師若迪，徐 晨，俞 洋

（寧夏醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川750004）

年齡相關(guān)性黃斑變性（age-related macular degeneration，AMD）是影響視網(wǎng)膜黃斑區(qū)的一種進(jìn)行性疾病，多見(jiàn)于50 歲以上人群，是世界上主要致盲疾病之一，預(yù)計(jì)到2040 年，約有2.9 億人受到AMD的影響，其中1.1 億人在亞洲［1］。AMD 是一種多因素疾病，其中光感受器-視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium， RPE ）復(fù)合體退化是導(dǎo)致AMD 發(fā)病的機(jī)制之一，而導(dǎo)致其退化的風(fēng)險(xiǎn)之一便是日光照射［2］。由于AMD 發(fā)病率高，對(duì)視力的嚴(yán)重影響，且現(xiàn)階段的治療方法有限，近年來(lái)已成為眼科學(xué)研究的熱點(diǎn)。

細(xì)胞自噬是一種保守的細(xì)胞生存途徑，它可以分解受損的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器，并維持體內(nèi)的平衡［3］，是細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、存活和自我平衡的重要途徑，有研究表明自噬參與了AMD 發(fā)病機(jī)制中所有細(xì)胞死亡途徑的調(diào)節(jié)［4］。目前，自噬與視網(wǎng)膜光損傷的關(guān)系尚不明確。為探討光損傷中自噬的變化，本研究采用mTOR 抑制劑雷帕霉素預(yù)處理人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（ARPE-19），觀察光照對(duì)ARPE-19 細(xì)胞的影響，對(duì)光損傷中RPE 細(xì)胞自噬的變化進(jìn)行研究，探討雷帕霉素對(duì)光誘導(dǎo)下視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞自噬的影響。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株

原 代ARPE-19，購(gòu) 買(mǎi) 于BNCC（BNCC3377 13）。將ARPE-19 細(xì)胞放入37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1 d 換液1 次，細(xì)胞生長(zhǎng)密度到90%時(shí)消化細(xì)胞，以1∶3 進(jìn)行傳代，選取3～5 代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑和儀器

胎牛血清、DMEM/F12（美國(guó)Gibco 公司）；mRFP-eGFP-LC3 雙熒光質(zhì)粒（生工生物工程上海股份有限公司）；MTT 細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)，C0009S）Annexin V-FITC/PI 雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（上海貝博生物科技有限公司，BB-4101）；BCA 蛋白定量試劑盒、全蛋白提取試劑盒（賽默飛世爾科技有限公司，P0100、89900）、；Rapamycin（MCE，HY-10219）；Mouse Anti-LC3A antibody、LC3B antibody、Beclin 1 antibody（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，bsm-33309M、bs-4843R、bsm - 33323M）； SQSTM1/p62 Antibody（Affinity 公司，AF5384）山羊抗兔lgG、山羊抗小鼠lgG（中杉金橋，ZB-2301、ZB-2305）。TES-1332A數(shù)位式照度計(jì)（臺(tái)北泰仕電子工業(yè)）：奧林巴斯激光共聚焦顯微鏡（FV3000，日本Olympus 公司）；透射電子顯微鏡（JEM-1400Flash，日本電子）；凝膠成像分析儀（Gel DocXR）（美國(guó) BIORAD 公司）。

1.3 細(xì)胞分組

穩(wěn)定表達(dá)mRFP-eGFP-LC3 的ARPE-19 細(xì)胞隨機(jī)分為6 h 對(duì)照組、6 h 模型組、6 h 雷帕霉素組；12 h 對(duì) 照 組、12 h 模 型 組、12 h 雷 帕 霉 素 組 以 及24 h對(duì)照組、24 h 模型組、24 h 雷帕霉素組。對(duì)照組避光培養(yǎng)，用錫紙包裹；模型組進(jìn)行光照刺激，雷帕霉素組中加入10 μmol/L 雷帕霉素（查閱文獻(xiàn)結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)反復(fù)篩選比較后確定的濃度）后接受光照刺激。

1.4 穩(wěn)定表達(dá) mRFP-eGFP-LC3 的ARPE-19 細(xì)胞株構(gòu)建

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期ARPE-19 細(xì)胞，以2×105個(gè)/孔細(xì)胞數(shù)接種于12 孔板，放于培養(yǎng)箱過(guò)夜，第2 天細(xì)胞數(shù)約50%后將表達(dá)mRFP-eGFP-LC3 慢病毒質(zhì)粒加入ARPE-19 細(xì)胞中，24 h 后用新鮮的培養(yǎng)基代替含有病毒的培養(yǎng)基。經(jīng)由嘌呤霉素（0.5 μg/mL）篩選，直到鑒定出耐受穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。饑餓處理穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，使用激光共聚焦顯微鏡觀察 mRFPeGFP-LC3 斑點(diǎn)，觀察轉(zhuǎn)染效率。

