包佳亮，杜賀超，李思雨，姚宏亮，蔣加進

（金陵科技學院動物科學與食品工程學院，江蘇 南京 210038）

大蒜（Allium sativumL.） 是一種常見的菜肴和調(diào)味品，富含蛋白質(zhì)、磷、鈣、鐵、鎂和硒等微量元素，不僅能提高食欲、增強消化功能，還具有降低血脂、血糖、血壓及補腦等作用[1]。大蒜作為常見的調(diào)味食材，在火鍋等餐飲行業(yè)具有很大的需求量。雖然大蒜中含有大蒜素（二烯丙基硫醚），能夠起到殺菌消炎的作用，在貯藏的過程中依然會滋生細菌，引起腐敗變質(zhì)。

大蒜的生長、貯藏和深加工過程中都伴隨著微生物的生長。謝玉清等人[2]的研究表明，大蒜根腐病與根際土壤真菌群落多樣性變化有一定關系。劉春雷等人[3]從糖醋蒜中分離出2 株芽孢桿菌屬的菌株，為后續(xù)優(yōu)良菌種的選育提供條件。邱志常[4]從黑蒜加工過程中分離得到的大蒜內(nèi)生菌主要為芽孢桿菌，包括甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌，能夠加速黑蒜褐變，促進黑蒜品質(zhì)的形成。目前，關于大蒜中微生物的報道較少，主要集中在大蒜深加工方面，缺少針對大蒜貯藏過程中微生物分析及蔥蒜等調(diào)味食材抑菌劑開發(fā)等方面的研究。

化學防腐劑生產(chǎn)和使用成本相對較低，并且防腐性能好，是當前食品生產(chǎn)過程中廣泛應用的防腐劑類型。我國規(guī)定使用的防腐劑有苯甲酸、苯甲酸鈉、山梨酸、山梨酸鉀、丙酸鈣等25 種，并規(guī)定了相應的使用范圍和添加限量[5]。生物防腐劑因安全、高效等優(yōu)點在食品行業(yè)受到廣泛關注。Nisin 在食品中的防腐、保鮮、提質(zhì)、可降解包材等作用方面已經(jīng)具有豐富的研究基礎[6]。多種新型生物抑菌劑的制備和應用，也吸引研究者的極大興趣[7]。對不同防腐劑作用機理和應用范圍等的深入研究，有利于促進開發(fā)出具有市場競爭力的抑菌產(chǎn)品，為食品保鮮拓寬途徑。

研究分離純化大蒜蒜瓣貯藏過程中的微生物，結(jié)合菌落形態(tài)、菌體形態(tài)和PCR 序列比對，分析大蒜蒜瓣中細菌多樣性，并通過抑菌圈直徑、最小抑菌濃度和最小殺菌濃度，篩選對指示菌有高效抑制作用的抑菌劑，為大蒜蒜瓣的保鮮提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 大蒜

大蒜，江蘇一號農(nóng)場科技股份有限公司提供。

1.1.2 菌種

試驗所用菌株，保存于金陵科技學院試驗B 樓402 實驗室。

1.2 試劑

Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基、Platecountagar （PCA）培養(yǎng)基，北京路橋公司提供；革蘭氏染色劑，北京索萊寶公司提供；Tris，國藥試劑提供；苯甲酸鈉、山梨酸鉀、丙酸鈉、雙乙酸鈉、脫氫乙酸，上海麥克林公司提供；無水檸檬酸，源葉生物公司提供；溶菌酶，Solarbio 公司提供；肉桂醛、殼聚糖、納他霉素、乳酸鏈球菌素，南京壽德公司提供；2×Taq Master Mix（Dye Plus），南京諾唯贊生物科技有限公司提供；DNA 分子量標準Marker，廣州東盛生物科技有限公司提供；引物合成，金唯智生物科技有限公司提供。

1.3 儀器與設備

梯度PCR 基因擴增儀，BIOER LifePro 公司產(chǎn)品；DHG-907385-III 型電熱恒溫鼓風干燥箱、HPX-160BSH-III 型恒溫恒濕箱、SPX-1508SH-II 型生化培養(yǎng)箱，新苗公司產(chǎn)品；BXM-30R 型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊公司產(chǎn)品；MX-S 型可調(diào)式混勻儀，北京大龍實驗室產(chǎn)品；雪花制冰機，雪科公司產(chǎn)品；DYY-6C 型穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀，南京大學普陽科學儀器研究所產(chǎn)品；H2050R 型臺式高速冷凍離心機，湘儀公司產(chǎn)品；BHC-11300IIA/B3 型生物潔凈安全柜、ZQLY-300 型振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器公司產(chǎn)品；BlueStarA 型分光光度計，北京萊伯泰科公司產(chǎn)品。

