基因后，這四種蛋白質(zhì)表達(dá)水平顯著降低，且其中E6-295G/350G變異組對(duì)這些基因的蛋白質(zhì)表達(dá)抑制程度較大，從而影響抗病毒作用，可能導(dǎo)致HPV16處于持續(xù)感染狀態(tài)，最終可能導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生。

本研究發(fā)現(xiàn)HPV16病毒E6基因可以降低IFNκ、MHC-Ⅰ、STAT1和IRF9的表達(dá)，其中E6-295G/350G變異位點(diǎn)對(duì)免疫分子的抑制作用大于E6-295T/350G和E6-295T/350T變異位點(diǎn)，這為預(yù)測(cè)HPV16病毒風(fēng)險(xiǎn)和防治宮頸癌有重要的意義。對(duì)于已經(jīng)感染HPV的婦女來說，倘若能夠?qū)ふ业椒椒ㄒ种撇《局掳┗虻谋磉_(dá)，提高機(jī)體免疫分子的表達(dá)，能夠使機(jī)體容易清除HPV的感染，這將會(huì)為廣大女性帶來福音。對(duì)于HPV16病毒降低免疫分子的機(jī)制仍需要進(jìn)一步深入的研究。

參考文獻(xiàn)（References）

［1］ ALMEIDA A M， QUEIROZ J A， SOUSA F， et al. Cervical cancer and HPV infection： ongoing therapeutic research to counteract the action of E6 and E7 oncoproteins［J］. Drug Discovery Today， 2019， 24（10）： 2044-2057.

［2］ MANZO-MERINO J， LAGUNAS-MARTNEZ A， CONTRERAS-OCHOA C， et al. The human papillomavirus （HPV） E6 oncoprotein regulates CD40 expression via the AT-Hook transcription factor AKNA［J］. Cancers， 2018， 10（12）： 521.

［3］ BORDIGONI A， MOTTE A， TISSOT-DUPONT H， et al. Development and validation of a multiplex qPCR assay for detection and relative quantification of HPV16 and HPV18 E6 and E7 oncogenes［J］. Scientific Reports， 2021， 11（1）：4039.

［4］ CHINTALA S， LEVAN J， ROBINSON K， et al. Genes regulated by HPV 16 E6 and high expression of NFX1-123 in cervical cancers［J］. Onco Targets Ther， 2020， 13： 6143-6156.

［5］ ESTE^VO D，COSTA N R， GIL DA COSTA R M， et al. Hallmarks of HPV carcinogenesis： The role of E6， E7 and E5 oncoproteins in cellular malignancy［J］. Biochim Biophys Acta Gene Regul Mech， 2019，1862（2）：153-162.

［6］ DE MARTEL C， PLUMMER M， VIGNAT J， et al. Worldwide burden of cancer attributable to HPV by site， country and HPV type［J］. International Journal of Cancer， 2017， 141（4）： 664-670.

［7］ HOPPE-SEYLER K， BOSSLER F， BRAUN J A， et al. The HPV E6/E7 oncogenes： Key factors for viral carcinogenesis and therapeutic targets［J］. Trends in Microbiology， 2018， 26（2）： 158-168.

［8］ MARTINEZ-NOEL G， VIEIRA V C， SZAJNER P， et al. Live cell， image-based high-throughput screen to quantitate p53 stabilization and viability in human papillomavirus positive cancer cells［J］. Virology， 2021， 560： 96-109.

［9］ PAOLINI F， AMICI C， CAROSI M， et al. Intrabodies targeting human papillomavirus 16 E6 and E7 oncoproteins for therapy of established HPV-associated tumors［J］. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research， 2021， 40（1）：37.

［10］ 張春賀，付少偉，王芳，等. 宮頸癌細(xì)胞中RNA干擾SNX10基因?qū)?xì)胞增殖和凋亡影響的研究［J］. 石河子大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2020， 38（6）： 728-733.

ZHANG C H， FU S W， WANG F， et al. Effect of RNA interference with SNX10 gene on cell proliferation and apoptosis in cervical cancer cells［J］. Journal of Shihezi University （Natural Science Edition）， 2020， 38 （6）： 728-733.

［11］ 潘貞貞，宋宇寧，者湘漪，等. HPV16 E6-G350基因表達(dá)促進(jìn)宮頸癌C33A細(xì)胞增殖且抑制凋亡［J］. 石河子大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2018， 36（5）： 569-574.

PAN Z Z， SONG Y N， ZHE X Y， et al. HPV16 E6-G350 gene expression promotes proliferation and inhibits apoptosis of cervical cancer C33A cells. Journal of Shihezi University （Natural Science Edition）， 2018， 36（5）： 569，574.

［12］ LOCIGNO I， CALATI F， ALBERTINI S， et al. Subversion of host innate immunity by human papillomavirus oncoproteins［J］. Pathogens （Basel）， 2020， 9（4）： 292.

［13］ ZOU J， CAO Z， ZHANG J， et al. Variants in human papillomavirus receptor and associated genes are associated with type-specific HPV infection and lesion progression of the cervix［J］. Oncotarget， 2016， 7（26）： 40135-40147.

［14］ VONSKY M， SHABAEVA M， RUNOV A， et al. Carcinogenesis associated with human papillomavirus infection. Mechanisms and Potential for Immunotherapy［J］. Biochemistry （Mosc）， 2019， 84（7）： 782-799.

［15］ REISER J， HURST J， VOGES M， et al. High-risk human papillomaviruses repress constitutive kappa interferon transcription via E6 to prevent pathogen recognition receptor and antiviral-gene expression［J］. Journal of Virology， 2011， 85（21）： 11372-11380.

［16］ THOMAS C， TAMP R. MHC I chaperone complexes shaping immunity［J］. Current Opinion in Immunology， 2019， 58： 9-15.

［17］ TOLOMEO M， CAVALLI A， CASCIO A. STAT1 and its crucial role in the control of viral infections［J］. International Journal of Molecular Sciences， 2022， 23（8）： 4095.

［18］ ZHU Y， SHAN S， FENG H， et al. Molecular characterization and functional analysis of interferon regulatory factor 9 （irf9） in common carp Cyprinus carpio： a pivotal molecule in the Ifn response against pathogens［J］. Journal of Fish Biology， 2019， 95（2）： 510-519.

［19］ CHEON H， STARK G R. Unphosphorylated STAT1 prolongs the expression of interferon-induced immune regulatory genes［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 2009， 106（23）： 9373-9378.

［20］ CHEON H， HOLVEY-BATES E G， SCHOGGINS J W， et al. IFNbeta-dependent increases in STAT1， STAT2， and IRF9 mediate resistance to viruses and DNA damage［J］. EMBO Journal， 2013， 32（20）： 2751-2763.

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