劉蓓蓓 韋艷娜 陳蓉 謝星 倪博 郝飛 張珍珍 白昀 袁廳 馮志新

摘要：為了快速、高效制備非洲豬瘟病毒（ASFV）單克隆抗體，本研究通過大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)并純化了ASFV重組蛋白pA104R。以ASFV重組蛋白pA104R為抗原，分別比較了CpG ODN聯(lián)合氫氧化鋁佐劑和常規(guī)弗氏佐劑兩種免疫策略，并重點(diǎn)比較半固體培養(yǎng)法和常規(guī)有限稀釋法來制備ASFV pA104R單克隆抗體的效率。結(jié)果顯示，本研究獲得了相對(duì)分子質(zhì)量為3.5×104的ASFV重組可溶性蛋白pA104R，通過其與CpG ODN聯(lián)合氫氧化鋁佐劑免疫小鼠，在第21 d即可達(dá)到融合要求，本試驗(yàn)方法（重組蛋白pA104R與CpG ODN聯(lián)合氫氧化鋁佐劑免疫）較重組蛋白pA104R與常規(guī)弗氏佐劑免疫節(jié)省14 d時(shí)間。通過半固體培養(yǎng)法篩選單克隆的試驗(yàn)周期比有限稀釋法縮短28 d，并減少了亞克隆的工作量。半固體培養(yǎng)法獲得5株陽性雜交瘤細(xì)胞，挑選效價(jià)較高的3株（9A4、9H6、11F5）進(jìn)行鑒定，重鏈均為IgG，輕鏈均為KAPPA。純化后的3株單克隆抗體針對(duì)pA104蛋白和全病毒蛋白質(zhì)的效價(jià)分別達(dá)1∶160 000～1∶320 000和1∶200～1∶400。本研究?jī)?yōu)選了CpG ODN聯(lián)合氫氧化鋁佐劑結(jié)合半固體培養(yǎng)法篩選pA104R的單克隆抗體，為單克隆抗體制備提供了快速高效的新策略。

關(guān)鍵詞：非洲豬瘟病毒；pA104蛋白；單克隆抗體；半固體培養(yǎng)法

中圖分類號(hào)：S852.65+1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1000-4440（2024）04-0682-08

Preparation of monoclonal antibody against pA104R protein of African swine fever virus by semi-solid culture method

LIU Bei-bei1，2，WEI Yan-na1，2，CHEN Rong1，2，XIE Xing1，2，NI Bo1，2，HAO Fei1，2，ZHANG Zhen-zhen1，2，BAI Yun1，2，YUAN Ting1，2，F(xiàn)ENG Zhi-xin1，2

（1. Institute of Veterinary Medicine， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Veterinary Biological Enginering and Technology， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Nanjing 210014， China；2.GuoTai （Taizhou） Center of Technology Innovation for Veterinary Biologicals， Taizhou 225300， China）

Abstract：In order to prepare the monoclonal antibodies against African swine fever virus （ASFV） rapidly and efficiently， the recombinant pA104R protein of ASFV was systematically expressed and purified by Escherichia coli in this study. The recombinant pA104R protein of ASFV was used as antigen to compare the two immune strategies of CpG ODN combined with aluminum hydroxide adjuvant and conventional Freunds adjuvant， respectively， and the efficiency of semi-solid culture method and conventional limited dilution method in the preparation of monoclonal antibody against ASFV pA104R was compared. The results showed that the recombinant pA104R soluble protein of ASFV with a relative molecular weight of 3.5×104 was obtained， and the fusion requirement was achieved on the 21st day after the mice were immunized with CpG ODN and aluminum hydroxide adjuvant. Compared with routine Freunds adjuvant immunization and recombinant pA104R protein， CpG ODN combined with aluminum hydroxide adjuvant and semi-solid culture method in this experiment saved 14 days. The semi-solid culture method shortened the test period of monoclonal screening by 28 days compared with the limited dilution method， and saved a lot of subclonal workload. Five positive hybridoma cell lines were obtained by semi-solid culture method， and three high titer hybridoma cell lines （9A4， 9H6， 11F5） were selected for identification. The heavy chain was IgG， and the light chain was KAPPA. The titers of three purified monoclonal antibodies against pA104 protein and whole virus protein were 1∶160 000-1∶320 000 and 1∶200-1∶400， respectively. In this study， monoclonal antibodies were screened by CpG combined with aluminum hydroxide adjuvant and semi-solid culture method， providing a new rapid and efficient strategy for monoclonal antibody preparation.