1.4 試驗方法

1.4.1 細菌的分離純化

將大蒜按照工廠加工流程處理并清洗，室溫貯藏5 d 后，取25 g 蒜瓣樣品加入到225 mL 生理鹽水中混勻，倍比稀釋后取10-4，10-5和10-6這3 個梯度的稀釋液各1 mL，傾注在PCA 平板中，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h。觀察并記錄細菌的菌落形態(tài)，挑取不同形態(tài)的細菌接種到LB 液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。進一步純化后，用革蘭氏染色法觀察菌體形態(tài)。

1.4.2 PCR 擴增和測序

挑取單菌落到LB 肉湯中，放在溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速180 r/min搖床上培養(yǎng)制得新鮮的菌液，取1 mL 新鮮菌液，以轉(zhuǎn)速8 000 r/min 離心5 min，棄去上清液，加100 μL 的無菌水，充分混勻后煮沸10 min，以轉(zhuǎn)速8 000 r/min 離心5 min 后，取上清作為模板。PCR 擴增反應體系：2×Taq Master Mix 12.5 μL，引16S rDNA 引物（27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R：5'-GG-TTACCTTGTTACGACTT-3'） 各1 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 補足至25 μL。反應參數(shù)：預變性95 ℃，10 min；變性95 ℃，15 s；退火58 ℃，15 s；延伸72 ℃，80 s，循環(huán)30 次；于72 ℃末端延伸10 min。

取PCR 產(chǎn)物5 μL，用1×TAE 配置1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，恒壓120 V，時間45 min，紫外凝膠成像系統(tǒng)成像，保存圖譜。觀察所提取DNA 的完整性和濃度，DNA 保存于-20 ℃冰箱待用。PCR 產(chǎn)物送去蘇州金唯智生物科技有限公司進行測序。

測序結(jié)果在NCBI 的Nucleotide BLAST 中進行比對分析。根據(jù)序列同源性，將菌種鑒定到種。

1.4.3 抑菌劑的制備

5 種化學防腐劑（山梨酸鉀、苯甲酸鈉、丙酸鈉、雙乙酸鈉和脫氫乙酸） 溶于無菌水中，配置成質(zhì)量濃度為1 024 mg/mL 的母液。納他霉素溶于無菌水配成質(zhì)量濃度32 mg/mL 母液，Nisin 溶于0.02 mol/L鹽酸配成質(zhì)量濃度20 mg/mL 的母液，殼聚糖溶于3%的檸檬酸配成質(zhì)量濃度32 mg/mL 母液，肉桂醛溶于45%酒精配成質(zhì)量濃度4 mg/mL 母液，溶菌酶溶于無菌水配成質(zhì)量濃度100 mg/mL。

1.4.4 指示菌的活化

將4 種指示菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、土生拉烏爾菌和水生拉恩菌） 菌種在無菌條件下，劃線到LB 固體培養(yǎng)基上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，從平皿上挑取菌種接種于LB 液體培養(yǎng)基中，置于振蕩培養(yǎng)箱（溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速180 r/min）中過夜培養(yǎng)。將活化好的指示菌接種到LB 液體培養(yǎng)基備用。

1.4.5 抑菌圈的測定[8]

采用瓊脂平板打孔法測定不同化學抑菌劑和生物抑菌劑對指示菌的抑菌圈。配制LB 瓊脂培養(yǎng)基100 mL，滅菌后溫度降至55 ℃左右時，加入1 mL活化的指示菌菌液，傾倒平板，凝固后用5 cm 打孔器打孔，在底部的相應位置做好記號。在孔洞內(nèi)分別加入60 μL 抑菌溶液，將平皿放置培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)24 h，用游標卡尺測量抑菌圈直徑并記錄。試驗重復3 次。抑菌環(huán)直徑大于7 mm 者，判為有抑菌作用。

