蘇彩榮，余森艷，黎蘭明，李秀秀，覃瑤雙，農(nóng)天霸

（廣西民族師范學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西 崇左 532200）

0 引言

三華李屬薔薇科李屬，主要在廣東、廣西等地區(qū)種植，廣西最大的三華李生產(chǎn)基地是賀州市八步區(qū)[1]。成熟的三華李外觀呈圓形，果肉呈紫紅色，肉厚核小、脆甜可口、風(fēng)味獨(dú)特。三華李富含礦物質(zhì)、維生素、有機(jī)酸等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，此外還含有鈣、鐵、磷、核黃素、維C、多酚類物質(zhì)和類胡蘿卜素[2]。三華李主要用于鮮食，在華南地區(qū)盛行將三華李做成酸嘢，部分加工成果脯[3]、果汁飲料[4]等產(chǎn)品，但將其用于果醋釀造還鮮有報(bào)道。木瓜屬番木瓜科番木瓜屬，廣西是我國(guó)木瓜的主要產(chǎn)區(qū)，果實(shí)為橙色或橙紅色，果肉多汁味甜，含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素、有機(jī)酸等多種成分，也含有豐富的超氧化物歧化酶，具有抗衰老、抗癌、防輻射等作用，是兼具營(yíng)養(yǎng)價(jià)值與藥用價(jià)值的水果之一[5]。

果醋是一種以水果或者多種水果加工下腳料為主要原料，經(jīng)過(guò)酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵2 段發(fā)酵工藝釀造而成的酸性飲品[6-7]。果醋營(yíng)養(yǎng)豐富、風(fēng)味優(yōu)良，具有促消化、抗氧化、促進(jìn)新陳代謝、調(diào)節(jié)酸堿平衡和降血脂等功效[8-10]，是集營(yíng)養(yǎng)、保健、食療等功能為一體的新型飲品[11]。三華李與木瓜均不耐貯藏，鮮銷有限，將2 種原料結(jié)合制成三華李-木瓜復(fù)合果醋，既能滿足消費(fèi)者對(duì)健康果醋飲品的追求，增加復(fù)合果醋的花色品種，又可突破水果盛產(chǎn)帶來(lái)的“鮮銷瓶頸”，提升三華李和木瓜的經(jīng)濟(jì)附加值，培育和拉動(dòng)三華李與木瓜產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

三華李、木瓜，購(gòu)自崇左農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；果酒酵母、綿白糖，安琪酵母（崇左） 有限公司提供；果醋菌，煙臺(tái)帝伯士自釀?dòng)邢薰咎峁?5%食用酒精，河南漢永酒精有限公司提供；0.05 mol/L 氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液，飛凈生物科技有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

JYZ-E3C 型榨汁機(jī)，九陽(yáng)股份有限公司產(chǎn)品；LRH-400A 型生化培養(yǎng)箱，廣東泰宏君科學(xué)儀器股份有限公司產(chǎn)品；YP5002 型電子天平，上海佑科儀器儀表有限公司產(chǎn)品；PAL-1 型手持糖度計(jì)，深圳市卓越儀器儀表有限公司產(chǎn)品；酒精計(jì)，浙江力辰儀器科技有限公司產(chǎn)品；HWS-26 型電熱恒溫水浴鍋，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；BD-320HEM型冰箱，青島海爾特種電冰柜有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

①三華李→清洗→去核→切塊→熱燙→三華李果漿；

②木瓜→清洗→去籽→切塊→熱燙→打漿→木瓜漿；

①+②→調(diào)配→調(diào)糖→殺菌、冷卻→酒精發(fā)酵→過(guò)濾→調(diào)整酒精度→過(guò)濾→殺菌→成品。

1.3.2 操作要點(diǎn)

（1） 三華李果漿的制備。挑選成熟適度、無(wú)霉變腐爛的新鮮市售三華李，經(jīng)清洗、去核、切塊后熱燙90 s，再按三華李與水質(zhì)量比1∶1 打漿，獲得三華李果漿備用。