Key words：African swine fever virus；pA104 protein；monoclonal antibody；semi-solid medium method

非洲豬瘟（African swine fever， ASF）是一種由ASF病毒（ASFV）引起的一種急性烈性傳染病，是對(duì)養(yǎng)豬業(yè)具有威脅性的一種疾病，致死率近100%[1]。該病首次報(bào)道于1921年肯尼亞，隨后陸續(xù)在全球各地暴發(fā)，曾在非洲、歐洲和美洲等數(shù)十個(gè)國(guó)家流行。2018年傳入中國(guó)沈陽，短短數(shù)月席卷全國(guó)，對(duì)中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成毀滅性打擊[2]。

ASF疫情快速蔓延，其中一個(gè)原因就是缺乏快速高效的現(xiàn)場(chǎng)診斷產(chǎn)品，因此針對(duì)ASFV的特異蛋白制備單克隆抗體對(duì)于開發(fā)ASFV檢測(cè)試劑盒至關(guān)重要。ASFV是一種線狀、二十面體帶囊膜的雙鏈DNA病毒，病毒結(jié)構(gòu)復(fù)雜[3-4]。病毒基因組長(zhǎng)170～190 kb，含有150～170個(gè)開放閱讀框[5]，其中ORFA104R編碼了一種類組蛋白（pA104R），高度保守，pA104R是唯一由病毒編碼的類組蛋白[6-8]。ASFV包括基因組和核蛋白，pA104R是發(fā)揮主要功能的核蛋白，主要出現(xiàn)在感染后期，有很好的免疫反應(yīng)性，是IgM和IgG抗體反應(yīng)性較好的靶標(biāo)蛋白[9]。有研究結(jié)果顯示，無癥狀豬的抗體反應(yīng)要高于慢性感染的豬，并且在細(xì)胞水平上敲低pA104R基因，ASFV的核酸拷貝量會(huì)顯著降低，由此，針對(duì)pA104R蛋白的抗體可能有效免疫ASFV[6，9]；二苯乙烯衍生物SD1和SD4可以劑量依賴性的方式阻斷pA104R蛋白與DNA結(jié)合，抑制ASFV在豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）中復(fù)制，提示pA104R蛋白在ASFV復(fù)制過程中具有重要作用，pA104R蛋白可用于制備ASFV疫苗[10]。

免疫佐劑，又被稱為非特異性免疫增生劑，如氫氧化鋁、明礬、礦物油、脂多糖、CpG寡脫氧核苷酸（CpG oligonucleotide）等，其與抗原同時(shí)注射到機(jī)體可增強(qiáng)免疫原性或改變免疫反應(yīng)類型。CpG ODN是在含鳥嘌呤（Guanine）、胞嘧啶（Cytosine）的二核苷酸序列（CpG）的基礎(chǔ)上，經(jīng)非甲基化修飾后的寡聚脫氧核苷酸鏈。20世紀(jì)80年代，Tokunaga[11]發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌的DNA具有抗腫瘤作用，可升高NK活性進(jìn)而誘導(dǎo)Ⅰ型和Ⅱ型干擾素產(chǎn)生。之后1995年發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤作用DNA中所含的非甲基化CpG基序的結(jié)構(gòu)和其免疫刺激特性密切相關(guān)[12]，上述研究結(jié)果表明CpG ODN能夠增強(qiáng)免疫細(xì)胞的增值，誘導(dǎo)其分泌多種細(xì)胞因子[13-14]，和鋁佐劑聯(lián)合應(yīng)用可以延長(zhǎng)其在體內(nèi)的作用時(shí)間[15].