1.5 構(gòu)建ARPE-19 細(xì)胞光損傷模型

選生長(zhǎng)狀態(tài)良好的3～5 代ARPE-19 細(xì)胞培養(yǎng)在6 孔板中，放置于培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行光照，防止自然光干擾。將LED 冷光燈懸掛于培養(yǎng)箱頂部，調(diào)整細(xì)胞光照強(qiáng)度在（16 500±500） lx 范圍內(nèi)， 垂直照射細(xì)胞6、12、24 h。光照時(shí)孔板表面的溫度控制在36.5～37.5 ℃之間，以此排除由于溫度升高而造成細(xì)胞光熱損傷的可能［5］。

1.6 MTT 檢測(cè)光照對(duì)ARPE-19 細(xì)胞增殖活性

MTT 分組：對(duì)照組、模型組、雷帕霉素組。取穩(wěn)轉(zhuǎn)后的ARPE-19 細(xì)胞，經(jīng)含EDTA 胰酶消化后按每孔6 000 個(gè)細(xì)胞鋪于96 孔板，放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后分組處理，每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。各組于光照結(jié)束后每孔加10 μL MTT 溶液，在培養(yǎng)箱孵育4 h 取出吸出上清，每孔加100 μL Formazan溶解液，放培養(yǎng)箱孵育3 h，使用酶標(biāo)儀在570 nm 測(cè)定OD 值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.7 觀察雙熒光mRFP-eGFP-LC3 體系測(cè)定ARPE-19 細(xì)胞自噬流變化

將穩(wěn)轉(zhuǎn)成功的ARPE-19 細(xì)胞系放在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清和1%雙抗（100 U/ mL 青 霉 素 和100 μg/mL 鏈 霉 素）高 糖DMEM 培養(yǎng)48 h（密度80%），按照1∶3 比例傳代。各組于光照處理后使用激光掃描共聚焦顯微鏡通過(guò)觀察一個(gè)視野下所有細(xì)胞中紅色和黃色LC3 亮點(diǎn)變化來(lái)判斷自噬流的變化。

1.8 透射電鏡觀察各組ARPE-19 細(xì)胞自噬囊泡形成

吸出各組ARPE-19 細(xì)胞中培養(yǎng)基，冷PBS 洗2遍后收集細(xì)胞，1 200 r/min離心5 min棄上清，向管中加入2.5%戊二醛500 μL 固定，室溫1 h，4 ℃放3 h，加入PBS 漂洗3 次，于4 ℃冰箱30 min。加1%鋨酸固定1 h，PBS 清洗2 次，梯度乙醇脫水；使用環(huán)氧樹(shù)脂包埋處理后的樣品，超薄切片機(jī)切片，經(jīng)鉛鹽和醋酸鈾染色后于透射電子顯微鏡下觀察細(xì)胞并拍照。

1.9 蛋白免疫印跡法檢測(cè)Beclin l、LC3、P62 蛋白表達(dá)情況

各組于光照結(jié)束后收集細(xì)胞，使用細(xì)胞裂解液提取全蛋白，BCA 法進(jìn)行蛋白定量。以每孔50 μg蛋白為標(biāo)準(zhǔn)上樣，隨后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，用PVDF 轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，隨后與Beclin 1、LC3A/LC3B、P62（1∶1 000）一抗在4 ℃封閉過(guò)夜，第二天用TBST 洗滌3 次，每次10 min，隨后加入HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG 二抗（1∶1 000），暗室中加ECL 發(fā)光液并曝光。采用Image-J軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Graphpad Prism 9.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，計(jì)量資料用（±s）表示。多個(gè)樣本均數(shù)間的兩兩比較采用SNK-q 法檢驗(yàn)；顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 自噬雙標(biāo)慢病毒（mRFP-eGFP-LC3）轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)

mRFP-eGFP-LC3 慢病毒質(zhì)粒在與ARPE-19細(xì)胞共孵育48 h 后可觀察到被熒光標(biāo)記的mRFPeGFP-LC3 的表達(dá)水平最高。因此，后續(xù)相關(guān)分組實(shí)驗(yàn)將以此為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。圖1 中暗場(chǎng)顯示轉(zhuǎn)染mRFP-eGFP-LC3 后用熒光顯微鏡觀察到的帶有紅色和綠色熒光蛋白的ARPE-19 細(xì)胞。明視場(chǎng)顯示通過(guò)透射光學(xué)顯微鏡下觀察到的總細(xì)胞。經(jīng)觀察轉(zhuǎn)染效率約80%以上，可以用于下一步的相關(guān)實(shí)驗(yàn)。見(jiàn)圖1。

