饒丹 尹磊 吳佩 王媛媛 何書海 張寧 董建國

饒 丹，尹 磊，吳 佩，王媛媛，等. 鵝星狀病毒RdRp蛋白對細胞因子轉(zhuǎn)錄水平的影響［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2024，52（7）：164-168.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2024.07.022

（1.信陽農(nóng)林學(xué)院動物科技學(xué)院，河南信陽 464000； 2.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院，河南鄭州 450046； 3.河南豐源和普農(nóng)牧股份有限公司，河南漯河 462000）

摘要：為了解鵝星狀病毒（GAstV）RdRp蛋白對細胞因子轉(zhuǎn)錄水平的影響，試驗將構(gòu)建的pCMV-RdRp真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細胞，并于轉(zhuǎn)染后12、24、36 h收集細胞，提取核酸檢測細胞內(nèi)CCL2、CCL5、IL-1β、IFN-α、TNF-α、IFITM1和IFITM2的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GAstV RdRp蛋白于12、24、36 h極顯著抑制CCL2轉(zhuǎn)錄，12 h極顯著促進CCL5表達，24、36 h極顯著抑制CCL5表達（P<0.01）；GAstV RdRp蛋白于24、36 h極顯著促進IL-1β轉(zhuǎn)錄（P<0.01）；GAstV RdRp蛋白于12 h極顯著促進IFN-α的轉(zhuǎn)錄，于24、36 h極顯著抑制IFN-α轉(zhuǎn)錄（P<0.01）；GAstV RdRp蛋白于12、24、36 h顯著或極顯著抑制TNF-α轉(zhuǎn)錄（P<0.01）；GAstV RdRp蛋白于24 h極顯著抑制IFITM1轉(zhuǎn)錄（P<0.01），于36 h顯著抑制轉(zhuǎn)錄（P<0.05），于12、36 h極顯著促進IFITM2轉(zhuǎn)錄（P<0.01），于24 h極顯著抑制IFITM2的轉(zhuǎn)錄（P<0.01）。表明GAstV RdRp蛋白過表達能夠誘導(dǎo)IL-1β的轉(zhuǎn)錄，抑制CCL2、TNF-α和IFITM1的轉(zhuǎn)錄；GAstV RdRp蛋白早期促進CCL5和IFN-α的轉(zhuǎn)錄，后期抑制CCL5和IFN-α的轉(zhuǎn)錄；GAstV RdRp蛋白早期和晚期促進IFITM2轉(zhuǎn)錄，中期抑制IFITM2轉(zhuǎn)錄。

關(guān)鍵詞：鵝星狀病毒；細胞因子；轉(zhuǎn)錄；RdRp蛋白

中圖分類號：Ｓ８５２.６５＋７? 文獻標(biāo)志碼：A? 文章編號：1002-1302（2024）07-0164-05

星狀病毒（astrovirus，AstV）是一種無囊膜、單股正鏈RNA病毒。根據(jù)感染宿主能力不同，星狀病毒可分為哺乳動物星狀病毒和禽星狀病毒［1］。禽星狀病毒主要感染雞、火雞、鴨、鵝等，在不同的宿主引起的癥狀不同。2017年以來，一種以痛風(fēng)為主要癥狀的傳染性疾病在我國東南沿海和內(nèi)陸省份主要養(yǎng)鵝地區(qū)暴發(fā)，研究顯示這種感染主要是由鵝星狀病毒（goose astrovirus，GAstV）引起，鵝場小鵝的死亡率超過50%［2-5］。尸檢顯示有嚴(yán)重的內(nèi)臟和關(guān)節(jié)尿酸沉積癥狀，研究顯示病鵝腎臟的病毒拷貝數(shù)最高，其次是脾臟和肝臟［6］。這種疾病給養(yǎng)鵝業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。

