楊鼎 李崇娟 呂鳳仙 和江明 蘭梅 胡靖峰 徐學(xué)忠

摘要：利用流式細(xì)胞儀測定甘藍(lán)（Brassica oleracea var. capitata）花粉的倍性，以甘藍(lán)GL21028的花粉為材料，以葉片為對照，比較花粉2種處理方式、3種不同細(xì)胞裂解液、2種核酸染料的效果差異。通過B緩沖液處理后獲取的花粉細(xì)胞可以直接染色，為最簡便處理方式；采用“Aru”buffer和Y 2種裂解液，染色劑DAPI，處理甘藍(lán)葉片和花粉，通過流式細(xì)胞儀檢測，樣本細(xì)胞DNA成峰集中，細(xì)胞碎片很少；配制的Y裂解液能夠適用甘藍(lán)材料流式細(xì)胞儀的觀察。甘藍(lán)花粉通過B緩沖液處理后，可以直接作為流式細(xì)胞儀倍性鑒定的材料，不再需要其他處理，配制的Y裂解液可以得到較好的試驗(yàn)結(jié)果。

關(guān)鍵詞：甘藍(lán)（Brassica oleracea var. capitata）； 流式細(xì)胞儀； 花粉； 測定； 倍性； 裂解液

中圖分類號：S635.1? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2024）04-0078-04

Determination of pollen ploidy of cabbage by flow cytometry

Abstract：Pollen ploidy of Brassica oleracea var. capitata was determined by flow cytometry. Pollen of cabbage GL21028 was used as the material， and leaves were used as the control to compare the effects of two pollen treatments， three different cell lysates， and two nucleic acid dyes. Pollen cells obtained through B buffer could be directly stained， which was the easiest treatment method. Cabbage leaves and pollen were treated with “Aru” buffer and Y lysates and stains DAPI， and flow cytometry was used for detection. The DNA of the sample cells was concentrated， and there were few cell fragments. The prepared Y lysate could be used for the observation of cabbage material by flow cytometry. Cabbage pollen treated with B buffer could be directly used as the material for flow cytometry ploidy identification， no other treatment was required， and the prepared Y lysate could obtain better test results.

Key words： Brassica oleracea var. capitata； flow cytometry； pollen； determination； ploidy； lysate

甘藍(lán)（Brassica oleracea var. capitata）是十字花科蕓薹屬二年生草本植物，異花授粉作物，雜種優(yōu)勢表現(xiàn)突出，且高度自交不親和，雜交種制備多采用雄性不育系途徑［1］。隨著近年甘藍(lán)各種病害種類不斷增加，對甘藍(lán)種植品種的抗逆性及抗病性要求越來越高，正常選育1代至少需要1年，但病原菌小種較多，選育出的部分品種不能適應(yīng)市場需求，且國外的雄性不育品種限制了國內(nèi)對優(yōu)秀抗病品系的再利用。通過遠(yuǎn)緣雜交可以快速導(dǎo)入相對應(yīng)的抗病基因，但遠(yuǎn)緣雜交存在雜交后代染色體缺失、配對異常等問題，對雜交種后代的倍性鑒定尤為關(guān)鍵。大多數(shù)倍性鑒定都是通過雌蕊和根尖染色體觀察來判斷，對于雌蕊染色體觀察的方法多樣，但都需要通過大量的試驗(yàn)條件摸索之后，才可以成功觀察到清晰的染色體，不僅耗費(fèi)大量時間，還具有滯后性，從而影響到后續(xù)試驗(yàn)的進(jìn)展，不便于后續(xù)的育種工作。