自1975年Kohler和Milstein的單克隆抗體制備技術(shù)問世，單克隆抗體在人類和動(dòng)物疾病的診斷、治療領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用。目前很多實(shí)驗(yàn)室制備單克隆抗體的方法仍然是傳統(tǒng)的有限稀釋法，耗時(shí)較長(zhǎng)，工作量較大，且不分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞，影響陽性雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)甚至死亡導(dǎo)致陽性克隆丟失，通過甲基纖維素半固體培養(yǎng)法篩選單個(gè)克隆，一步即可完成單克隆，無需進(jìn)行多次亞克隆，相比較有限稀釋法，縮短試驗(yàn)周期，可大量節(jié)約試驗(yàn)成本[16-17]。

本研究對(duì)非洲豬瘟病毒核蛋白pA104R進(jìn)行可溶性表達(dá)，以pA104R蛋白為抗原，弗氏佐劑和CpG ODN氫氧化鋁混合佐劑分別為佐劑免疫4～6周齡BALB/c小鼠，并利用有限稀釋法和半固體培養(yǎng)基法制備單克隆抗體，建立起較為快速高效的單克隆抗體制備方法。為后期針對(duì)ASFV抗原抗體的檢測(cè)提供重要生物材料。

1材料與方法

1.1主要試驗(yàn)材料

小鼠骨髓瘤細(xì)胞（SP2/0）、PET-32a、 Escherichia coli（E.coli） strain BL21（DE3）-pLysS感受態(tài)均由本實(shí)驗(yàn)室保存；4～6周齡雌性BALB/c小鼠購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。

CpG ODN1826（CpG oligodeoxynucleotide1826）、氫氧化鋁購(gòu)自Invivo公司；弗氏完全佐劑（Freunds complete adjuvant）、弗氏不完全佐劑（Freunds incomplete adjuvant）購(gòu)自Merck公司；HAT、HT、聚乙二醇（PEG4000）選擇培養(yǎng)液添加劑購(gòu)自Merck公司；半固體培養(yǎng)基購(gòu)自Molecular Devices公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；Talon填料購(gòu)自美國(guó)Cytiva公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG（HRP-羊抗鼠IgG）購(gòu)自武漢博士德生物工程公司；ELC顯色液購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；亞型鑒定試劑盒購(gòu)自Thermo Scientific公司。滅活的ASFV全病毒抗原以及滅活的ASFV陽性血清由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供。

1.2表達(dá)菌株的構(gòu)建

從GenBank中獲得ASFV ChinaPig/HLJ/2018株pA104R基因序列（GenBank登錄號(hào)：MK333180.1），以該基因序列為模板，用優(yōu)化軟件（http：/www.jcat.de/）對(duì)密碼子優(yōu)化，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成pA104R全基因序列，基因長(zhǎng)312 bp，編碼104個(gè)氨基酸，編碼的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為1.15×104。將該基因連接至pET-32a（+）載體，插入酶切位點(diǎn)Eco R Ⅰ和Hind Ⅲ，構(gòu)建成pET-32a（+）-pA104R重組表達(dá)質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒pET-32a（+）-pA104R轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3），挑單菌落接種于添加60 μg/ml氨芐青霉素的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑單菌落接種于LB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)10 h以上，即為重組pA104R的表達(dá)菌株pET-32a（+）-A104R E.coliBL21（DE3）。