（2） 木瓜漿的制備。選擇八、九成熟的新鮮木瓜，清洗、去籽、切塊后熱燙90 s，以鈍化木瓜蛋白酶活性，再按木瓜與水質(zhì)量比1∶1 打漿，獲得木瓜漿備用。

（3） 調(diào)配、調(diào)糖。將制備好的三華李果漿、木瓜漿按照一定的質(zhì)量比例混合，再用綿白糖調(diào)整初始糖度至適宜范圍。

（4） 殺菌、冷卻。將調(diào)糖后的三華李-木瓜復(fù)合果漿于100 ℃條件下滅菌5 min，冷卻備用。

（5） 酒精發(fā)酵。通過(guò)前期試驗(yàn)確定三華李-木瓜復(fù)合果酒發(fā)酵的條件為三華李果漿與木瓜漿的質(zhì)量比例1∶1，酵母添加量0.3%，發(fā)酵溫度27 ℃，初始糖度22%，發(fā)酵時(shí)間5 d，在此條件下發(fā)酵所得的三華李-木瓜復(fù)合果酒具有較好的風(fēng)味，酒體呈橙色，酒香濃郁、醇厚爽口。

（6） 調(diào)整酒精度。利用酒精計(jì)測(cè)定酒精度，將復(fù)合果酒用無(wú)菌水及食用酒精調(diào)整到醋酸發(fā)酵所需要的酒精度。

（7） 醋酸發(fā)酵。在調(diào)整酒精度的三華李-木瓜復(fù)合果酒中加入果醋菌，敞口靜置進(jìn)行醋酸發(fā)酵，每天攪拌2～3 次，以提高溶氧量。

（8） 殺菌。將發(fā)酵結(jié)束的三華李-木瓜復(fù)合果醋過(guò)濾后于95～100 ℃條件下殺菌約10 min，然后迅速冷卻至常溫。

1.4 醋酸發(fā)酵單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以初始酒精度、果醋菌添加量、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時(shí)間4 個(gè)因素進(jìn)行醋酸發(fā)酵階段的單因素試驗(yàn)，設(shè)計(jì)各因素水平為初始酒精度6%，7%，8%，9%，10% （V/V）；果醋菌添加量1%，2%，3%，4%，5%；發(fā)酵溫度30，32，34，36，38 ℃；發(fā)酵時(shí)間5，7，9，11，13 d。當(dāng)研究其中1 個(gè)因素時(shí)，其余的3 個(gè)因素取各水平的中間值，以總酸為指標(biāo)，研究這4 個(gè)因素對(duì)醋酸發(fā)酵的影響。

1.5 醋酸發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在醋酸發(fā)酵單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以Y 總酸（以乙酸計(jì)，質(zhì)量濃度g/100 mL） 為響應(yīng)值，根據(jù)Box-benhnken 設(shè)計(jì)原理，以初始酒精度（A）、果醋菌添加量（B）、發(fā)酵溫度（C）、發(fā)酵時(shí)間（D） 為因素設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，確定復(fù)合果醋的最佳發(fā)酵工藝條件。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Origin2021 軟件完成單因素試驗(yàn)作圖，運(yùn)用Design Expert 8.0.6 軟件完成響應(yīng)面試驗(yàn)作圖及數(shù)據(jù)處理與分析。

1.7 理化成分測(cè)定

酒精度的測(cè)定：使用酒精計(jì)測(cè)定。

糖度的測(cè)定：使用手持糖度計(jì)測(cè)定。

總酸測(cè)定：采用酸堿滴定法（以乙酸計(jì)，參照GB 12456—2021 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中總酸的測(cè)定）。

2 結(jié)果與分析

2.1 醋酸發(fā)酵最佳工藝條件的確定

2.1.1 初始酒精度的確定

初始酒精度對(duì)醋酸發(fā)酵的影響見(jiàn)圖1。

圖1 初始酒精度對(duì)醋酸發(fā)酵的影響

由圖1 可知，三華李-木瓜復(fù)合果醋產(chǎn)品的總酸含量在初始酒精度為6%～9%（V/V） 范圍內(nèi)呈升高的趨勢(shì)；當(dāng)初始酒精度超過(guò)9%（V/V） 時(shí)，總酸含量開(kāi)始下降。這可能是因?yàn)榫凭冗^(guò)高會(huì)抑制果醋菌的生長(zhǎng)代謝，降低其活力，導(dǎo)致發(fā)酵結(jié)束時(shí)總酸的含量偏低[12]?？梢?jiàn)，酒精度的高低會(huì)影響總酸產(chǎn)量。因此，選擇該因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)的3 個(gè)水平為8%，9%，10%（V/V）。