1953年流式細(xì)胞儀（Flow cytometry）初具雛形，到現(xiàn)在發(fā)展成為全自動多色流式系統(tǒng)，流式細(xì)胞術(shù)因其快速、簡單、通量大被廣泛應(yīng)用到各個基礎(chǔ)研究領(lǐng)域［2］。植物育種中通常使用流式細(xì)胞儀檢測雜交種后代G0/G1峰的核酸含量，以此鑒定植物倍性［3］。吳青青等［4］通過選取不同的裂解液，對比百合葉片，成功使用流式細(xì)胞儀鑒定出百合花粉的倍性，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。B?ocka-Wandas等［5］使用流式細(xì)胞儀測定了酸膜花粉的染色體組成，對其雌性偏向機(jī)制做出了解釋。張虹等［6］以黑果枸杞和甜味菊為試驗(yàn)材料，確定使用Nuclei extraction buffer裂解液和DAPI（4′，6-二脒基-2-苯基吲哚）處理材料，得到的峰圖成峰集中，細(xì)胞碎片較少。蕓薹屬植物花粉一般為三裂圓形，極軸長22 μm，花粉壁2 μm，體積較為微?。?］，將其破碎之后難以釋放出足夠量的游離細(xì)胞核用于流式細(xì)胞儀檢測。以上研究中，雖然已有通過流式細(xì)胞儀鑒定植物花粉倍性的探索，但鮮見甘藍(lán)的相應(yīng)報(bào)道，尤其缺少不同的植物材料使用不同的裂解液和染色劑的研究。本研究以甘藍(lán)的葉片和花粉為材料，配制1種適合甘藍(lán)流式細(xì)胞儀倍性鑒定的裂解液，并通過對比不同染色劑，探索出甘藍(lán)花粉倍性的測定方法，為甘藍(lán)遠(yuǎn)緣雜交后雜交種的倍性變化鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試植物材料為云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所十字花科課題組選育的甘藍(lán)GL21028花粉和葉片。流式細(xì)胞儀為貝克曼庫爾特公司生產(chǎn)的CytoFLEX S；染色液為大連美侖生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的DAPI（4′，6-Diamidino-2-Phenylindole）和PI（Propidium iodide）；Galbraith solution裂解液購自于北京酷來搏科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 材料培養(yǎng)及處理 試驗(yàn)材料GL21028分別于2021年11月1日和2021年3月1日播種，選取顆粒飽滿的種子，以每盤50穴規(guī)格穴盤和育苗專用基質(zhì)進(jìn)行育苗。

1.2.2 樣品采集 采集新生的第一片真葉葉片，沖洗后放入4 ℃晾干備用；在甘藍(lán)花朵完全開放后，用裝有B緩沖液［NaCl 8.999 g/L、CaCl2 22.641 g/L、KCl 0.373 g/L、MES（嗎啉乙磺酸） 0.427 g/L、PVP（聚乙烯吡咯烷酮）4.4 g/L，pH 7.4］的1.5 mL PE管收集成熟花藥，做好標(biāo)記并帶回實(shí)驗(yàn)室，然后用鑷子擠壓花藥，使得花粉能夠完全釋放出來，用紗布過濾雜質(zhì)，再用B緩沖液沖洗殘留花粉，以4 500 r/min離心? ? ?3 min，除去上清液，一部分晾干備用，另一部分加入1 mL B緩沖液，2種處理都于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 不同材料細(xì)胞核懸浮液制備

1）葉片細(xì)胞核懸浮液制備方法。在-20 ℃預(yù)冷的培養(yǎng)皿中加入80 mg鮮嫩葉片，加入600 μL裂解液，將5 cm培養(yǎng)皿置于冰上，用單刃刀片反復(fù)剁切葉片直至糊狀，用40 μm尼龍網(wǎng)過濾2次，最后用1.5 mL離心管收集濾液。