1.4.6 最小抑菌濃度（MIC） 與最小殺菌濃度（MBC）的測定

MIC 的測定采用標準稀釋法[9]。取新鮮的指示菌菌液，用LB 液體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)OD600至0.6～0.8，稀釋100 倍備用。將抑菌劑在無菌條件下進行配液，96 孔板第一孔中加入100 μL 菌懸液和100 μL 相應的抑菌劑，逐級2 倍稀釋，得到質(zhì)量濃度為20.000 0，10.000 0，5.000 0，2.500 0，1.250 0，0.625 0，0.312 5，0.156 3 mg/mL 的Nisin 處理組；質(zhì)量濃度梯度為32.00，16.00，8.00，4.00，2.00，1.00，0.50，0.25 mg/mL 的納他霉素處理組；質(zhì)量濃度梯度為100.000 0，50.000 0，25.000 0，12.500 0，6.250 0，3.125 0，1.563 0，0.781 5 mg/mL 的溶菌酶處理組；質(zhì)量濃度梯度為32.00，16.00，8.00，4.00，2.00，1.00，0.50，0.25 mg/mL的殼聚糖處理組；質(zhì)量濃度梯度為4.000 0，2.000 0，1.0000，0.5000，0.2500，0.1250，0.0625，0.0313mg/mL的肉桂醛處理組。山梨酸鉀、苯甲酸鈉和丙酸鈉的最終質(zhì)量濃度為512， 256，128，64， 32，16，8，4，2，1 mg/mL；雙乙酸鈉和脫氫乙酸的最終質(zhì)量濃度為32.000 0，16.000 0，8.000 0，4.000 0，2.000 0，1.000 0，0.500 0，0.250 0，0.125 0，0.062 5 mg/mL。

LB 培養(yǎng)基作為空白對照。培養(yǎng)孔中溶劑（酒精、檸檬酸等） 作為陰性對照，觀察其對抑菌劑的抑菌效果有無干擾?？装逯苓吙瞻卓卓杉尤胝麴s水，以保持培養(yǎng)過程中水分濕度。96 孔板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h 后，觀察每組試驗結(jié)果。培養(yǎng)液澄清透明的最低濃度為MIC。試驗重復3 次。

在MIC 的基礎上，取澄清組培養(yǎng)液100 μL 均勻涂布于LB 固體培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h，觀察平板，未長菌的最低濃度為該抑菌劑的MBC。試驗重復3 次。

1.4.7 生長曲線的測定

參照唐志凌等人[10]的方法，采用紫外分光光度法測定大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、土生拉烏爾菌和水生拉恩菌的生長曲線。將供試菌接種至100 mL 液體培養(yǎng)基中，菌液培養(yǎng)至對數(shù)生長期（OD600至0.3～0.5），加入抑菌物質(zhì)，調(diào)至所需抑菌濃度1/2×MIC 處理組和1/4×MIC 處理組，同時設置空白組（不加抑菌劑的LB 肉湯培養(yǎng)基），恒溫37 ℃搖床培養(yǎng)24 h，每2 h 取樣，測定樣品的OD600，記錄結(jié)果，繪制對應的生長曲線。

1.4.8 菌落總數(shù)與大腸菌群數(shù)的測定

將大蒜蒜瓣在1×MIC 和2×MIC 的抑菌劑溶液中浸泡5～10 min，取出晾干后取25 g，裝入有無菌生理鹽水的錐形瓶中，根據(jù)GB 4789.2—2016 和GB 4789.3—2016 進行菌落總數(shù)和大腸菌群的測定。未經(jīng)過抑菌劑處理的樣品作為空白對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌多樣性分析

2.1.1 不同的菌落形態(tài)特征

大蒜蒜瓣中分離到的細菌，按照菌落形態(tài)主要可分為以下8 類（表1），其中L1 和L5 占比較大，分別為49%和23%。

表1 8 種菌株的形態(tài)學特征

8 種菌株的形態(tài)學特征見表1。

2.1.2 PCR 結(jié)果分析

從大蒜中分離純化培養(yǎng)得到的菌株，根據(jù)與Marker的對比可知，擴增后的大小為1 500 bp 左右。PCR 測序結(jié)果在NCBI 中用Nucleotide BLAST 進行比對。

菌株通過引物PCR 擴增產(chǎn)物的電泳圖見圖1，菌株的序列比對及鑒定結(jié)果見表2。

圖1 菌株通過引物PCR 擴增產(chǎn)物的電泳圖

表2 菌株的序列比對及鑒定結(jié)果

依據(jù)16S rRNA 基因序列的同源性分析，大蒜蒜瓣中的細菌有水生拉恩菌、土生拉烏爾菌、表皮葡萄球菌、腸膜明串珠菌、乳酸明串珠菌、蘇云金芽孢桿菌、成團泛菌和檸檬酸桿菌。結(jié)合菌落形態(tài)的比例，大蒜蒜瓣中分離到的主要細菌為水生拉恩菌和土生拉烏爾菌。

