陳家驥,趙 怡,周家芳,胡庭俊,3*

(1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,廣西南寧 530004;2.廣西壯族自治區(qū)獸用生物制品工程研究中心,廣西南寧 530004;3.廣西畜禽繁育與疾病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西南寧 530004)

偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)是豬偽狂犬病(Pseudorabies,PR)的病原,具有高度傳染性,對(duì)妊娠母豬和仔豬危害巨大。妊娠母豬感染會(huì)導(dǎo)致流產(chǎn)、木乃伊胎、死胎或產(chǎn)弱仔[1-2]。新生仔豬感染后會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀,包括尖叫、共濟(jì)失調(diào)、腹痛等,病死率極高[2]。2011年以前通過(guò)經(jīng)典的BarthaK61疫苗較好地控制了PRV的流行,但由于病毒變異出現(xiàn)毒力更強(qiáng)的變異毒株,致使疫苗保護(hù)力下降,PR也重新在中國(guó)流行起來(lái)[3-5]。

PRV屬于皰疹病毒科水痘病毒屬,具有天然的免疫逃避機(jī)制,會(huì)抑制豬的免疫系統(tǒng)[6]。脾臟是機(jī)體內(nèi)最大的外周免疫器官,聚集了大量T/B淋巴細(xì)胞,在啟動(dòng)免疫應(yīng)答過(guò)程中扮演著至關(guān)重要的角色[7]。組蛋白乙酰化酶(histone acetyltransferase,HATs)和組蛋白去乙?；?histone deacetylase,HDACs)可通過(guò)乙酰化或去乙?；饔糜绊懟虻霓D(zhuǎn)錄從而影響各生物學(xué)進(jìn)程。病毒依賴HATs和HDACs調(diào)節(jié)組蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)而調(diào)控其基因表達(dá)[8]。

目前,高通量測(cè)序技術(shù)已被廣泛用于病毒感染致病機(jī)制的研究,對(duì)了解病毒感染后機(jī)體生物學(xué)進(jìn)程、病毒致病機(jī)制具有重要意義,為病毒防控提供重要依據(jù)。本研究利用PRV體外感染豬脾淋巴細(xì)胞,應(yīng)用ELISA以及RT-qPCR檢測(cè)組蛋白乙?；南嚓P(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平,采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析,尋找PRV感染與組蛋白乙酰化之間的聯(lián)系,為后續(xù)深入研究其作用分子機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 PRV-GXLB-2013株由廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)教研室分離鑒定并保存。

1.1.2 主要試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基,美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品;胎牛血清(FBS),上海逍鵬生物科技有限公司產(chǎn)品;青霉素與鏈霉素混合液、紅細(xì)胞裂解液、PBS,北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品;40 μm細(xì)胞篩網(wǎng),浙江碩華生命科學(xué)研究股份有限公司產(chǎn)品;HAT、HDAC ELISA檢測(cè)試劑盒,泉州九邦生物科技有限公司產(chǎn)品;RNAiso Plus,寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司產(chǎn)品;All-in-One 5×RT Master Mix、BlasTaqTM2× qPCR Master Mix,上海愛(ài)必夢(mèng)生物科技有限公司產(chǎn)品;細(xì)胞DNA提取試劑盒,南京諾唯贊生物科技股份有限公司;其他試劑均為分析純級(jí)別試劑。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 -80 ℃低溫冰箱,普和希健康醫(yī)療器械(上海)有限公司產(chǎn)品;CO2培養(yǎng)箱,德國(guó)賓德公司產(chǎn)品;高速臺(tái)式冷凍離心機(jī),德國(guó)艾本德公司產(chǎn)品;梯度PCR儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、電泳凝膠成像儀,美國(guó)Bio-Rad公司產(chǎn)品;瓊脂糖水平電泳儀,北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 制備豬脾淋巴細(xì)胞懸液 試驗(yàn)所用豬購(gòu)自廣西南寧某豬場(chǎng),經(jīng)檢驗(yàn)為PRV、PCV2、PRRSV等病原陰性,PRV抗體陰性。無(wú)菌剖檢,取豬脾臟,置入超凈臺(tái)中用預(yù)冷的PBS清洗3次。加入少量PBS,用滅菌注射器內(nèi)芯進(jìn)行研磨,后經(jīng)40 μm細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾后將所得細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入15 mL離心管。