GAstV在2005年出現(xiàn)痛風(fēng)癥狀的小鵝病料中被首次發(fā)現(xiàn)［7］。GAstV基因組共有3個開放閱讀框（open reading frame，ORF）：ORF1a、ORF1b和ORF2。星狀病毒的ORF1a和ORF1b存在重疊區(qū)，ORF1a和ORF1b編碼非結(jié)構(gòu)蛋白（non-structural protein，NSP），包括跨膜區(qū)域（transmembrane，TM）、絲氨酸蛋白酶、卷曲螺旋（coiled-coil，CC）、病毒基因組連接蛋白（viral genome-linked protein，VPg）、核定位信號（nuclear localization signal，NLS）及RNA依賴性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）。ORF2編碼衣殼蛋白（capsid protein，CP），其中，ORF1a編碼多聚蛋白，ORF1b編碼RNA依賴的RNA聚合酶（RdRp）蛋白［8］。RdRp能夠催化mRNA合成，并通過互補RNA中間體復(fù)制RNA病毒基因組。同時，病毒需要以受控的方式生成這些RNA物種，與宿主細胞激烈競爭資源進行繁殖。流感病毒在RNA合成的每一步均利用宿主因子增強和調(diào)節(jié)RdRp活性［9］。豬細胞白介素-2增強劑結(jié)合因子2能夠和豬繁殖與呼吸綜合征病毒RdRp相互作用，抑制病毒復(fù)制［10］。這些研究表明，了解病毒RdRp調(diào)控病毒和宿主的機制，研制針對RdRp的藥物，在預(yù)防和治療病毒感染腫脹方面具有重要意義。AstV可感染多個宿主，目前對于AstV的RdRp蛋白調(diào)控宿主機制研究較少。[JP2]

細胞因子在病毒增殖中具有重要作用。研究顯示，CCL2、CCL5、IL-1β和TNF-α能夠影響HIV-1、[JP]甲型流感病毒、乙型肝炎病毒和貓傳染性腹膜炎病毒的增殖［11-14］。且腎臟中IL-1β和 TNF-α 的表達水平與鵝星狀病毒引起的痛風(fēng)有關(guān)［15］，而IFN和抗病毒蛋白具有重要的抗病毒特性。為研究鵝星狀病毒的致病機制，本研究初步探索GAstV RdRp蛋白對CCL2、CCL5、IL-1β、IFN-α、TNF-α、IFITM1和IFITM2轉(zhuǎn)錄水平的影響，以期為開放抗病毒藥物提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 細胞和質(zhì)粒

293細胞由信陽農(nóng)林學(xué)院動物科技學(xué)院免疫病理實驗室凍存；表達GAstV RdRp蛋白的真核質(zhì)粒pCMV-RdRp-HA由信陽農(nóng)林學(xué)院動物科技學(xué)院免疫病理實驗室構(gòu)建保存，本試驗于2022年12月在信陽農(nóng)林學(xué)院動物科技學(xué)院免疫病理實驗室進行。

1.1.2 試驗試劑

核酸提取試劑DNA/RNA Extraction Kit FT（Prepackaged）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（1st Strand cDNA Synthesis Kit＋gDNA wiper）、熒光定量試劑AceQ qPCR SYBR Green Master Mix（High ROX Premixed），購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；細胞因子CCL2、CCL5、IL-1β、TNF-α、IFNα和抗病毒蛋白IFITM基因定量檢測引物，由金唯智生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

從液氮中復(fù)蘇293細胞，于5%二氧化碳的培養(yǎng)箱在含有10%胎牛血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并鋪入12孔板中，待細胞密度達90%時進行轉(zhuǎn)染。

1.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

每孔細胞使用50 μL無血清培養(yǎng)基稀釋 0.6 μg 真核質(zhì)粒pCMV-RdRp-HA。同時，將 1.2 μL LipofectamineTM 2000試劑加入50 μL無血清培養(yǎng)基。隨后將兩者混合，室溫靜置20 min，隨后將混合物加入細胞培養(yǎng)孔中，分別于轉(zhuǎn)染后12、24、36 h收集細胞于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 核酸的提取