1.3重組蛋白的表達(dá)和純化鑒定

按1∶100將重組pA104R的表達(dá)菌株pET-32a（+）-A104R E.coliBL21（DE3）接種至LB培養(yǎng)基中，當(dāng)菌液OD600達(dá)到0.8時(shí)，加入IPTG溶液（終濃度0.4 mmol/L），18 ℃恒溫誘導(dǎo)過夜，第2 d收集菌體，超聲波裂解后10 000 g離心10 min，分別收集上清液和沉淀，上清液用0.45 μm濾器過濾。用基礎(chǔ)緩沖液洗Talon純化柱（緩沖液：30 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0， 300 mmol/L NaCl，20 mmol/L的咪唑，2%甘油）。將過濾后的含有重組蛋白pA104R的上清液全部加入Talon柱進(jìn)行充分掛柱，先用基礎(chǔ)緩沖液沖洗未掛柱的雜蛋白，再分別用含50 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L和400 mmol/L咪唑的洗脫液梯度洗脫，收集洗脫液。測(cè)定收集到的洗脫液的蛋白質(zhì)濃度，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。隨后用分子篩層析分離Talon柱上洗脫下來的蛋白質(zhì)，進(jìn)行下一步的純化，最后將重組蛋白pA104R超濾濃縮，使其質(zhì)量濃度在2 mg/ml以上。參照實(shí)驗(yàn)室前期關(guān)于P10蛋白的純化與鑒定方法[18]，對(duì)pA104R蛋白進(jìn)行鑒定。重組蛋白pA104R經(jīng)SDS-PAGE電泳，用PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)印，37 ℃封閉2 h。一抗為1∶200的ASFV陽性血清，37 ℃孵育2 h，二抗為1∶10 000稀釋的羊抗豬IgG-HRP，37 ℃孵育2 h。最后用ECL顯色液曝光檢測(cè)。

1.4動(dòng)物免疫和血清效價(jià)檢測(cè)

將重組蛋白pA104R作為抗原，免疫佐劑分2組，CpG和氫氧化鋁混合佐劑（100 μl氫氧化鋁溶解10 μg CpG佐劑）組和弗氏佐劑組，免疫4～6周齡雌性BALB/c小鼠。CpG和氫氧化鋁混合佐劑采取腹腔免疫方式，采用100 μg抗原+100 μl混合佐劑，每7 d用混合佐劑免疫1次，共免疫4次，在第3次免疫后7 d（第1次免疫后21 d）眼眶采血，分離血清，用間接ELISA方法檢測(cè)小鼠抗體水平。選取血清效價(jià)＞1×105的小鼠脾細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞進(jìn)行融合，在細(xì)胞融合開始前3 d用不加佐劑的pA104R重組蛋白加強(qiáng)免疫小鼠（每只50 μg）。弗氏佐劑組采用皮下注射免疫，第1次用弗氏完全佐劑和等量的pA104R蛋白進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射免疫，每隔14 d再用弗氏不完全佐劑和等量的pA104R蛋白加強(qiáng)免疫，第3次免疫后7 d（第1次免疫后35 d）眼眶采血，分離血清，間接ELISA方法檢測(cè)小鼠抗體分泌水平。具體方法如下：用包被液（pH 9.6的碳酸鹽緩沖液）將純化后的pA104R蛋白和ASFV全病毒蛋白2.5 μg/ml包被ELISA酶標(biāo)板，每孔100 μl，4 ℃過夜，封閉液37 ℃封閉2 h，加入連續(xù)10倍稀釋的待檢小鼠血清，同時(shí)以陽性豬血清作為陽性對(duì)照，未免疫的小鼠血清作為陰性對(duì)照，37 ℃孵育1 h，加入羊抗鼠IgG-HRP（1∶10 000），每孔100 μl，37 ℃孵育0.5 h，TMB顯色液避光顯色10 min，用2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，每孔50 μl，測(cè)定OD450值，Cut-off值為陰性血清平均值的2.1倍，設(shè)定OD450值＞Cut-off值為陽性，取待檢血清對(duì)應(yīng)的最高稀釋度作為血清的效價(jià)。