加入紅細(xì)胞裂解液,裂解15 min,800 r/min離心5 min后棄上清;加入PBS輕輕吹打混勻沉淀細(xì)胞,800 r/min離心5 min,棄上清;加入含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液,輕輕吹打混勻,經(jīng)篩網(wǎng)過(guò)濾。收集細(xì)胞濾液,取25 μL細(xì)胞懸液于細(xì)胞計(jì)數(shù)板中計(jì)算細(xì)胞數(shù)量,用含100 mL/L FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液將細(xì)胞調(diào)整至5×106/mL進(jìn)行鋪板[9]。

1.2.2 試驗(yàn)分組及處理 試驗(yàn)設(shè)置細(xì)胞對(duì)照組(C組)和PRV感染組(P組),每組3個(gè)重復(fù),為C-1、C-2、C-3和P-1、P-2、P-3。將細(xì)胞懸液接種于6孔板內(nèi),每孔2 mL,置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)6 h后,吸棄1 mL培養(yǎng)液,C組加入1 mL培養(yǎng)液、P組加入1 mL PRV病毒液(TCID50為10-8.25/0.1 mL,MOI=0.1)孵育2 h后,吸棄1 mL培養(yǎng)液并加入1 mL培養(yǎng)液孵育8、12、24、48 h。

1.2.3 PRV感染豬脾淋巴細(xì)胞核酸擴(kuò)增及鑒定 使用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)引物,由南寧捷尼斯生物有限公司合成,引物序列見表1。按照諾唯贊細(xì)胞DNA提取試劑盒說(shuō)明書,提取PRV感染8 h時(shí)豬脾淋巴細(xì)胞中的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,觀察擴(kuò)增片段位置。

表1 引物序列

1.2.4 ELISA檢測(cè)HAT和HDAC酶活力水平 棄去1 mL培養(yǎng)液后吸取剩余培養(yǎng)液輕輕吹打沉降在6孔板底部的脾淋巴細(xì)胞使其懸浮在培養(yǎng)基中,轉(zhuǎn)移至EP管中,12 000 r/min 4 ℃離心5 min,收集上清液即得樣品。嚴(yán)格參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 RT-qPCR檢測(cè)HAT1和HDAC1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平 棄去1 mL培養(yǎng)液后吸取剩余培養(yǎng)液,輕輕吹打沉降在6孔板底部的脾淋巴細(xì)胞使其懸浮在培養(yǎng)基中,轉(zhuǎn)移至RNase Free EP管中,1 500 r/min 4 ℃離心5 min,棄上清;每管加入1 mL PBS吹散后再次1 500 r/min 4 ℃離心5 min,棄上清,加入1 mL的RNAiso Plus,反復(fù)吹吸,靜置5 min,按照TRIzol法提取,經(jīng)評(píng)估合格后即得總RNA樣品。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,放入-80 ℃冰箱保存。引物設(shè)計(jì)、合成同1.2.3所述,引物序列見表1。按照BlasTaqTM2×qPCR Master Mix試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行RT-qPCR,結(jié)果以GAPDH作為內(nèi)參,使用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因表達(dá)水平。

1.2.6 測(cè)序樣品收集 按照1.2.5方法獲取總RNA樣品后,放入-80 ℃冰箱保存。

1.2.7 測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建與測(cè)序 取-80 ℃保存的樣品,去除rRNA后,構(gòu)建鏈特異性文庫(kù),文庫(kù)質(zhì)檢合格后采用Illumina NovaseqTM6000進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.2.8 RNA-Seq數(shù)據(jù)處理 由于在測(cè)序過(guò)程中伴隨著核酸片段的打斷以及接頭等過(guò)程會(huì)導(dǎo)致序列數(shù)據(jù)參差不齊,所以需要對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)質(zhì)控處理,使用Cutadapt[10]過(guò)濾掉不合格的序列后得到有效數(shù)據(jù),使用Hisat2[11-12]對(duì)預(yù)處理后的有效數(shù)據(jù)(Valid Data)與豬參考基因組進(jìn)行比對(duì),并獲取在參考基因組或基因上的位置信息,以及測(cè)序樣本特有的序列特征信息。根據(jù)基因長(zhǎng)度計(jì)算每個(gè)基因的FPKM,并計(jì)算映射到該基因的讀數(shù)。計(jì)算差異倍數(shù)以及進(jìn)行差異顯著性分析,最終以|log2(FC)|>1,P<0.05為條件篩選出差異表達(dá)基因(DEGs)進(jìn)行后續(xù)GO、KEGG等生物信息學(xué)分析。