使用FastPure Cell Total RNA Isolation Kit試劑盒提取細胞中的總RNA，具體操作如下：將細胞加入Buffer RL，漩渦振蕩，轉(zhuǎn)移至收集管中，直至無明顯細胞團，12 000 r/min離心2 min。收集上清液，加入Buffer RL2（已加入無水乙醇），輕柔混勻，轉(zhuǎn)移至RNA? Pure Columns中（RNA Pure Columns已放入收集管中），12 000 r/min離心 1 min，棄廢液。將剩余的液體全部加入吸附柱中，12 000 r/min 離心 1 min，棄廢液，重復(fù)1次。向RNA Pure Columns中加入Buffer RW2（已加入無水乙醇），[JP]12 000 r/min離心1 min，棄廢液，12 000 r/min離心2 min。向吸附柱中央部位懸空滴加100 μL RNase-free ddH2O。室溫放置2 min，12 000 r/min離心1 min，洗脫RNA。提取的RNA放于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 細胞因子檢測

將提取的RNA進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系如下：5×gDNA wiper Mix 2 μL，RNA 8 μL，5×RT Mix 2 μL，HiScript Ⅲ Enzyme Mix 2 μL，Random hexamers 1 μL，RNase-free ddH2O 5 μL。反應(yīng)程序：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。隨后采用染料法對細胞中的CCL2、CCL5、IL-1β、TNF-α和IFITM的轉(zhuǎn)錄水平進行定量檢測。定量檢測引物如下：CCL2F：5′-GCCTCCAGCATGAAAGTCTC-3′，CCL2R：5′-AGGTGACTGGGGCATTGAT-3′；CCL5F：5′-CTGCCTCCCCATATTCCTCG-3′，CCL5R：5′-CACACTTGGCGGTTCTTTCG-3′；IL-1βF：5′-[JP9]AGGCACAAGGCACAACAGGCT-3′，IL-1βR：5′-AACAACTGACGCGGCCTGCC-3′；TNF-αF：5′-CCCTCTGGCCCAGGCAGTCA-3′，TNF-αR：5′-ATGGGTGGAGGGGCAGCCTT-3′；IFITM1F：5′-TCAGGTCAAGGATAGTCTGGAG-3′，IFITM1R：5′-AGGTTGTGTATTCCCACACTGTA-3′；IFITM2F：5′-GGAGGGAGAAAACTCCTTGGA-3′，IFITM2R：5′-GGCCAGTAGGTTGCACATTGT-3′。反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，40個循環(huán)。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

使用2-ΔΔCT方法計算檢測基因的相對表達水平，采用GraphPad Prism 5軟件進行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 GAstV RdRp蛋白影響CCL2、CCL5的轉(zhuǎn)錄

293細胞轉(zhuǎn)染pCMV-RdRp真核質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后12、24、36 h收集細胞，檢測細胞中CCL2和CCL5基因的轉(zhuǎn)錄水平。由圖1可知，RdRp蛋白于12、24、36 h極顯著抑制CCL2轉(zhuǎn)錄（P<0.01），12 h極顯著促進CCL5表達（P<0.01），24、36 h極顯著抑制CCL5表達（P<0.01）。

2.2 GAstV RdRp蛋白影響IL-1β的轉(zhuǎn)錄

293細胞轉(zhuǎn)染pCMV-RdRp真核質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后12、24、36 h收集細胞，檢測細胞中IL-1β的轉(zhuǎn)錄水平。由圖2可知，RdRp蛋白于24、36 h極顯著促進IL-1β的轉(zhuǎn)錄（P<0.01）。

2.3 GAstV RdRp蛋白對IFN-α轉(zhuǎn)錄的影響

293細胞轉(zhuǎn)染pCMV-RdRp真核質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后12、24、36 h收集細胞，檢測細胞中IFN-α的轉(zhuǎn)錄水平。由圖3可知，RdRp蛋白于12 h極顯著促進IFN-α的轉(zhuǎn)錄（P<0.01）， 于24、36 h極顯著抑制IFN-α的轉(zhuǎn)錄（P<0.01）。