2）花粉細(xì)胞核懸浮液制備方法。采用2種處理方式對花粉進(jìn)行處理。處理1，在5 cm預(yù)冷培養(yǎng)皿中加入大量晾干花粉，加入裂解液使花粉變成糊狀，在冰上用單刃刀片反復(fù)砍切15 min，用40 μm尼龍網(wǎng)過濾2次，濾液收集到1.5 mL離心管備用；處理2，取? ? 1 mL花粉溶液振蕩30 s，以4 500 r/min離心1 min后除去上清液，加入800 μL PBS（磷酸鹽緩沖液），振蕩10 s，用40 μm尼龍網(wǎng)過濾2次，濾液收集到1.5 mL離心管中，以4 500 r/min離心1 min后除去上清液備用。裂解液使用“Aru”buffer，處理完成后加入DAPI染色液染色，染色后用熒光顯微鏡觀察處理后花粉細(xì)胞的變化，然后選出最優(yōu)的處理方式進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4 不同裂解液處理 為獲得良好的甘藍(lán)葉片流式細(xì)胞儀倍性分析結(jié)果，采用Yang 等［8］的“Aru”buffer、Galbraith等［9］的Galbraiths及本研究配制的Y裂解液，分別對GL21028葉片細(xì)胞和花粉進(jìn)行解離，使用PI對葉片進(jìn)行染色，DAPI對花粉進(jìn)行染色，對比3種解離液的試驗(yàn)效果，選出最適甘藍(lán)葉片和花粉的裂解液。“Aru”buffer（10 mL）：9.65 mL MgSO4溶液（1.23 g MgSO4?H2O+1.85 g KCl+0.6 g Hepes，480 mL ddH2O溶解，用KOH調(diào)節(jié)pH至8.0，定容至500 mL，4 ℃保存）、100 μL 1 mol/L DTT（二硫蘇糖醇）、250 μL Triton X-100。Y裂解液（1 mL）：B緩沖液500 μL、500 μL 1% Triton X-100，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.4，定容至1 mL，4 ℃保存。每600 μL核懸浮液加入2.5 μL RNase A和2.5 μL染色液。

1.2.5 不同染色液處理葉片細(xì)胞 選取DAPI及PI染色液對葉片細(xì)胞核懸浮液進(jìn)行處理。選出適合葉片細(xì)胞流式細(xì)胞儀觀察的染色液。

1.2.6 流式細(xì)胞儀倍性鑒定 PI染色液屬于嵌入性核酸熒光染料，激發(fā)光波長為488 nm，設(shè)置增益電壓為55 V；DAPI染色的雙鏈核酸在365 nm的激光激發(fā)下放出藍(lán)色熒光，設(shè)置增益電壓為268 V，上樣測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對花粉細(xì)胞的影響

采用正倒置熒光顯微鏡觀察2種花粉處理方式得到的花粉細(xì)胞懸浮液。結(jié)果如圖1所示，處理1所得到的花粉懸浮液中，在正常光下花粉是完整的花粉粒，與處理2所得到的花粉懸浮液中花粉形狀一致，說明使用單刃刀片不能很好地將花粉粒切開，使花粉細(xì)胞核游離出來。2種處理方式熒光觀察強(qiáng)度一致，說明處理2對花粉細(xì)胞處理效果更好。

2.2 不同處理對葉片細(xì)胞倍性測定的影響

2.2.1 不同裂解液對倍性測定的比較 通過“Aru”buffer、Y和Galbraiths裂解液處理二倍體葉片得到細(xì)胞核懸浮液，在使用PI染色劑染色處理后，流式細(xì)胞儀倍性測定如圖2所示。Galbraiths裂解液（圖2C）得到G0/G1峰橫坐標(biāo)為40，下部有所掩蓋，不完全對稱，G2/M峰橫坐標(biāo)為82，2個主峰具有倍數(shù)關(guān)系，但圖中雜峰較多，說明細(xì)胞碎片較多；在“Aru”buffer（圖2A）和Y裂解液（圖2B）得到的圖像上G0/G1峰清晰，細(xì)胞碎片相對較少，G0/G1和G2/M峰的橫坐標(biāo)分別為26和54，也具有倍數(shù)關(guān)系；但“Aru”buffer的G2/M峰優(yōu)于Y裂解液所得到的相應(yīng)峰。綜上所述，“Aru”buffer和Y裂解液為甘藍(lán)葉片的最適裂解液。