1.5陽性雜交瘤細(xì)胞株的篩選和鑒定

融合前7 d，將SP2/0細(xì)胞復(fù)蘇并擴(kuò)大培養(yǎng)，融合前3 d以不加佐劑的重組pA104R蛋白為抗原加強(qiáng)免疫1次。融合時(shí)，將小鼠腹腔打開，摘出脾臟研磨后過濾，收集脾細(xì)胞，將小鼠脾細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞5∶1融合，利用PEG法制備雜交瘤細(xì)胞。半固體培養(yǎng)方法：將融合后的細(xì)胞接種至恢復(fù)培養(yǎng)基中，置于37 ℃溫箱中培養(yǎng)過夜。第2 d離心后接種至半固體培養(yǎng)基中，置于37 ℃溫箱中靜置培養(yǎng)。7～10 d形成肉眼可見的克隆團(tuán)，將單個(gè)克隆團(tuán)移至完全培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增，在細(xì)胞長(zhǎng)至孔底面積的1/4～1/2時(shí)即可篩選，篩選到的陽性雜交瘤細(xì)胞克隆純化1次，利用間接ELISA方法確認(rèn)雜交瘤細(xì)胞株的陽性率為100%。有限稀釋培養(yǎng)方法：在融合的前1 d準(zhǔn)備飼養(yǎng)細(xì)胞，將陰性小鼠處死且表面消毒后固定好，剪開并掀起腹部皮膚暴露腹膜，用注射器注射5 ml不完全培養(yǎng)基至腹腔內(nèi)，輕柔按摩腹膜后將培養(yǎng)基吸出離心，將細(xì)胞調(diào)整至1 ml 2×105個(gè)1 000 μl/孔接入96孔板內(nèi)，即為飼養(yǎng)細(xì)胞。將PEG融合后的細(xì)胞按每孔100 μl接入已接種過飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)板內(nèi)置于37 ℃含5%二氧化碳的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。5 d后換出1/2的HAT培養(yǎng)基，7～10 d后全部換成HT培養(yǎng)基。當(dāng)孔底的細(xì)胞長(zhǎng)至孔底面積的1/4時(shí)即可吸出上清液進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)陽性細(xì)胞株進(jìn)行2次檢測(cè)，去除假陽性和分泌不穩(wěn)定的細(xì)胞，再對(duì)剩余的陽性細(xì)胞進(jìn)行3次亞克隆，每次亞克隆前準(zhǔn)備飼養(yǎng)細(xì)胞。將3次克隆純化后篩選的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存，收集細(xì)胞上清液，按單克隆抗體亞型鑒定試劑盒說明書操作，取800 μl雜交瘤細(xì)胞上清液加入檢測(cè)孔中進(jìn)行檢測(cè)。

1.6單克隆抗體的鑒定

利用Western blot方法分別將ASFV重組蛋白pET-32a（+）-pA104R和pET-32a空載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌然后用IPTG誘導(dǎo)出的全菌蛋白經(jīng)SDS-PAGE 電泳分離，用半干式轉(zhuǎn)印方法轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜。小鼠腹水1∶5 000稀釋作為一抗分別孵育ASFV重組蛋白 pA104R和pET-32a空載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌后誘導(dǎo)出的全菌蛋白質(zhì)，37 ℃孵育2 h。以1∶10 000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG為二抗37 ℃孵育1 h。加入ECL避光顯色至條帶出現(xiàn)，拍照。

1.7單抗腹水的制備純化與效價(jià)測(cè)定

每只經(jīng)產(chǎn)母鼠腹腔注射0.5 ml滅菌液體石蠟，7～10 d后腹腔注射1×106個(gè)雜交瘤細(xì)胞。5～7 d后觀察到小鼠腹部開始隆起，收集腹水，5 000 r/min離心10 min，取上清液，56 ℃水浴滅活腹水中的蛋白質(zhì)水解酶，待溫度降至室溫后保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

將收集的腹水按辛酸-硫酸銨方法提取腹水中的IgG抗體，并透析24 h以上保證除去其中的硫酸銨。ASFV全病毒蛋白和ASFV重組蛋白pA104R包被的酶標(biāo)板用材料與方法1.4中的ELISA方法測(cè)定效價(jià)。

2結(jié)果與討論

2.1重組蛋白pA104R的表達(dá)

收集陽性菌液進(jìn)行IPTG小量誘導(dǎo)表達(dá)（終濃度0.4 mmol/L），并設(shè)置未誘導(dǎo)菌液為陰性對(duì)照，18 ℃ 180 r/min誘導(dǎo)12 h后進(jìn)行超聲波破碎，收集上清液和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。在表達(dá)菌裂解后的上清液和沉淀中均能檢測(cè)到重組蛋白pA104R，表明pA104R是可溶性蛋白（圖1A）。與未誘導(dǎo)菌液相比較，誘導(dǎo)后的菌株[pET-32a（+）-pA104R E.coli BL21（DE3）]可以成功表達(dá)出重組蛋白pA104R，相對(duì)分子質(zhì)量為3.5×104。表明重組pA104R表達(dá)菌株pET-32a（+）-pA104R E.coli BL21（DE3）能表達(dá)pA104R，且上清液和沉淀中均可檢測(cè)到。