2.4 GAstV RdRp蛋白對TNF-α轉(zhuǎn)錄的影響

293細胞轉(zhuǎn)染pCMV-RdRp真核質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后12、24、36 h收集細胞，檢測細胞中TNF-α的轉(zhuǎn)錄水平。由圖4可知，RdRp蛋白于12 h顯著抑制TNF-α的轉(zhuǎn)錄（P<0.05），于24、36 h極顯著抑制TNF-α轉(zhuǎn)錄（P<0.01）。

2.5 GAstV RdRp蛋白影響IFITM的轉(zhuǎn)錄

293細胞轉(zhuǎn)染pCMV-RdRp真核質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染后12、24、36 h收集細胞，檢測細胞中IFITM1和IFITM2的轉(zhuǎn)錄水平。由圖5可知，RdRp蛋白于?24 h 極顯著抑制IFITM1轉(zhuǎn)錄（P<0.01），于36 h顯著抑制IFITM1的轉(zhuǎn)錄（P<0.05），于12、36 h極顯著促進IFITM2的轉(zhuǎn)錄，于24 h極顯著抑制IFITM2轉(zhuǎn)錄（P<0.01）。

3 討論與結(jié)論

自2016年末，我國許多養(yǎng)鵝地區(qū)頻繁發(fā)生以雛鵝痛風(fēng)為主要癥狀的疫病，發(fā)病率高達80%，死亡率在20%～70%之間，給我國養(yǎng)鵝業(yè)的發(fā)展造成了巨大經(jīng)濟損失［16］。痛風(fēng)主要引起3周齡以內(nèi)雛鵝

發(fā)病，病鵝肝臟、脾臟和腎臟等內(nèi)臟器官表面及關(guān)節(jié)腔有大量的尿酸鹽沉積。研究發(fā)現(xiàn)，引起該疫病的主要原因是一種新型星狀病毒——鵝星狀病毒，病毒具有廣泛的組織嗜性，主要侵害腎臟［17］。

在痛風(fēng)發(fā)生過程中，炎癥反應(yīng)發(fā)揮重要作用。病毒感染宿主后，往往通過自身蛋白調(diào)節(jié)宿主信號通路，影響細胞因子的表達，利于自身的增殖和擴散。趨化因子是白細胞（包括：單核細胞、T細胞和自然殺傷細胞）的趨化劑。CCL2在宿主的先天免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，CCL2可吸引單核細胞和T淋巴細胞到病原體感染部分，進而引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)。人類免疫缺陷病毒（HIV-1）感染人原代巨噬細胞誘導(dǎo)CCL2表達，HIV-1感染的巨噬細胞和外周血單核細胞中，CCL2 mRNA水平均升高［18］。丙型肝炎病毒core蛋白通過NF-kB通路誘導(dǎo)巨噬細胞中CCL2的表達［19］。與低毒力相比，感染高毒力的非洲豬瘟病毒能夠誘導(dǎo)豬血液中CCL2的表達上調(diào)［20］。研究顯示，CCL2和CCL5能夠促進病毒增殖。CCL2有助于病毒自身蛋白Gag-p6介導(dǎo)的HIV-1的釋放［11］。CCL5通過上調(diào)SAMHD1水平抑制甲型流感病毒的復(fù)制［12］。本研究顯示，GAstV RdRp蛋白過表達能夠抑制CCL2的表達，而對于CCL5，RdRp蛋白過表達后早期促進CCL5表達，后期抑制CCL5表達。同時，GAstV RdRp蛋白過表達后早期促進IFN-α轉(zhuǎn)錄，后期抑制IFN-α轉(zhuǎn)錄，且影響抗病毒蛋白IFITM1和IFITM2的轉(zhuǎn)錄水平。趨化因子在病毒感染宿主后，在宿主體內(nèi)廣泛擴散中發(fā)揮重要作用，而IFN和抗病毒蛋白具有重要的抗病毒特性。這些因子的改變是否會導(dǎo)致GAstV廣泛的組織嗜性，利于病毒增殖有待進一步研究。