2.2.2 不同染色液對倍性測定的比較 根據(jù)“2.2.1”篩選出的解離液處理葉肉細(xì)胞后，利用DAPI染色劑對甘藍(lán)葉片細(xì)胞核染色，上機(jī)測定。結(jié)果如圖3所示，“Aru”buffer和Y裂解液所得到的G0/G1峰清晰，細(xì)胞碎片較少，橫坐標(biāo)均為22，說明“Aru”buffer和Y 2種裂解液組合DAPI染色液同樣適用。將DAPI染色劑得到的倍性（圖3A、圖3B）與PI染色劑得到的倍性（圖2A、圖2B）對比，DAPI染色劑的主峰更清晰；而使用PI染色劑得到的葉肉細(xì)胞相應(yīng)峰的主峰也非常清晰，只是除主峰外，其他部分雜峰較多。DAPI和PI主峰數(shù)值有所差異，是由于2種染色劑的染色原理有所差異造成的。綜上所述，DAPI染色劑是甘藍(lán)葉片細(xì)胞核懸浮液的較佳染色劑。

2.3 不同裂解液對花粉細(xì)胞倍性測定的比較

根據(jù)“2.1”得到的最優(yōu)處理方法，利用3種裂解液處理花粉后，上機(jī)測定。結(jié)果如圖4所示，3種裂解液都有明顯的主峰，橫坐標(biāo)主峰位置均為12，為葉片流式細(xì)胞儀測定數(shù)值的50%。但Galbraiths裂解液得到的峰下部對比其他2種裂解液對稱性較差；“Aru”buffer裂解液與Y裂解液相比，前者主峰下部較寬，對稱性沒有后者好。綜上所述，Y裂解液為甘藍(lán)花粉的流式細(xì)胞儀倍性測定的最適裂解液。

3 小結(jié)與討論

用傳統(tǒng)的染色體計(jì)數(shù)方法鑒定植株倍性，雖然準(zhǔn)確率較高，但對選材時期及部位都有各種不同要求，操作技術(shù)要求較高，有時還會影響植物正常的生長和材料的獲取，且不容易鑒定出混倍體。流式細(xì)胞儀應(yīng)用于植物細(xì)胞倍性鑒定已有很長時間，快速、準(zhǔn)確、影響小等優(yōu)勢使得其得以廣泛應(yīng)用，流式細(xì)胞儀對多倍體的鑒定相比于傳統(tǒng)鑒定方法可以節(jié)省大量的時間。影響流式細(xì)胞儀結(jié)果觀察效果的因素主要包括取材部位、裂解液以及染色劑的選擇，針對不同植物，由于細(xì)胞生理特性各不相同，在使用流式細(xì)胞儀鑒定倍性時需要對取材部位的選擇進(jìn)行反復(fù)測試。Bino等［10］選取種子的胚乳和根尖，Galbraith等［9］選取新生葉肉細(xì)胞，在對應(yīng)的材料中都得到較好的峰圖。本試驗(yàn)選取新生的真葉嫩葉作為材料獲取細(xì)胞核懸浮液，得到清晰的雙峰圖，因?yàn)橛啄廴~片在細(xì)胞分裂時出現(xiàn)染色體加倍的情況，使得部分細(xì)胞染色體數(shù)目為未分裂細(xì)胞的2倍，在流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果中顯示為具有倍數(shù)關(guān)系的峰，同時說明甘藍(lán)適合選取新生的幼嫩真葉作為材料；前期試驗(yàn)中選取子葉作為細(xì)胞核懸浮液的提取材料，但由于過老葉片細(xì)胞已被纖維包裹，不易得到單個細(xì)胞懸浮液，同時細(xì)胞內(nèi)的RNA含量各有不同，導(dǎo)致在3種裂解液中流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果中均出現(xiàn)很多雜峰，說明材料的選取對流式細(xì)胞儀的觀察具有很大影響。B?ocka-Wandas等［5］用流式細(xì)胞儀對酸膜的花粉細(xì)胞進(jìn)行倍性分析，與顯微鏡觀察結(jié)果一致，準(zhǔn)確分析了其染色體的組成。本研究選取花粉作為流式細(xì)胞儀的觀察材料，根據(jù)陳相潔等［7］對部分十字花科植物花粉的觀察結(jié)果，發(fā)現(xiàn)花粉大小為20～31 μm，而流式細(xì)胞儀進(jìn)樣通道允許通過的最大細(xì)胞為? ? 40 μm，能在不切割花粉細(xì)胞的情況下通過流式細(xì)胞儀的檢測通道，所以不需要進(jìn)行機(jī)械切割，得到的細(xì)胞懸浮液基本都是完整的細(xì)胞顆粒，能夠減少細(xì)胞碎片對流式細(xì)胞儀觀察結(jié)果的影響，操作簡單且結(jié)果可靠，與吳青青等［4］對百合花粉進(jìn)行機(jī)械破碎之后得到的花粉細(xì)胞核懸浮液倍性的觀察結(jié)果相比，雜峰明顯較小。

