于永利

(吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫系, 長(zhǎng)春 130021)

2023年, 諾貝爾生理學(xué)/醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予了卡塔林·卡里科(Katalin Karik)和德魯·韋斯曼(Drew Weissman),表彰她們?yōu)檠兄?、生產(chǎn)嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)mRNA疫苗(SARS-CoV-2 mRNA疫苗) 做出的貢獻(xiàn)[1,2]。在美國(guó)賓夕法尼亞大學(xué)工作期間,卡里科和韋斯曼建立了體外轉(zhuǎn)錄(in vitro-transcription, IVT) 制備假尿苷(pseudouridine)修飾信使RNA(mRNA)的技術(shù)[3]。Pfizer/BioNTech 公司和Moderna公司采用該技術(shù)生產(chǎn)出SARS-CoV-2 mRNA疫苗[4]。這些疫苗的“抗原”成分是編碼SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)的假尿苷修飾mRNA[5]。自從SARS-CoV-2爆發(fā)流行以來(lái),Pfizer/BioNTech 和Moderna生產(chǎn)的SARS-CoV-2 mRNA疫苗,聯(lián)同其他SARS-CoV-2疫苗,在全世界被應(yīng)用了130多億劑[1]。

新年伊始,一項(xiàng)研究揭示,假尿苷修飾mRNA在翻譯時(shí)會(huì)出現(xiàn)+1核糖體框架移碼(+1 ribosomal frameshifting),產(chǎn)生異常的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。這些產(chǎn)物可能引起非預(yù)想的后果(unintended consequences)[6,7]。

1 RNA轉(zhuǎn)錄本的核苷酸修飾

天然狀態(tài)下,RNA轉(zhuǎn)錄物本(RNA transcripts)的核苷酸修飾發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后,存在于包括古細(xì)菌、細(xì)菌和真核生物的所有生命體[8]。已發(fā)現(xiàn)的核苷酸修飾超過(guò)140種,以6-甲基腺嘌呤[m(6)A]、5-甲基胞嘧啶[m(5)C]和假尿嘧啶(Ψ)修飾較為常見(jiàn)[9]。

發(fā)生核苷酸修飾最多的RNA轉(zhuǎn)錄本是轉(zhuǎn)移RNA(transfer RNAs, tRNAs)10]。這些修飾關(guān)系 tRNA的折疊、穩(wěn)定和解碼(decoding)[11,12]。核糖體RNA(ribosomal RNAs, rRNA)的核苷酸修飾主要發(fā)生在結(jié)構(gòu)保守功能區(qū),關(guān)系核糖體的組裝[13]。

細(xì)菌、人和酵母的mRNA都可發(fā)生核苷酸修飾。細(xì)菌mRNA編碼區(qū)有豐富的m(6)A[14]。在體外翻譯實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),從含m(5)C 的細(xì)菌mRNA密碼子翻譯出了非該密碼子編碼的氨基酸[15]。這揭示,修飾核苷酸會(huì)引起“核酸序列非依賴(lài)性氨基酸突變”。人mRNA 存在廣泛的m(5)C[16]修飾。在酵母和人的mRNA,天然存在Ψ,其數(shù)量受假尿苷合成酶(pseudouridine synthases)調(diào)節(jié)[17,18]。Ψ既影響mRNA的半衰期[19]和結(jié)構(gòu)[20,21],也影響其翻譯保真。位于mRNA開(kāi)放閱讀內(nèi)的Ψ可引起翻譯蛋白質(zhì)的氨基酸替換[17]。在大腸桿菌中,tRNA可“讀過(guò)”(read-through)含Ψ的終止密碼 (ΨAA, ΨAG, ΨGA)。這揭示,Ψ可使終止密碼 失去終止蛋白質(zhì)翻譯的的功能[22]。不僅如此,Ψ還可以使終止密碼變成特定氨基酸的密碼子,如ΨAA是絲氨酸的密碼子, ΨAG編碼蘇氨酸,ΨGA 編碼酪氨酸或苯丙氨酸[23]。這些工作提示,假尿嘧啶修飾IVT mRNA(Ψ-IVT mRNA)在翻譯時(shí)可能產(chǎn)生“異常”蛋白質(zhì)。

