王曉宇 梁曉欣 朱振遠(yuǎn)

摘 要 廣藿香是我國嶺南地區(qū)傳統(tǒng)名貴中草藥，其主要活性物質(zhì)是百秋李醇，屬于三環(huán)倍半萜化合物，在植物體內(nèi)形成過程較復(fù)雜，目前已有研究主要集中在百秋李醇合成的相關(guān)基因。研究對 7種不同地域來源的廣藿香種質(zhì)中的4個百秋李醇合成調(diào)控相關(guān)基因（PatPTS、PatFPS、PatHMGR、PattTpsCF2）進(jìn)行了表達(dá)差異分析，同時測定了不同來源廣藿香樣品中的百秋李醇含量。結(jié)果表明：在所檢測的樣品中，4個百秋李醇合成調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)量與百秋李醇含量均存在地域差異；PatPTS、PatFPS、PatTpsCF2在不同來源廣藿香樣品中的表達(dá)差異與百秋李醇含量呈正相關(guān)；PatHMGR基因在廣東高要和廣東石牌2個廣藿香樣本中表現(xiàn)為高表達(dá)，而在其他廣藿香樣本中表達(dá)差異與百秋李醇含量呈正相關(guān)。此次研究結(jié)果可為不同來源廣藿香藥效成分快速鑒定和分子育種提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 百秋李醇；合成基因；表達(dá)差異；廣藿香

中圖分類號：S567 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2024.06.001

廣藿香[Pogostemon cablin（Blanco）Benth.]為唇形科刺蕊草屬植物，其干燥的地上部分為中藥材廣藿香，性辛、微溫，屬十大南藥之一，具有芳香化濁、開胃止嘔、發(fā)表解暑之功效，是藿香正氣丸、抗病毒口服液等30多種中成藥的重要原料，具有很高的經(jīng)濟(jì)價值[1]。百秋李醇也稱為廣藿香醇，是一種天然倍半萜類化合物，為廣藿香油中含量最多的成分之一?！吨袊幍洹分邪偾锢畲际窃u價廣藿香及其精油品質(zhì)的重要指標(biāo)，也被認(rèn)為是廣藿香油藥效功能和芳香功能的主要來源[2]。近年來，百秋李醇成為研究熱點，針對其已經(jīng)報道了多種有應(yīng)用前景的藥用活性，包括抗流感、抗抑郁、抗?jié)?、抗炎、抗癌及對代謝性疾病的保護(hù)活性等[3]。

姚尹伊等對百秋李醇在廣藿香體內(nèi)合成途徑已研究得較透徹，底物為2個乙酰CoA，合成乙酰乙酰CoA后，由HMG-CoA合酶催化形成3-羥基-3-甲基戊二單酰（HMG-CoA），經(jīng)過一系列合酶催化形成甲羥戊酸、異戊烯基焦磷酸、牻牛兒基焦磷酸、法呢基焦磷酸等中間產(chǎn)物，最后形成百秋李醇[4]。整個合成過程存在4個限速酶，即HMG-CoA還原酶、法呢基焦磷酸合成酶、倍半萜合成酶和百秋李醇合成酶，其對應(yīng)的基因分別為PatHMGR、PatFPS、PatPTS和PatTpsCF2[5-10]。此次研究采集了7個不同地域來源的廣藿香，分別測定其百秋李醇含量，以及4個百秋李醇合成限速酶基因表達(dá)量差異，以期闡明百秋李醇合成相關(guān)基因與百秋李醇含量的關(guān)系，為進(jìn)一步探索廣藿香藥效成分代謝途徑，開發(fā)優(yōu)質(zhì)廣藿香快速鑒定體系和遺傳改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為7份采集自不同地域的廣藿香資源樣品（見表1），利用扦插法種植于溫室大棚。

1.2 試劑和儀器

Tris-HCl、EDTA、NaCl購自生工生物工程（上海）股份有限公司，SteadyPure通用型RNA提取試劑盒、SYBR Green Pro Taq HS預(yù)混型qPCR試劑盒、Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RNA free水購自湖北艾科瑞生物工程有限公司。引物均合成于生工生物工程（上海）股份有限公司。主要儀器有CFX96TM實時熒光定量PCR儀（Bio-RAD美國）、赫西 3H20R1臺式高速冷凍離心機(jī)（湖北赫西儀器裝備有限公司）、Nanodrop one超微量紫外分光光度計[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]。

1.3 試驗方法

1.3.1 廣藿香百秋李醇含量測定

選取來自不同產(chǎn)地、生長期滿1年、長勢良好的廣藿香植株地上部分（3個重復(fù)），陰干后用研磨機(jī)打成粉末，每份樣品稱取100 mg，按照《中國藥典》（2020版）中的方法提取廣藿香揮發(fā)油并測定百秋李醇含量。此次檢驗委托廣州匯標(biāo)檢測技術(shù)中心完成。