圖1 自噬雙標(biāo)慢病毒（mRFP-eGFP-LC3）轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)結(jié)果（×200）Fig 1 Transfection efficiency of autophagy double-labeled lentivirus（mRFP-eGFP-LC3） （×200）

2.2 光照對(duì)各組ARPE-19 細(xì)胞存活率

與對(duì)照組對(duì)比，模型組經(jīng)光照6、12、24 h 后，細(xì)胞存活率顯著下降（P＜0.001）；雷帕霉素組經(jīng)光照后細(xì)胞存活率高于模型組（光照6 h，P＜0.05；光照12、24 h，P＜0.001）。見(jiàn)表1。

表1 光照對(duì)各組ARPE-19 細(xì)胞存活率［%，n=3，（±s）］Tab 1 Effect of light on the survival rate of ARPE-19 cells in each group ［%，n=3，（±s）］

表1 光照對(duì)各組ARPE-19 細(xì)胞存活率［%，n=3，（±s）］Tab 1 Effect of light on the survival rate of ARPE-19 cells in each group ［%，n=3，（±s）］

注：與對(duì)照組比，*P＜0.001；與模型組比，#P＜0.001；與模型組比，&P＜0.05。

24 h 100.00±1.67 41.67±1.23*59.24±2.27#849.306＜0.001組別對(duì)照組模型組雷帕霉素組FP 6 h 100.00±2.06 80.02±2.08*86.73±2.36&65.595＜0.001 12 h 100.00±1.58 62.44±2.20*74.63±1.80#310.353＜0.001

2.3 光誘導(dǎo)下ARPE-19 細(xì)胞自噬流的變化

如圖2 所示，圖中6、12、24 h 對(duì)照組紅色熒光斑點(diǎn)弱，且少見(jiàn)自噬小體（黃色斑點(diǎn)）；模型組分別光照6、12、24 h 后，紅色熒光斑點(diǎn)較對(duì)照組逐漸增多，綠色熒光斑點(diǎn)也隨之增加，Merge 圖中從光照12 h開(kāi)始黃色斑點(diǎn)數(shù)量增多明顯，顯示隨著光照時(shí)間的延長(zhǎng)，ARPE-19 細(xì)胞的自噬流有所增強(qiáng)，但逐漸受阻。而雷帕霉素組在光照6、12、24 h 時(shí)紅色熒光斑點(diǎn)較模型組加強(qiáng)，綠色熒光較模型組弱，說(shuō)明雷帕霉素組細(xì)胞自噬流增強(qiáng)且通暢。

圖2 光誘導(dǎo)下ARPE-19 自噬流變化（×400）Fig 2 Changes of autophagic flow in ARPE-19 induced by light（×400）

2.4 透射電鏡觀察細(xì)胞自噬囊泡形成

透射電鏡觀察光照24 h 后的各組ARPE-19 細(xì)胞，可見(jiàn)對(duì)照組中少見(jiàn)自噬囊泡，模型組較對(duì)照組自噬囊泡增多，且有空泡形成，細(xì)胞核有皺縮，雷帕霉素組細(xì)胞內(nèi)見(jiàn)大量聚集分布的自噬囊泡。見(jiàn)圖3。

圖3 各組ARPE-19 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)（×15 000；標(biāo)尺：2 μm）Fig 3 Ultrastructure of ARPE-19 cells in each group（×15 000；scale bar：2 μm）

2.5 雷帕霉素干預(yù)對(duì)光誘導(dǎo)ARPE-19 細(xì)胞Beclin1、LC3、P62 蛋白表達(dá)的影響

經(jīng)光照6、12、24 h 后，與對(duì)照組比較，模型組和雷帕霉素組的Beclin 1 蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.001）、LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ的 比 值 升 高（P＜0.001），P62 蛋白低表達(dá)（P＜0.001）。與模型組比，雷帕霉素組在光照6 h 時(shí)Beclin 1 蛋白表達(dá)量差異不明顯、在12、24 h 時(shí)Beclin 1 蛋白表達(dá)量逐漸升高（P＜0.001）；LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ的比值較模型組均升高（6、24 hP＜0.05；12 hP＜0.001）；P62 蛋白表達(dá)量比模型組低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖4。