2 Ψ-IVT mRNA在翻譯過(guò)程中發(fā)生的+1核糖體框架移碼

為了研究Ψ-IVT mRNA[24]的翻譯保真,Mulroney等設(shè)計(jì)了能檢測(cè)+1 核糖體框架移碼(+1 ribosome frameshifting)的Fluc+1FS mRNA的報(bào)告系統(tǒng)。+1核糖體框架移碼是指在翻譯蛋白質(zhì)時(shí),核糖體在mRNA 上滑過(guò)了1個(gè)密碼子的第1個(gè)核苷酸,結(jié)果使該密碼子的第2個(gè)核苷酸成為“緊鄰”下游密碼子的第1個(gè)核苷酸,第3個(gè)核苷酸成為“次鄰”下游密碼子的第1個(gè)核苷酸,結(jié)果使翻譯蛋白質(zhì)發(fā)生移碼“突變。突變點(diǎn)上游的蛋白質(zhì)處于“正框”(in-frame),下游 的 “出框”(out-of-frame)?！俺隹颉笔沟鞍踪|(zhì)的下游 “面目全非”。若讀出新的終止密碼,也會(huì)產(chǎn)生未成熟(截短)蛋白質(zhì)。Fluc+1FS mRNA的上游是編碼螢火蟲(chóng)發(fā)光素酶(Fluc)氨基端的mRNA(NFluc mRNA),下游是編碼Fluc羧基端的mRNA(CFluc mRNA)。NFluc mRNA是正框mRNA。CFluc mRNA是+1框架(+1 frame) mRNA。采用體外轉(zhuǎn)錄方法制備Fluc+1FS mRNA在兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物翻譯Fluc。若產(chǎn)生了無(wú)發(fā)光催化活性的蛋白質(zhì),說(shuō)明Fluc+1FS mRNA翻譯時(shí)未發(fā)生+1核糖體框架移碼。因?yàn)?未發(fā)生+1核糖體框架移碼的Fluc+1FS mRNA不能翻譯出正框CFluc。若產(chǎn)生有發(fā)光催化活性的蛋白質(zhì),說(shuō)明Fluc+1FS mRNA在翻譯時(shí)發(fā)生+1 核糖體框架移碼。因?yàn)?發(fā)生+1核糖體框架移碼可糾正的CFluc mRNA的+1出框,使其恢復(fù)“正框”,進(jìn)而產(chǎn)生有發(fā)光催化活性的全長(zhǎng)Fluc。這樣,檢測(cè)螢火蟲(chóng)發(fā)光素酶的活性就可判定Fluc+1FS mRNA在翻譯過(guò)程中是否出現(xiàn)+1核糖體框架移碼。有活性,指示發(fā)生了+1核糖體框架移碼;無(wú)活性,指示未發(fā)生+1核糖體框架移碼。活性高,代表發(fā)生+1 核糖體框架移碼的蛋白質(zhì)多;活性低,代表正框的蛋白質(zhì)多[6,7]。

Mulroney等采用體外翻譯方法制備了假尿苷(Ψ)修飾Fluc+1FS mRNA(Ψ-Fluc+1FS mRNA),采用兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物翻譯了Ψ-Fluc+1FS mRNA,檢測(cè)翻譯產(chǎn)物的發(fā)光催化活性。結(jié)果是:(1)從野生型Fluc mRNA 翻譯出高發(fā)光催化活性蛋白質(zhì);(2)從未修飾Fluc+1FS mRNAs翻譯出無(wú)發(fā)光催化活性蛋白質(zhì),證明翻譯時(shí)未發(fā)生+1 核糖體框架移碼;(3)從Ψ-Fluc+1FS mRNA 翻譯出有發(fā)光催化活性的蛋白質(zhì),證明翻譯時(shí)發(fā)生+1 核糖體框架移碼。這揭示,Ψ-IVT mRNA在翻譯時(shí)發(fā)生+1 核糖體框架移碼,產(chǎn)生了非預(yù)想(unintended) 蛋白質(zhì)[6,7]。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),從Ψ-Fluc+1FS mRNA 翻譯出+1核糖體框架移碼蛋白質(zhì)(+1移框蛋白質(zhì))的比率占正框蛋白的 8%;Ψ-IVT mRNA在Hella 細(xì)胞中也翻譯出了+1移框蛋白質(zhì);用免疫印記(Western blotting)方法可檢測(cè)到從Ψ-IVT mRNA翻譯出的+1移框蛋白質(zhì)[6,7]。

3 假尿苷修飾SARS-CoV-2 S 蛋白編碼mRNA的+1核糖體框架移碼

SARS-CoV-2 mRNA 疫苗(Pfizer/BioNTech公司生產(chǎn)的BNT162b2和Moderna 公司生產(chǎn)的mRNA-1273)的“抗原”是編碼SARS-CoV-2 刺突蛋白(S蛋白)的Ψ-IVT mRNA[6]。