不同的裂解液對流式細(xì)胞儀的觀察有很大的影響，Galbraith等［9］所配制的裂解液適用范圍較廣，通過該裂解液處理后都能得到相應(yīng)的峰圖。在本試驗(yàn)中，Galbraiths裂解液相較于Yang等［8］的“Aru”buffer和本試驗(yàn)自行配制的Y裂解液，雜峰較多，不適合用作甘藍(lán)的葉片流式細(xì)胞儀倍性測定，“Aru”buffer和Y裂解液對花粉倍性的測定也較為適用。染色液的選取也非常關(guān)鍵，對于活細(xì)胞，大部分染色劑不能透過細(xì)胞膜對DNA染色，所以需要裂解得到單一細(xì)胞核才能夠完成染色，PI僅能透過破損細(xì)胞膜，嵌入雙鏈DNA后完成染色過程，并且PI染色劑會受RNA的影響，所以制備流式細(xì)胞儀檢測時需要加入RNase消除RNA的影響［11］；而DAPI可以透過完整的細(xì)胞膜，結(jié)合到雙鏈DNA小溝的AT堿基對處，完成染色過程，所以對于DAPI染色劑制備的檢測液，則不需要加入RNase［12］。在本試驗(yàn)中，PI不具有膜透性，所以不能對花粉細(xì)胞懸浮液染色，只能選取DAPI進(jìn)行染色；對于葉片細(xì)胞，使用DAPI染色劑可以消除大部分其他RNA的干擾，減少背景干擾，與張虹等［6］對黑果枸杞中使用DAPI和PI進(jìn)行流式細(xì)胞儀的檢測結(jié)果一致。此外DAPI的毒性較PI更低，對試驗(yàn)操作者更友好。

本研究通過比較不同解離液、染色劑、材料和材料處理方式對甘藍(lán)流式細(xì)胞儀倍性測定的影響，結(jié)果表明，甘藍(lán)花粉可以直接染色后使用流式細(xì)胞儀檢測；Y裂解液與“Aru”buffer裂解液相當(dāng)，對甘藍(lán)的葉片和花粉的流式細(xì)胞儀檢測具有相似的效果，且對花粉的鑒定優(yōu)于“Aru”buffer裂解液；流式細(xì)胞儀的倍性檢測更適合采用DAPI染色劑染色；甘藍(lán)花粉的檢測可以通過處理2和Y裂解液更為簡便地得到倍性鑒定結(jié)果。

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