2.2 不同防腐劑對指示菌的抑菌效果

2.2.1 抑菌圈直徑

選擇大蒜蒜瓣中主要菌株土生拉烏爾菌和水生拉恩菌，以及典型革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和典型革蘭氏陰性菌大腸桿菌為指示菌，進行后續(xù)抑菌試驗。

5 種生物抑制劑對指示菌的抑菌圈直徑見表3。

表3 5 種生物抑制劑對指示菌的抑菌圈直徑

由表3 可知，質(zhì)量分數(shù)為1%的5 種生物抑菌劑中，肉桂醛對4 種指示菌的作用效果最好，其次是殼聚糖，納他霉素和Nisin 對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有抑菌效果，對土生拉烏爾菌和水生拉恩菌沒有抑菌效果，而溶菌酶只對大腸桿菌有抑菌效果。

選用質(zhì)量濃度為64 mg/mL 的化學抑菌劑對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、土生拉烏爾菌和水生拉恩菌的抑菌圈直徑進行比較。

5 種化學防腐劑對指示菌的抑菌圈直徑見表4。

表4 5 種化學防腐劑對指示菌的抑菌圈直徑/mm

由表4 可知，5 種化學防腐劑對4 種指示菌均有一定的抑制作用，其中雙乙酸鈉的抑菌效果最佳，對大蒜中2 種主要細菌的抑菌圈直徑都在20 mm 以上。

2.2.2 不同防腐劑對指示菌的MIC 和MBC

5 種生物抑菌劑對指示菌的MIC 和MBC見表5。

表5 5 種生物抑菌劑對指示菌的MIC 和MBC

從MIC 和MBC 結(jié)果來看，5 種生物抑菌劑對指示菌的抑菌效果最好的是肉桂醛，對土生拉烏爾菌和水生拉恩氏菌的MIC 發(fā)別為0.125 mg/mL 和0.250 mg/mL；其次是殼聚糖；Nisin 對金黃色葡萄球菌的MIC 值為0.63 mg/mL，MBC 值為1.25 mg/mL，明顯小于對大腸桿菌、土生拉烏爾菌和水生拉恩氏菌的MIC 和MBC，可能是Nisin 的抗菌活性主要針對革蘭氏陽性菌[11]。

5 種化學防腐劑對指示菌的MIC 和MBC見表6。

表6 5 種化學防腐劑對指示菌的MIC 和MBC /mg·mL-1

雙乙酸鈉是其中抑菌效果最好的一種防腐劑，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC 均為8 mg/mL，對土生拉烏爾菌和水生拉恩菌的MIC 均為4 mg/mL。防腐劑的MBC 普遍比MIC 大1 倍?；瘜W防腐劑對幾種革蘭氏陰性菌的抑菌效果略高金黃色葡萄球菌，這與生物抑菌劑的結(jié)果相反，在實際生產(chǎn)中或許可以通過生物抑菌劑和化學防腐劑的聯(lián)用來相互補充。

2.2.3 肉桂醛對指示菌生長曲線的影響

結(jié)合抑菌圈直徑和MIC 的測定，發(fā)現(xiàn)肉桂醛和雙乙酸鈉對指示菌的抑菌效果最佳。因此，進一步研究肉桂醛和雙乙酸鈉對指示菌生長效果的影響。

肉桂醛設置1/2×MIC 處理組、1/4×MIC 處理組和CK 處理組，對4 種指示菌進行生長曲線影響。

肉桂醛作用下4 種指示菌的生長曲線見圖2。

圖2 肉桂醛作用下4 種指示菌的生長曲線

加入抑菌劑后，金黃色葡萄球菌的對數(shù)生長期明顯縮短，在4 h 后金黃色葡萄球菌生長便進入穩(wěn)定期，且對數(shù)生長期變化趨勢變緩，1/2×MIC 處理組、1/4×MIC 處理組的最終OD600分別為2.573 7，3.741 8，與CK 組最終OD600（7.567 0） 有較大差距，說明肉桂醛對金黃色葡萄球菌的抑制效果明顯。大腸桿菌CK 組0～10 h 處于對數(shù)期，10 h 后，大腸桿菌生長處于穩(wěn)定期，向大腸桿菌菌懸液中分別加入肉桂醛后，8 h 后趨于穩(wěn)定期，并表現(xiàn)出濃度越高，抑制作用越強的規(guī)律，OD600的最高值從3.6 下降到2.2。土生拉烏爾菌OD600在8 h 達到3.4 并趨于穩(wěn)定，1/2×MIC 處理組、1/4×MIC 處理組細菌生長慢于CK 組，添加終濃度為1/2×MIC 肉桂醛的處理組，在12～20 h內(nèi)生長緩慢，OD600無明顯上升；在20～24 h 期間OD600略有上浮僅達到2.0 左右，1/4×MIC 處理組22 h 后OD600繼續(xù)升高，在24 h 時OD600已接近CK組，達到3.7。CK 組水生拉恩菌大致在6 h 后快速進入穩(wěn)定期，且在10 h 后快速進入衰亡期，穩(wěn)定期較短，說明水生拉恩菌的代謝速率快，1/2×MIC 處理組對水生拉恩菌生長有明顯的抑制作用，最終OD600僅為0.5 左右。