為了判定SARS-CoV-2 mRNA 疫苗是否會(huì)產(chǎn)生+核糖體框架移碼蛋白質(zhì),Mulroney等用BNT162b2免疫小鼠,然后檢測(cè)其脫靶T細(xì)胞反應(yīng)(off-target T-cell responses)。檢測(cè)方法是干擾素-γ (IFNγ)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)(IFNγ-ELISpot)。免疫后,BNT162b2中編碼SARS-CoV-2 S蛋白的Ψ-IVT mRNA被遞送入抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell, APC)。在APC中,Ψ-IVT mRNA被翻譯成“正框”S蛋白。S蛋白的T細(xì)胞表位(抗原肽)被APC提呈給T淋巴細(xì)胞(T 細(xì)胞)使其激活。激活的T細(xì)胞產(chǎn)生干擾素。用IFNγ-ELISpot檢測(cè)產(chǎn)生IFNγ 的T細(xì)胞(IFNγ+T細(xì)胞)的數(shù)量,可判定T細(xì)胞的激活。攜帶T細(xì)胞表位的抗原肽(合成肽)能刺激特異性T細(xì)胞產(chǎn)生IFNγ。IFNγ+T細(xì)胞能在IFNγ-ELISpot中形成斑點(diǎn)。斑點(diǎn)顏色越深,指示IFNγ產(chǎn)生越多。斑點(diǎn)密集,指示IFNγ+T細(xì)胞多。免疫后,若BNT162b2中的編碼SARS-CoV-2 S蛋白的Ψ-IVT mRNA在翻譯時(shí)發(fā)生+核糖體框架移碼,就會(huì)產(chǎn)生+1移框蛋白質(zhì)。+1移框蛋白質(zhì)上會(huì)出現(xiàn)新的T細(xì)胞表位。新T細(xì)胞表位誘導(dǎo)脫靶T細(xì)胞反應(yīng)。脫靶是指不針對(duì)SARS-CoV-2 S蛋白。攜帶+1核糖體框架移碼蛋白T表位的抗原肽(合成肽)可激活特異性T細(xì)胞產(chǎn)生IFNγ,使其成為特異性IFNγ+T細(xì)胞。采用IFNγ-ELISpot計(jì)量這種細(xì)胞,就可以判定編碼SARS-CoV-2 S蛋白的Ψ-IVT mRNA在翻譯時(shí)是否發(fā)生了+1核糖體框架移碼。因?yàn)?+1移框蛋白質(zhì)是攜帶新T細(xì)胞表位的異常蛋白質(zhì)[6]。在BNT162b2免疫小鼠體內(nèi),既檢測(cè)到靶向SARS-CoV-2 S蛋白的T細(xì)胞反應(yīng),也檢測(cè)到脫靶T細(xì)胞反應(yīng)。相比之下,在 ChAdOx1 nCoV-19免疫小鼠,僅能檢測(cè)到靶向SARS-CoV-2 S蛋白的T細(xì)胞反應(yīng)。ChAdOx1nCoV-19是阿里斯康公司生產(chǎn)腺病毒載體SARS-CoV-2 疫苗,屬非mRNA 疫苗(non-mRNA vaccine)。這些結(jié)果表明,從BNT162b2 S蛋白編碼Ψ-IVT mRNA翻譯出了+1核糖體框架移碼蛋白質(zhì),這些蛋白質(zhì)誘導(dǎo)脫靶T細(xì)胞免疫(off-target T cell immunity)[6]。

在21 位免疫BNT162b2的志愿者,也檢測(cè)到了+1核糖體框架移碼蛋白質(zhì)誘導(dǎo)的脫靶T細(xì)胞反應(yīng)。相比之下,在20位免疫ChAdOx1 nCoV-19的志愿者,僅檢測(cè)到了靶向SARS-CoV-2 S蛋白的T細(xì)胞反應(yīng)。這表明,BNT162b2 S蛋白編碼Ψ-IVT mRNA在人體內(nèi)翻譯時(shí)也發(fā)生了+核糖體框架移碼[6]。