圖4 雷帕霉素對(duì)光誘導(dǎo)ARPE-19 細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig 4 Effect of rapamycin on the expression of autophagy-related proteins induced by light in ARPE-19 cells

3 討論

視網(wǎng)膜是位于眼球后壁內(nèi)側(cè)的透明中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織，由色素上皮層和視網(wǎng)膜感覺(jué)層組成，對(duì)視力至關(guān)重要［6］。光在視覺(jué)過(guò)程中起著重要作用，但過(guò)度暴露在光下會(huì)對(duì)視網(wǎng)膜色素上皮層和感光細(xì)胞造成不同程度的損害［7］，臨床上可表現(xiàn)為視力下降或視力缺失。視力缺陷對(duì)生活質(zhì)量有很大的負(fù)面影響，研究表明，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞過(guò)度暴露于可見(jiàn)光可促進(jìn)脂褐素的自發(fā)熒光色素的積累，而脂褐素是視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞吞噬構(gòu)成感光細(xì)胞外節(jié)的脂類(lèi)并積聚在溶酶體中的副產(chǎn)物，自身熒光脂褐素的過(guò)量積聚可能預(yù)示著細(xì)胞的老化，并增加視網(wǎng)膜退行性疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)［8］。

AMD 是一種影響黃斑區(qū)的復(fù)雜眼病，黃斑區(qū)是視力敏感區(qū)，負(fù)責(zé)視覺(jué)和色覺(jué)。在AMD 中可發(fā)現(xiàn)絨毛膜、布魯氏膜、RPE 和光感受器發(fā)生病理變化。其中RPE 在 AMD 的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用，因?yàn)槠湮挥诓剪斒夏ず凸飧惺芷髦g的中心位置，是視網(wǎng)膜外層和絨毛膜之間運(yùn)輸氧氣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和廢物的通道［9］。隨著疾病的進(jìn)展，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的變性和功能障礙會(huì)導(dǎo)致光感受器的進(jìn)行性丟失，最終可能導(dǎo)致永久性失明［10］。視網(wǎng)膜色素上皮被認(rèn)為是最早在人類(lèi)AMD 中受到影響的細(xì)胞之一［11］。自噬是將細(xì)胞質(zhì)成分運(yùn)輸和溶解到溶酶體中的過(guò)程，其與年齡相關(guān)的功能障礙可能導(dǎo)致AMD［12］。自噬對(duì)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，其在應(yīng)對(duì)各種應(yīng)激源時(shí)會(huì)迅速上調(diào)，比如饑餓、細(xì)胞器或DNA 損傷、缺氧、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激或感染［13］。有研究表明，自噬參與了許多與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病過(guò)程，揭示自噬在這些疾病中的參與至關(guān)重要［14］。為檢測(cè)光照下ARPE-19 細(xì)胞自噬的發(fā)生情況，使用串聯(lián)mRFP-eGFP-LC3 雙熒光自噬指示體系進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)LC3 進(jìn)行標(biāo)記及追蹤并觀察自噬流的變化，LC3 雙熒光體系最大的優(yōu)點(diǎn)是可以直觀地判斷細(xì)胞自噬流的變化［15］。在未發(fā)生自噬的細(xì)胞中，LC3 散在分布細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)自噬發(fā)生時(shí)，LC3 集中富集在自噬小體上，自噬小體需要和溶酶體融合才會(huì)具有自噬功能，但溶酶體為酸性的，所以eGFP 綠色熒光在酸性環(huán)境下可以發(fā)生淬滅，而紅色的RFP 熒光不會(huì)受到影響，因此自噬溶酶體會(huì)呈現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，而沒(méi)有與溶酶體融合的自噬小體則呈現(xiàn)黃色斑點(diǎn)［16］。由此，采用雙熒光體系可以直觀且定性的判斷細(xì)胞內(nèi)自噬流的改變。本研究通過(guò)共聚焦熒光顯微鏡觀察不同時(shí)間的光誘導(dǎo)下ARPE-19 細(xì)胞自噬流的變化，結(jié)果顯示，光照射能夠誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞發(fā)生自噬，且雷帕霉素會(huì)上調(diào)自噬活性。