1.2.9 差異表達(dá)基因RT-qPCR驗(yàn)證 為了驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果是否準(zhǔn)確,從DEGs中隨機(jī)挑選10個(gè)mRNA進(jìn)行驗(yàn)證。引物設(shè)計(jì)、合成同1.2.3所述,引物序列見表1。

1.2.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 22.0軟件獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,*(P<0.05)表示差異顯著,**(P<0.01)表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 PRV感染豬脾淋巴細(xì)胞核酸擴(kuò)增及鑒定

圖1所示,C組均未檢測(cè)出PRV擴(kuò)增片段(388 bp),P組均檢測(cè)出PRV擴(kuò)增片段。由此可知,PRV已成功感染豬脾淋巴細(xì)胞。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.陰性對(duì)照;2.陽(yáng)性對(duì)照;3～5.細(xì)胞對(duì)照組;6～8.PRV感染

2.1 ELISA檢測(cè)HAT和HDAC酶活力水平

由圖2A可知,PRV感染豬脾淋巴細(xì)胞8～24 h均能極顯著上調(diào)HAT酶活力水平(P<0.01),而感染48 h時(shí)對(duì)HAT酶活力水平無(wú)顯著影響(P>0.05)。

A.HAT酶;B HDAC酶A.HAT enzyme; B.HDAC enzyme

由圖2B可知,PRV感染豬脾淋巴細(xì)胞8～24 h均能顯著或極顯著下調(diào)HDAC酶活力水平(P<0.05,P<0.01),而感染48 h時(shí)對(duì)HDAC酶活力水平無(wú)顯著影響(P>0.05)。

A.HAT1;B.RRV

2.2 RT-qPCR檢測(cè)HAT1、HDAC1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平

圖3A所示,PRV感染豬脾淋巴細(xì)胞8～24 h均能顯著上調(diào)HAT1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平(P<0.05),其中12 h時(shí)能極顯著上調(diào)(P<0.01)。

圖3B所示,PRV感染豬脾淋巴細(xì)胞8 h時(shí)顯著上調(diào)HDAC1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平(P<0.05),12 h時(shí)極顯著上調(diào)(P<0.01),24 h時(shí)則對(duì)HDAC1 mRNA表達(dá)水平無(wú)顯著影響(P>0.05)。

2.3 PRV感染豬脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

2.3.1 原始數(shù)據(jù)質(zhì)量分析結(jié)果 本研究對(duì)所測(cè)樣品進(jìn)行RNA質(zhì)檢合格后,進(jìn)行測(cè)序,所得原始數(shù)據(jù)在去除接頭和低質(zhì)量的Reads后,樣本的有效數(shù)據(jù)量分布在11.18 G～12.10 G,Q30%在96.78%～97.17%,GC堿基含量在50.5%～52.5%,具體信息見表2。以上結(jié)果說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量良好,可用于后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。

表2 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量統(tǒng)計(jì)

2.3.2 基因差異表達(dá)分析結(jié)果及差異基因表達(dá)聚類分析 通過(guò)對(duì)PRV感染組和細(xì)胞對(duì)照組比較,以|log2(FC)|>1且P<0.05為差異基因篩選條件。圖4所示,共篩選出2 293個(gè)差異顯著基因,其中726個(gè)基因表達(dá)上調(diào),1 567個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。并對(duì)所有基因進(jìn)行聚類分析,結(jié)果如圖5所示,本試驗(yàn)組內(nèi)差異小,生物學(xué)重復(fù)性良好,組間差異大,表明PRV感染會(huì)引起豬脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平異常。

圖4 PRV感染豬脾淋巴細(xì)胞的差異表達(dá)基因火山圖

圖5 差異轉(zhuǎn)錄基因的聚類分析(紅色為表達(dá)上調(diào),綠色為表達(dá)下調(diào))

2.3.3 差異表達(dá)基因GO功能分析 根據(jù)GO注釋對(duì)差異基因進(jìn)行GO功能分析,并挑選顯著性排名前20的功能制作GO富集因子氣泡圖,結(jié)果如圖6所示。這些功能中有許多病毒感染和免疫相關(guān)的功能,例如病毒防御應(yīng)答(defense response to virus)、免疫應(yīng)答(immune response)、病毒基因組復(fù)制的負(fù)調(diào)控(negative regulation of viral genome replication)、炎癥反應(yīng)(inflammatory response)等功能。