4 假尿嘧啶修飾 mRNA +1框架移碼的發(fā)生機(jī)制

用35S-甲硫氨酸摻入法測(cè)定Ψ-IVT Fluc mRNA和IVT Fluc mRNA 的體外翻譯速率時(shí)發(fā)現(xiàn):(1)在30 min內(nèi),和IVT Fluc mRNA相比,從Ψ-IVT Fluc mRNA 翻譯出的全長(zhǎng)Fluc(螢火蟲(chóng)發(fā)光素酶)顯著減少。這指示了翻譯速率減慢。減慢的原因可能是核糖體滑動(dòng)“滯頓”;(2)Ψ-IVT Fluc mRNA 翻譯出較高比例的截短肽。這表明,Ψ使IVT Fluc mRNA在翻譯發(fā)生+1核糖體框架移碼;(3)巴龍霉素可以提高Ψ-IVT Fluc mRNA 的翻譯速率。這提示,核糖體滑動(dòng)滯頓由tRNA 的反密碼子和mRNA的含Ψ密碼子的“匹配”不佳引起。在蛋白質(zhì)翻譯解碼過(guò)程中,攜帶氨基酸的-tRNA 的反密碼子和mRNA 上的密碼子相互識(shí)別、作用,導(dǎo)致 18S rRNA 局部構(gòu)象變化和新肽鍵形成。若tRNA 的反密碼子和mRNA的密碼子結(jié)合不 “嚴(yán)絲合縫”,核糖體的滑動(dòng)就會(huì)減慢,出現(xiàn)“滯頓”。“滯頓”可導(dǎo)致tRNA 跳過(guò)1個(gè)核苷(skip a nucleotide)。這樣,+1核糖體框架移碼就發(fā)生了[6]。巴龍霉素與延伸核糖體(elongating ribosomes)中的18S rRNA 結(jié)合并改變其在解碼中心的構(gòu)象,促進(jìn)tRNA 的反密碼子和mRNA上匹配不佳的密碼子之間的識(shí)別、作用,因而可以改善假尿苷誘導(dǎo)的核糖體滯頓(pseudouridine-induced ribosome stalling)[6]。

5 問(wèn)題與展望

伴隨著SARS-CoV-2 mRNA疫苗的應(yīng)用,Ψ-IVT mRNA 已/正出現(xiàn)在以多種疾病為適應(yīng)癥的mRNA疫苗/藥物的臨床前和臨床研究(preclinical and clinical studies)中[25-32]。

Ψ-IVT mRNA在翻譯過(guò)程中發(fā)生+1核糖體框架移碼現(xiàn)象的揭示了一系列應(yīng)該關(guān)注和探討的問(wèn)題:應(yīng)用SARS-CoV-2 mRNAs疫苗可能引起“非預(yù)期反應(yīng)”。+1核糖體框架移碼使SARS-CoV-2 mRNAs疫苗“短斤少兩”,效力下降。因?yàn)?1移框蛋白質(zhì)是脫靶蛋白質(zhì),不誘導(dǎo)針對(duì)SARS-CoV-2 S蛋白的保護(hù)性免疫反應(yīng)。不僅如此,脫靶蛋白質(zhì)可能有如下副作用:(1)刺激產(chǎn)生誘騙抗體(decoy antibody)。誘騙抗體不能有效結(jié)合SARS-CoV-2 S蛋白而阻斷SARS-CoV-2進(jìn)入宿主細(xì)胞。誘騙抗體可能促進(jìn)SARS-CoV-2感染。(2)誘發(fā)自身免疫性疾病。脫靶蛋白質(zhì)可能存在與自身成分有同源性的“新”T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位,針對(duì)這些表位的脫靶T細(xì)胞和脫靶抗體(off-target T-cell or antibody)可能會(huì)攻擊自身細(xì)胞。(3)展現(xiàn)毒性。脫靶蛋白質(zhì)可能多種多樣。一旦有毒,可造成直接傷害。

要重新審視以Ψ-IVT mRNA為基礎(chǔ)的mRNA疫苗/藥物的合理性。在IVT mRNA中摻入Ψ的主要目的是消除其激發(fā)炎癥反應(yīng)的性質(zhì)[3]。細(xì)想一下,抗傳染病疫苗和腫瘤疫苗中的IVT mRNA若能激發(fā)非特異性炎癥反應(yīng)未嘗不是一種想要的性質(zhì)。疫苗需有佐劑。有效的佐劑應(yīng)能激發(fā)炎癥反應(yīng)。未經(jīng)Ψ修飾的IVT mRNA可能是一種“抗原分子內(nèi)佐劑”。因此,似可考慮采用“不修飾”的IVT mRNA研制疫苗。

有必要采用其他核苷酸取代Ψ研制IVT mRNA疫苗/藥物。并不是所有的核苷酸修飾的IVT mRNA都會(huì)在翻譯蛋白質(zhì)時(shí)發(fā)生+1核糖體框架移碼。

鑒于+1核糖體框架移碼的發(fā)現(xiàn),有必要在研制IVT mRNA疫苗/藥物的臨床前和臨床試驗(yàn)中“確證” IVT mRNA的翻譯保真(translation fidelity)性。