2.2pA104的原核表達(dá)、純化和鑒定

重組蛋白pA104R采用Talon親和層析柱進(jìn)行純化，用20 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L和400 mmol/L濃度咪唑洗脫pA104R蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pA104R主要在50 mmol/L、100 mmol/L和200 mmol/L的咪唑中被洗脫（圖1B），隨后用分子篩層析分離Talon柱上洗脫下來的蛋白質(zhì)，進(jìn)行下一步的純化，通過軟件Image J分析重組蛋白pA104R的純度，純度大約為85%（圖1C）。經(jīng)免疫印跡Western blot分析，表明重組蛋白pA104R能與ASFV陽性血清發(fā)生反應(yīng)（圖1D），說明表達(dá)的重組蛋白pA104R具有良好的免疫原性。

2.3融合前小鼠效價(jià)檢測(cè)

采用材料與方法1.4中的方法免疫小鼠，利用ELISA方法分別對(duì)弗氏佐劑組在第1次免疫后21 d（第2次免疫后7 d）、第1次免疫后35（第3次免疫后7 d）、第1次免疫后42 d（第3次免疫后14 d）和CpG聯(lián)合氫氧化鋁佐劑組第1次免疫后14 d（第2次免疫后7 d）、第1次免疫后21 d（第3次免疫后7 d）、第1次免疫后35 d（第4次免疫后14 d）檢測(cè)小鼠抗體水平，本研究將不同時(shí)間點(diǎn)采集的小鼠血清按1∶100 000倍稀釋后進(jìn)行抗體檢測(cè)，結(jié)果顯示弗氏佐劑組需在第1次免疫后42 d小鼠抗體才達(dá)到1∶100 000以上（圖2A），而CpG聯(lián)合氫氧化鋁佐劑組小鼠抗體在第1次免疫后21 d即可達(dá)到1∶100 000以上（圖2B），比弗氏佐劑組早21 d。在總免疫程序上CpG聯(lián)合氫氧化鋁佐劑免疫組在第1次免疫后28 d小鼠脾細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞開始融合，比弗氏佐劑免疫組（第1次免疫后42 d小鼠脾細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞融合）縮短14 d。

2.4陽性雜交瘤細(xì)胞株的篩選及鑒定

在融合后7 d，半固體培養(yǎng)基法培養(yǎng)的克隆團(tuán)大小肉眼可見（圖3）。吸取單個(gè)克隆接種于含有完全培養(yǎng)基的96孔板內(nèi)，3 d后培養(yǎng)基顏色由橙紅色變成橘黃色或黃色吸取上清液進(jìn)行ELISA檢測(cè)。有限稀釋法在7 d換成HT培養(yǎng)液，2 d后營(yíng)養(yǎng)液由橙紅色變成橘黃色或黃色，此時(shí)吸取上清液進(jìn)行ELISA檢測(cè)。通過間接ELISA方法共篩選到9株雜交瘤細(xì)胞株，其中有限稀釋法篩選到4株，半固體培養(yǎng)基法篩選到5株。共挑選效價(jià)較高的3株（均來自半固體培養(yǎng)法）進(jìn)行亞型鑒定，結(jié)果顯示3株雜交瘤細(xì)胞株重鏈均為IgG，輕鏈均為KAPPA。對(duì)這3株雜交瘤細(xì)胞上清液進(jìn)行Western blot檢測(cè)，結(jié)果顯示，從這3株雜交瘤細(xì)胞分別獲得的單克隆抗體9H6、9A4、11F5均能特異性地識(shí)別pA104R蛋白（圖4）。

2.5小鼠腹水制備及效價(jià)測(cè)定

將3株雜交瘤細(xì)胞分別注射至提前注射了液體石蠟的小鼠腹腔內(nèi)，使小鼠產(chǎn)生腹水，收集腹水進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)。9A4細(xì)胞株針對(duì)pA104R效價(jià)為1∶320 000，針對(duì)ASFV全病毒蛋白質(zhì)效價(jià)為1∶200，9H6和11F5細(xì)胞株針對(duì)pA104R效價(jià)為1∶160 000，針對(duì)ASFV全病毒蛋白質(zhì)效價(jià)為1∶400。