除了通過(guò)雙熒光體系觀察自噬流的變化，選取自噬相關(guān)蛋白Beclin 1、LC3 以及P62 進(jìn)行定量檢測(cè)。Beclin 1 是自噬過(guò)程中的關(guān)鍵步驟，也是自噬的正調(diào)控因子［17］。LC3 是自噬體形成的特異性標(biāo)志物，在自噬過(guò)程中，自噬泡的形成會(huì)導(dǎo)致LC3Ⅰ通過(guò)脂質(zhì)化轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)C3Ⅱ，而LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值可以估計(jì)自噬的功能狀態(tài)［18］。目前免疫印跡檢測(cè)LC3 已成為監(jiān)測(cè)自噬和自噬相關(guān)過(guò)程的可靠方法［19］。P62 是另一種廣泛使用的自噬標(biāo)記，它通過(guò)一個(gè)短的LC3 相互作用區(qū)（LIR）直接與LC3 和Atg8 直系物家族蛋白結(jié)合。通過(guò)這種機(jī)制，使得其通過(guò)自噬提供選擇性的自噬貨物進(jìn)行降解。當(dāng)自噬受到抑制時(shí)，p62 積聚，而當(dāng)自噬被誘導(dǎo)時(shí)，p62 數(shù)量 減 少［20］。本 研 究Western Blot 結(jié) 果 顯 示，光 照6 h、12 h 和24 h 后，與對(duì)照組對(duì)比，模型組自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3 Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)量均增高，P62 蛋白呈低表達(dá)。表明模型組在光誘導(dǎo)下自噬被激活。

Rapamycin 是一種來(lái)源于潮霉素鏈霉菌的親脂性抗生素，是一種眾所周知的通過(guò)抑制mTOR 作用的自噬特異性誘導(dǎo)劑。它存在于兩種不同的功能復(fù)合體中：mTOR 復(fù)合體1（mTORC1）和mTOR 復(fù)合體2（mTORC2），這兩種復(fù)合體對(duì)雷帕霉素的敏感度是有區(qū)別的，mTORC1 對(duì)雷帕霉素有高度敏感性，并能調(diào)節(jié)自噬［21］。自噬參與了AMD 的發(fā)病機(jī)制，AMD 的發(fā)生可因受損細(xì)胞器無(wú)法清除而促進(jìn)疾病的進(jìn)展。由此，上調(diào)自噬可能為減緩或阻止AMD 進(jìn)展提供一種可選擇的治療策略［22］。近些年，雷帕霉素被發(fā)現(xiàn)在抗衰老、治療心臟病、中樞神經(jīng)、免疫系統(tǒng)等方面有一定的作用［23］。Gao 等［24］發(fā)現(xiàn)雷帕霉素通過(guò)調(diào)節(jié)mTOR 和ER 應(yīng)激通路之間的串?dāng)_，減少慢性心衰時(shí)心肌細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)心肌細(xì)胞的自噬。Sun 等［25］發(fā)現(xiàn)雷帕霉素誘導(dǎo)的自噬可以改善谷胱甘肽耗竭誘導(dǎo)的RPE 細(xì)胞的早衰。本研究采用自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素對(duì)人RPE 細(xì)胞進(jìn)行處理，使用透射電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)經(jīng)雷帕霉素處理的細(xì)胞可見(jiàn)大量聚集分布的自噬囊泡；此外通過(guò)蛋白免疫印跡法檢測(cè)自噬通量，發(fā)現(xiàn)使用雷帕霉素干預(yù)后，與對(duì)照組相比，雷帕霉素組的Beclin1 與LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ比值均增加，P62 蛋白表達(dá)量均減少；與模型組相比，雷帕霉素組在光照6 h 時(shí)Beclin 1 蛋白表達(dá)量差異不明顯、在12 h、24 h 時(shí)Beclin 1 蛋白表達(dá)量逐漸升高；LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ的比值較模型組均升高。這說(shuō)明，雷帕霉素干預(yù)激活了光誘導(dǎo)下的ARPE-19 細(xì)胞自噬通量，并上調(diào)自噬活性。

綜上，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞在光損傷中的自噬變化，探討了雷帕霉素對(duì)光誘導(dǎo)下視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞自噬的影響，目的是為了預(yù)防年齡相關(guān)性黃斑變性的發(fā)生、降低患該病的風(fēng)險(xiǎn)以及為開(kāi)發(fā)天然藥物來(lái)治療AMD 提供新的研發(fā)思路。本研究不足之處是只觀察了人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞在光誘導(dǎo)下自噬及其動(dòng)態(tài)性情況，同時(shí)進(jìn)一步驗(yàn)證了雷帕霉素促進(jìn)自噬的特性，但自噬與細(xì)胞損傷之間的關(guān)系尚未涉及，需要接下來(lái)進(jìn)一步研究和驗(yàn)證。

作者貢獻(xiàn)度說(shuō)明：

師若迪：實(shí)施研究，論文撰寫(xiě)，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析；徐晨：數(shù)據(jù)整理，論文審校；俞洋：課題設(shè)計(jì)，論文指導(dǎo)。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。