2.1.2 果醋菌添加量的確定

果醋菌添加量對(duì)醋酸發(fā)酵的影響見(jiàn)圖2。

圖2 果醋菌添加量對(duì)醋酸發(fā)酵的影響

由圖2 可知，當(dāng)果醋菌添加量為3%時(shí)，總酸含量達(dá)到最大；果醋菌添加量為1%～3%時(shí)，總酸含量逐漸升高，超過(guò)3%時(shí)，總酸含量開(kāi)始降低。原因可能是果醋菌添加量較低時(shí)，菌體生長(zhǎng)速度慢，發(fā)酵液中的酒精不能在短時(shí)間內(nèi)盡快轉(zhuǎn)化為醋酸[13]。當(dāng)果醋菌添加量在適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)及溶氧量大時(shí)，有利于醋酸的產(chǎn)生，而果醋菌添加量過(guò)多時(shí)，一方面果醋菌的生長(zhǎng)繁殖會(huì)消耗過(guò)多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；另一方面會(huì)導(dǎo)致溶氧量降低使醋酸生成量下降[14]。因此，選擇該因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)的3 個(gè)水平為2%，3%，4%。

2.1.3 發(fā)酵溫度的確定

發(fā)酵溫度對(duì)醋酸發(fā)酵的影響見(jiàn)圖3。

圖3 發(fā)酵溫度對(duì)醋酸發(fā)酵的影響

由圖3 可知，發(fā)酵溫度低于34 ℃時(shí)，總酸含量隨發(fā)酵溫度增加而升高；當(dāng)發(fā)酵溫度超過(guò)34 ℃時(shí)，總酸含量呈下降趨勢(shì)。這可能是因?yàn)檫m宜的溫度有利于果醋菌生長(zhǎng)繁殖和產(chǎn)酸；當(dāng)發(fā)酵溫度偏低或偏高時(shí)，果醋菌的酶活性被抑制，酒精轉(zhuǎn)化為醋酸的能力下降[15]。因此，選擇該因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)的3個(gè)水平為32，34，36 ℃。

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間的確定

發(fā)酵時(shí)間對(duì)醋酸發(fā)酵的影響見(jiàn)圖4。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)醋酸發(fā)酵的影響

由圖4 可知，三華李-木瓜復(fù)合果醋在發(fā)酵過(guò)程中，總酸含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈先升高后緩慢降低的趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為9 d 時(shí)總酸含量達(dá)到最高。發(fā)酵初期總酸含量低，這可能是因?yàn)榘l(fā)酵時(shí)間太短，發(fā)酵不充分，隨著時(shí)間的推移，發(fā)酵液的總酸含量趨于平緩，表明醋酸發(fā)酵基本結(jié)束[16]。因此，選擇該因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)的3 個(gè)水平為9，11，13 d。

2.2 醋酸發(fā)酵工藝響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)Box-behnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[17]，在醋酸發(fā)酵單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)醋酸發(fā)酵響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平（見(jiàn)表1），并以Y總酸為響應(yīng)值，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)（見(jiàn)表2） 和回歸分析與結(jié)果（見(jiàn)表3）。

表1 醋酸發(fā)酵響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

表2 醋酸發(fā)酵響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果

表3 回歸分析與結(jié)果

醋酸發(fā)酵響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1，醋酸發(fā)酵響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2，回歸分析與結(jié)果見(jiàn)表3。