橫坐標(biāo)Rich factor為富集因子值(下同)The x-axis represents Rich factor values (the same applies to the subsequent text)

2.3.4 差異表達(dá)基因KEGG功能分析 根據(jù)KEGG注釋對(duì)差異基因進(jìn)行KEGG功能分析,挑選顯著性排名前20的通路制作成KEGG通路富集因子氣泡圖。圖7顯示,這些差異表達(dá)基因主要被富集到單純皰疹病毒感染(Herpes simplex virus 1 infection)等病毒感染通路;細(xì)胞凋亡(apoptosis)、壞死性凋亡(necroptosis)等程序性死亡通路;以及NOD樣受體信號(hào)通路(NOD-like receptor signaling pathway)、Toll樣受體信號(hào)通路(Toll-like receptor signaling pathway)、趨化因子信號(hào)通路(Chemokine signaling pathway)等免疫相關(guān)通路上。這些結(jié)果表明,PRV感染會(huì)影響宿主免疫防御反應(yīng)相關(guān)信號(hào)通路,影響基因表達(dá)及蛋白質(zhì)合成引起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。

圖7 KEGG富集因子氣泡圖

2.3.5 差異表達(dá)基因RT-qPCR驗(yàn)證 為驗(yàn)證高通量測(cè)序結(jié)果的可信度和準(zhǔn)確性,隨機(jī)挑選10條差異表達(dá)基因,其中3條基因測(cè)序結(jié)果為上調(diào),7條基因測(cè)序結(jié)果為下調(diào)。通過(guò)RT-qPCR進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證。結(jié)果如圖8所示,10條基因趨勢(shì)均與測(cè)序結(jié)果一致,表明本研究RNA-seq測(cè)序數(shù)據(jù)具有較高的準(zhǔn)確性和可信度。

縱坐標(biāo)為FC以2為底數(shù)的對(duì)數(shù)The y-axis represents the logarithm base 2 of FC

3 討論

PRV感染豬后可在機(jī)體內(nèi)建立終身感染機(jī)制,當(dāng)機(jī)體抗體水平下降,潛伏的病毒就會(huì)導(dǎo)致機(jī)體發(fā)病。然而目前并沒(méi)有有效的方法來(lái)清除潛伏的PRV,隨著2011年P(guān)RV 2型毒株在我國(guó)卷土重來(lái)給我國(guó)豬養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)影響,亟需了解PRV的感染機(jī)制以及制定出相應(yīng)的防控措施,因此對(duì)于PRV在宿主細(xì)胞中感染和復(fù)制的研究逐漸成為了研究熱點(diǎn)。

組蛋白乙酰化是一種廣泛存在于真核生物中的染色質(zhì)修飾機(jī)制,主要通過(guò)HATs和HDACs對(duì)組蛋白上的賴氨酸進(jìn)行修飾。HATs可增加組蛋白和非組蛋白調(diào)節(jié)蛋白中賴氨酸殘基的乙?；?而HDACs則具有相反的作用。前者的修飾通過(guò)開放的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)激活RNA轉(zhuǎn)錄,而后者的修飾則抑制基因轉(zhuǎn)錄[13]。病毒感染可以影響宿主細(xì)胞的乙?；揎椖Ｊ?調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性和相互作用,從而影響細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、代謝和免疫等生理和病理過(guò)程。有研究表明,抑制HDAC1可誘導(dǎo)DNA損傷反應(yīng)導(dǎo)致雙鏈DNA釋放到細(xì)胞質(zhì)中,激活cGMP-cAMP合成酶和下游的STING/TBK1/IRF3先天免疫信號(hào)通路從而抑制PRV感染[14]。也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),PRV感染可以誘導(dǎo)H2AX的磷酸化并導(dǎo)致DNA損傷反應(yīng)敲除HDAC6可以抑制PRV感染,過(guò)表達(dá)HDAC6可以促進(jìn)PRV感染[15];常雯茹發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)HDAC1促進(jìn)PRV感染,沉默HDAC1抑制PRV感染[16]。上述研究表明,組蛋白乙?；揎椩赑RV感染過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。本研究中PRV感染早期12 h時(shí)HAT和HDAC修飾酶存在顯著或極顯著差異,這表明這一時(shí)間段是PRV感染和復(fù)制的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。表明PRV感染會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)染色質(zhì)上的組蛋白修飾來(lái)影響宿主細(xì)胞基因表達(dá)以及與宿主細(xì)胞互作,從而對(duì)細(xì)胞的生理和免疫進(jìn)程產(chǎn)生一定的影響。這種變化可能與病毒侵入宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答、病毒基因轉(zhuǎn)錄以及病毒復(fù)制等過(guò)程存在相關(guān)的調(diào)控通路和機(jī)制,結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室前人研究,故選取12 h細(xì)胞樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