2.2.4 雙乙酸鈉對指示菌生長曲線的影響

加入1/4×MIC 和1/8×MIC 終濃度的雙乙酸鈉，測定對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、土生拉烏爾菌和水生拉恩菌4 種指示菌生長曲線的影響。

雙乙酸鈉作用下4 種指示菌的生長曲線見圖3。

圖3 雙乙酸鈉作用下4 種指示菌的生長曲線

雙乙酸鈉對3 種革蘭氏陰性菌表現(xiàn)出相似的作用，1/4×MIC 的雙乙酸鈉基本上能夠抑制住大腸桿菌、水生拉恩菌和土生拉烏爾菌的繼續(xù)生長，1/8×MIC 的雙乙酸鈉在指示菌的生長前期具有一定程度的抑菌效果，隨時間的推移，抑菌效果明顯減弱，細菌的OD600逐漸接近CK 組。1/4×MIC 的雙乙酸鈉對金黃色葡萄球菌的抑制效果對3 種革蘭氏陰性菌弱，但是1/8×MIC 的雙乙酸鈉對金黃色葡萄球菌的抑制效果又對3 種革蘭氏陰性菌強。

2.3 抑菌劑對大蒜蒜瓣中菌落總數(shù)與大腸菌群數(shù)的影響

采用1×MIC 肉桂醛、1×MIC 雙乙酸鈉、1×MIC 肉桂醛+ 1×MIC 雙乙酸鈉兩者組合分別處理大蒜蒜瓣，肉桂醛和雙乙酸鈉對大蒜中菌落總數(shù)的抑菌率達到55.3%和77.8%，對大腸菌群的抑菌率達到66%和100%。兩者組合后抑菌率提高到98.4%。

大蒜蒜瓣中菌落總數(shù)和大腸菌群的測定見表7。

表7 大蒜蒜瓣中菌落總數(shù)和大腸菌群的測定

3 結(jié)論

結(jié)合形態(tài)學和分子生物學測定，大蒜蒜瓣中的細菌可分為腸桿菌科（水生拉恩菌、土生拉烏爾菌、成團泛菌、檸檬酸桿菌）、乳酸菌（腸膜明串珠菌、乳酸明串珠菌）、表皮葡萄球菌和蘇云金芽孢桿菌。芽孢桿菌在多種蒜制品中被分離出來，可用于大蒜的深加工[3-4]。乳酸菌是大蒜本身含有的益生菌，可為乳酸菌復合發(fā)酵大蒜提供思路[12]。腸桿菌科是大蒜中主要的腐敗菌和條件致病菌。因此，選擇比例較高的水生拉恩菌和土生拉烏爾菌，以及典型的革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和典型的革蘭氏陰性菌大腸桿菌，作為抑菌劑篩選的指示菌。

在所選擇的5 種生物抑菌劑中，肉桂醛的對指示菌的抑菌圈直徑明顯較大，MIC 和MBC 最小，說明抑菌能力最強。肉桂醛抑菌作用具有一定廣譜性，對4 種指示菌均具有較好的抑菌作用。5 種化學防腐劑中，雙乙酸鈉對4 種指示菌的抑菌效果優(yōu)于其他幾種防腐劑，1/4×MIC 濃度的雙乙酸鈉能夠完全抑制大腸桿菌、水生拉恩菌和土生拉烏爾菌的生長。金佳辛等人[13]的研究表明，肉桂醛緩釋防腐包與0.3%雙乙酸鈉有利于傳統(tǒng)豬肉干的長期貯藏。防腐劑有各自的特點，在生產(chǎn)中一般聯(lián)合使用，增強效果。楊潔等人[14]以D -異抗壞血酸鈉、乳酸鏈球菌素、雙乙酸鈉為防腐劑，添加到大蒜原汁中，探討防腐劑對大蒜原汁的保鮮技術。用肉桂醛和雙乙酸鈉復配，對大蒜蒜瓣的抑菌率提高到98.4%，大腸菌群抑菌率為100%。