利用Design Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行回歸分析，得到的回歸方程式為：

由表3 可知，模型的p＜0.000 1＜0.01，表明模型方程極顯著，說(shuō)明試驗(yàn)方法可行可靠；失擬項(xiàng)p=0.312 5＞0.05，失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明該模型的擬合度較好，該方程能夠很好地反映初始酒精度、果醋菌添加量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間和總酸之間的準(zhǔn)確關(guān)系，可以利用回歸方程式得出三華李-木瓜復(fù)合果醋的最佳工藝條件，回歸分析結(jié)果顯示R2=0.956 9，R2Adj=0.913 8，兩者相差＜0.2，說(shuō)明預(yù)測(cè)值與真實(shí)值有很好的相關(guān)性。一次項(xiàng)A對(duì)總酸有極顯著影響，C對(duì)總酸有顯著影響；交互項(xiàng)BD對(duì)總酸有極顯著影響，AC、BC對(duì)總酸有顯著影響；二次項(xiàng)A2，B2，C2，D2對(duì)總酸有極顯著影響，其他各因素對(duì)總酸影響不顯著（p＞0.05）。

2.3 三華李-木瓜復(fù)合果醋工藝優(yōu)化響應(yīng)面圖

從Design Expert 8.0.6.1 響應(yīng)面分析軟件中得到兩兩因素間的三維響應(yīng)曲面圖。曲面圖可直接反映各因素交互作用對(duì)果醋總酸的影響，曲面的坡度越陡，說(shuō)明該因素對(duì)果醋發(fā)酵過(guò)程的影響越大[18-19]。

各因素交互作用對(duì)總酸影響的曲面圖見(jiàn)圖5。

圖5 各因素交互作用對(duì)總酸影響的曲面圖

由圖5 可知，總體上，總酸含量隨著4 個(gè)因素的增加先上升后下降，初始酒精度、果醋菌添加量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間4 個(gè)因素之間存在交互作用。其中，總酸含量受果醋菌添加量和發(fā)酵時(shí)間交互作用強(qiáng)，對(duì)總酸的影響極顯著；初始酒精度和發(fā)酵溫度、果醋菌添加量和發(fā)酵溫度的交互作用較強(qiáng)，對(duì)總酸的影響顯著。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)響應(yīng)面分析試驗(yàn)，結(jié)合回歸方程分析得出優(yōu)化的三華李-木瓜復(fù)合果醋最佳發(fā)酵工藝條件為初始酒精度9.26%（V/V），果醋菌添加量2.98%，發(fā)酵溫度33.62 ℃，發(fā)酵時(shí)間11.12 d，在該預(yù)測(cè)條件下，果醋的總酸為5.07 g/100 mL。為了驗(yàn)證試驗(yàn)，使結(jié)果更準(zhǔn)確，根據(jù)實(shí)際情況，對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)得出的最佳工藝條件進(jìn)行如下調(diào)整：初始酒精度9%（V/V），果醋菌添加量3%，發(fā)酵溫度34 ℃，發(fā)酵時(shí)間11 d，在此發(fā)酵工藝條件下重復(fù)三華李-木瓜復(fù)合果醋發(fā)酵3 次，得出三華李-木瓜復(fù)合果醋的平均總酸為5.17 g/100 mL，該值與預(yù)測(cè)值接近，兩者之間的相對(duì)誤差只有0.2%，說(shuō)明該模型能夠很好地反映三華李-木瓜復(fù)合果醋發(fā)酵的實(shí)際情況，因此使用該方法分析三華李-木瓜復(fù)合果醋得到的數(shù)據(jù)是可靠的。

3 結(jié)論

以三華李和木瓜為原料，依次進(jìn)行酒精發(fā)酵與醋酸發(fā)酵，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析試驗(yàn)，對(duì)三華李-木瓜復(fù)合果醋在醋酸發(fā)酵過(guò)程中的主要工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得出復(fù)合果醋的最佳發(fā)酵工藝條件為初始酒精度9%（V/V），果醋菌添加量3%，發(fā)酵溫度34 ℃，發(fā)酵時(shí)間11 d，在該條件下，果醋的總酸含量達(dá)到5.17 g/100 mL，產(chǎn)品的色澤呈棕紅色，透明澄清、酸味柔和、果香協(xié)調(diào)。三華李-木瓜復(fù)合果醋的研發(fā)既可延伸三華李與木瓜的加工產(chǎn)業(yè)鏈，提升三華李和木瓜的經(jīng)濟(jì)附加值，又可增加果醋花色品種，為果醋產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展提供一定的理論參考。