1.3.2 總RNA提取與檢測

選取長勢一致的不同來源廣藿香各3株（每株3個重復(fù)），采集葉片100 mg在液氮中研磨至細(xì)粉，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的1.5 mL離心管，按照SteadyPure通用型RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，貯藏于-20 ℃或-80 ℃冰箱備用。按照Nanodrop one超微量紫外分光光度計操作說明測量RNA濃度。

1.3.3 反轉(zhuǎn)錄與qRT-PCR相對定量分析

按照SteadyPure通用型RNA提取試劑盒Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑預(yù)混試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA貯藏于-20 ℃冰箱備用。

研究采用SYBR Green Pro Taq HS 預(yù)混型qPCR試劑盒進(jìn)行qRT-PCR相對定量分析。利用18S rRNA基因作為內(nèi)參基因，目標(biāo)基因擴(kuò)增引物序列如表2所示，qRT-PCR 反應(yīng)體系為2×SYBR Green Pro Taq?10 ?L，cDNA模板1 ?L，引物F（10 ?M）0.5 ?L，引物R（10 ?M）0.5 ?L，ddH2O 8 ?L。

反應(yīng)程序為95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火和延伸30 s，60 ℃ 1 s讀板，40個循環(huán)；65～95 ℃測定溶解曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同來源廣藿香中百秋李醇合成相關(guān)基因的表達(dá)量分析

由圖1（a）可知，百秋李醇合成酶基因（PatPTS）在海南萬寧、廣西橫州、廣東陽春、廣東遂溪廣藿香中表達(dá)量較高。由圖1（b）可知，海南萬寧廣藿香中法呢基焦磷酸合成酶基因（PatFPS）的表達(dá)量明顯高于其他地區(qū)。由圖1（c）可知，倍半萜合成酶基因（PatTpsCF2）在海南萬寧、廣西橫州廣藿香中表達(dá)量較高，其他地域差異相對較小。由圖1（d）可知，廣東石牌、廣東高要廣藿香中HMG-CoA還原酶基因（PatHMGR）的表達(dá)量明顯高于其他地區(qū)。

2.2 不同來源廣藿香中百秋李醇含量差異分析

由圖2可知，所有廣藿香樣本中中百秋李醇含量均超過最低指標(biāo)（不低于0.1%），不同來源廣藿香中百秋李醇含量有明顯差異。其中，海南萬寧、廣西橫州的廣藿香中百秋李醇含量最高，分別為0.83%和0.64%；廣東高要和廣東石牌的廣藿香中百秋李醇含量最低，分別為0.23%和0.14%；其余廣藿香樣本中百秋李醇含量差異較小，在0.30%～0.45%。

2.3 不同來源廣藿香中百秋李醇合成相關(guān)基因表達(dá)量與百秋李醇含量關(guān)聯(lián)性分析

由圖3可知，關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果表明，PatPTS、PatFPS和PatTpsCF2在不同來源廣藿香樣品中的表達(dá)量與百秋李醇含量正相關(guān)。PatHMGR基因在廣東高要和廣東石牌2個廣藿香樣本中表現(xiàn)為高表達(dá)，而在其他廣藿香樣本中表達(dá)量與百秋李醇含量呈正相關(guān)。

3 結(jié)論與討論

《中國藥典》（2020版）中規(guī)定了廣藿香揮發(fā)油中百秋李醇含量不得低于0.1%?，F(xiàn)代藥理學(xué)也證明了百秋李醇具有重要的藥用價值，如抗病毒、抗癌、消炎等。已有研究表明，廣藿香萜類物質(zhì)合成關(guān)鍵酶有十幾種，但對于具體的調(diào)控機(jī)制還知之甚少。此次研究發(fā)現(xiàn)，4個已知的廣藿香醇合成限速酶基因在不同地域來源廣藿香中表達(dá)量存在差異。PatPTS、PatFPS和PatTpsCF2在不同來源廣藿香樣品中的表達(dá)量與百秋李醇含量呈正相關(guān)，進(jìn)一步證明了法呢基焦磷酸合成酶、倍半萜合成酶和百秋李醇合成酶基因表達(dá)量直接影響百秋李醇含量，可作為廣藿香質(zhì)量快速鑒定的直接指標(biāo)，為進(jìn)一步研究廣藿香藥效質(zhì)量快速檢測方法和遺傳改良提供了依據(jù)。

不同來源廣藿香樣品中PatHMGR基因在廣東高要和廣東石牌2個廣藿香樣本中表現(xiàn)為高表達(dá)。這是因為廣藿香可分為醇型和酮型，廣東高要和廣東石碑的廣藿香為牌香類，屬于酮型廣藿香，揮發(fā)油中廣藿香酮含量較高。PatHMGR基因在廣東高要和廣東石牌2個廣藿香樣本高表達(dá)說明HMG-CoA還原酶是廣藿香酮合成途徑中的關(guān)鍵酶。此結(jié)果為進(jìn)一步研究廣藿香酮代謝途徑提供了理論基礎(chǔ)。

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