研究顯示，許多病毒感染會導(dǎo)致炎癥反應(yīng)劇烈發(fā)生，產(chǎn)生的炎癥因子進一步影響病毒的增殖。白細胞介素（IL）-1β是一種關(guān)鍵的先天細胞因子，對免疫激活和促進炎癥過程至關(guān)重要。流感病毒H1N1感染導(dǎo)致兒童體內(nèi)IL-1β的表達上調(diào)［21］，禽流感病毒感染導(dǎo)致雞巨噬細胞分泌IL-1β［22］。IL-1β 能夠抑制體內(nèi)乙型肝炎病毒的復(fù)制，而乙型肝炎病毒通過抑制NF-κB信號通路進而抑制由LPS激活的炎性小體的激活和IL-1β的產(chǎn)生，從而逃避宿主的先天性免疫反應(yīng)［20］。犬流感病毒感染巨噬細胞后，誘導(dǎo)TNF-α的分泌和細胞死亡［23］。貓傳染性腹膜炎病毒感染巨噬細胞，誘導(dǎo)TNF-α的分泌，上調(diào)Ⅱ型貓傳染性腹膜炎病毒受體貓氨基肽酶N在貓巨噬細胞中的表達，利于病毒感染［14］。豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染巨噬細胞后誘導(dǎo)TNF-α的分泌，進而抑制豬瘟病毒的復(fù)制，致使臨床上出現(xiàn)豬繁殖與呼吸綜合征感染，導(dǎo)致豬瘟疫苗免疫失敗［24］。在對患痛風(fēng)雛鵝腎臟中相關(guān)炎性因子和炎性信號分子的表達水平進行研究時顯示，腎臟中 IL-1β 和TNF-α的表達水平顯著升高，導(dǎo)致雛鵝腎臟出現(xiàn)嚴(yán)重的炎性損傷［15］。本研究顯示，GAstV RdRp蛋白顯著誘導(dǎo)IL-1β的轉(zhuǎn)錄水平，抑制 TNF-α 的轉(zhuǎn)錄水平。TNF-α的轉(zhuǎn)錄水平下降是否會促進GAstV的增殖，而GAstV的增殖是否會導(dǎo)致病毒蛋白RdRp誘導(dǎo)IL-1β的產(chǎn)生，進而導(dǎo)致腎臟的損傷和尿酸鹽沉積，其具體機制有待于進一步深入研究。

本研究顯示，GAstV RdRp蛋白過表達能夠誘導(dǎo)IL-1β的轉(zhuǎn)錄，抑制CCL2、TNF-α和IFITM1的轉(zhuǎn)錄；早期促進CCL5和IFN-α的轉(zhuǎn)錄，后期抑制CCL5和IFN-α的轉(zhuǎn)錄；早期和晚期促進IFITM2轉(zhuǎn)錄，中期抑制IFITM2轉(zhuǎn)錄。

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基金項目：信陽農(nóng)林學(xué)院青年教師基金（編號：QN2021010）；2023年度河南省重點研發(fā)與推廣專項（科技攻關(guān)）資助項目（編號：232102111043）；河南省高等學(xué)校青年骨干教師培養(yǎng)計劃；信陽農(nóng)林學(xué)院家禽重大疫病防控科技創(chuàng)新團隊資助項目（編號：2022CXTD06）。

作者簡介：饒 丹（1988—），女，江西南昌人，碩士，講師，主要從事動物病毒學(xué)研究。E-mail：raodan2007@126.com。

通信作者：董建國，博士，副教授，主要從事動物病毒學(xué)研究。E-mail：dongjianguo213@163.com。