近年來(lái)高通量測(cè)序技術(shù)被廣泛應(yīng)用于病毒感染引起的差異轉(zhuǎn)錄組研究中,可為研究提供豐富的基礎(chǔ)數(shù)據(jù),進(jìn)一步揭示病毒感染的機(jī)制。病毒感染宿主后,機(jī)體免疫相關(guān)通路會(huì)被激活,發(fā)揮抗病毒作用以清除病原并減輕自身?yè)p傷[17];李海敏等[18]通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)分析出PRV感染PK-15細(xì)胞差異基因聚焦于免疫等信號(hào)通路;有研究表明沉默lncA3可顯著上調(diào)IRF1、IFNβ的轉(zhuǎn)錄水平,抑制PRV-Ⅱ的復(fù)制[19];PRV與細(xì)胞自噬存在關(guān)聯(lián),PRV感染早期促進(jìn)細(xì)胞自噬,后期通過(guò)激活PI3K/AKT/mTORC1途徑抑制自噬[20]。

本研究對(duì)PRV感染的豬脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,對(duì)DEGs進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。結(jié)果顯示,PRV感染后具有顯著差異的基因有2 293個(gè),其中轉(zhuǎn)錄顯著上調(diào)的基因有726個(gè),轉(zhuǎn)錄顯著下調(diào)的基因1 567個(gè)。根據(jù)GO功能分析可以發(fā)現(xiàn)這些差異基因廣泛分布于細(xì)胞膜、核、質(zhì)中,調(diào)節(jié)細(xì)胞膜表面受體活性,參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),調(diào)節(jié)病毒基因組復(fù)制,影響細(xì)胞因子活性,介導(dǎo)炎癥反應(yīng)等生物學(xué)進(jìn)程,這說(shuō)明PRV感染會(huì)破壞宿主的物質(zhì)代謝和生物合成過(guò)程從多個(gè)方面影響宿主細(xì)胞。KEGG功能分析則聚焦于免疫相關(guān)通路,包括Toll樣受體信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路等通路。PRV感染后,通過(guò)激活TLR-NF-κB信號(hào)通路和AIM2炎癥小體以增強(qiáng)小鼠的炎癥反應(yīng)[21]。NOD樣受體能夠激活NF-κB信號(hào)通路,引發(fā)促炎性因子的表達(dá)和釋放,最終導(dǎo)致炎癥的發(fā)生[22-23]。已有文獻(xiàn)報(bào)道PRV感染會(huì)影響宿主免疫防御反應(yīng)相關(guān)信號(hào)通路,影響基因表達(dá)及蛋白質(zhì)合成,引起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng),而這些通路也被證實(shí)與組蛋白乙?；嬖诼?lián)系[24-26],但仍需要進(jìn)一步研究其與PRV之間的聯(lián)系。此外,KEGG結(jié)果顯示DEGs還富集到了細(xì)胞凋亡、壞死性凋亡等程序性死亡通路,這可能與PRV感染導(dǎo)致的細(xì)胞損傷、炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)等多種機(jī)制相關(guān)。未來(lái)可對(duì)PRV感染導(dǎo)致的細(xì)胞死亡機(jī)制進(jìn)行更深入的研究,更好地理解PRV的致病機(jī)制,為該病毒的防控提供理論基礎(chǔ)。

本研究通過(guò)ELISA、RT-qPCR檢測(cè)了PRV感染豬脾淋巴細(xì)胞HAT、HDAC的表達(dá)水平和轉(zhuǎn)錄水平,對(duì)PRV感染豬脾淋巴細(xì)胞12 h的樣本進(jìn)行了高通量測(cè)序并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。這些差異表達(dá)基因大多被富集到了病毒性疾病、免疫、代謝和凋亡等生物學(xué)過(guò)程以及Toll樣受體信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路等通路,可為進(jìn)一步了解PRV感染、致病的分子機(jī)制提供參考。