2.6有限稀釋法和半固體培養(yǎng)法的比較

有限稀釋法和半固體培養(yǎng)法相比較，半固體培養(yǎng)法在節(jié)省時(shí)間上優(yōu)勢(shì)明顯，整個(gè)試驗(yàn)周期比有限稀釋法縮短28 d；有限稀釋法在亞克隆過程中需要飼養(yǎng)細(xì)胞，且需要3次亞克隆，步驟繁瑣，半固體法不需要飼養(yǎng)細(xì)胞，僅需要1次亞克?。ū?），其中半固體法的亞克隆方法同有限稀釋法，目的是鑒定克隆團(tuán)的純度。

3討論

單克隆抗體在人類和動(dòng)物的疾病診斷、治療領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用。目前很多實(shí)驗(yàn)室制備單克隆抗體使用的方法仍然是傳統(tǒng)的有限稀釋法，亞克隆工作量大，想得到很純的單克隆需要進(jìn)行至少3次的亞克隆，而3次亞克隆至少需要20～30 d，使用5～10塊96孔板進(jìn)行ELISA檢測(cè)，耗時(shí)較長(zhǎng)，工作量較大。更為重要的是，生長(zhǎng)較快的細(xì)胞一般是不分泌抗體的，它的快速生長(zhǎng)影響陽性雜交瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)進(jìn)而導(dǎo)致陽性克隆可能丟失。早在1991年國(guó)內(nèi)就有報(bào)道，利用甲基纖維素制備半固體培養(yǎng)基，成功培養(yǎng)細(xì)胞集落而篩選出單抗細(xì)胞株[19]。采用半固體培養(yǎng)基篩選單個(gè)克隆團(tuán)，相互不混雜，每個(gè)克隆團(tuán)都是獨(dú)立生長(zhǎng)于半固體培養(yǎng)基上，彼此之間不連接，在顯微鏡下挑選克隆團(tuán)時(shí)同時(shí)吸取兩個(gè)克隆團(tuán)的幾率很小，保證了每個(gè)克隆團(tuán)的純度。每融合1只小鼠，則可以得到幾百上千個(gè)克隆團(tuán)，大量的克隆團(tuán)可增加篩選到高質(zhì)量克隆團(tuán)的概率，也可避免陽性克隆團(tuán)因生長(zhǎng)緩慢而被陰性克隆團(tuán)覆蓋導(dǎo)致陽性克隆團(tuán)丟失的可能，無需進(jìn)行多次亞克隆，可縮短約一半試驗(yàn)時(shí)間，節(jié)省培養(yǎng)基血清的消耗，可大量節(jié)約人力物力，降低試驗(yàn)成本[16，20]。半固體培養(yǎng)基法也會(huì)出現(xiàn)假陽性，在將克隆團(tuán)轉(zhuǎn)移至96孔板中培養(yǎng)后第1次檢測(cè)中可能會(huì)出現(xiàn)很多假陽性，在經(jīng)過2～3次傳代后檢測(cè)得到的陽性克隆即為穩(wěn)定的陽性雜交瘤細(xì)胞株，將得到的陽性雜交瘤細(xì)胞株連續(xù)培養(yǎng)10代仍然可以穩(wěn)定分泌抗體，這一過程可淘汰掉抗體分泌不穩(wěn)定的細(xì)胞株。本實(shí)驗(yàn)室總結(jié)分析多次制備單克隆抗體的數(shù)據(jù)，在抗體效價(jià)方面，有限稀釋法和半固體培養(yǎng)法未見明顯區(qū)別，因半固體培養(yǎng)法試驗(yàn)進(jìn)程較快，遂本試驗(yàn)鑒定所用的3株雜交瘤細(xì)胞株均來自半固體法。

免疫佐劑作為1種增強(qiáng)劑在疫苗的研發(fā)和生產(chǎn)中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。不同的佐劑在動(dòng)物體內(nèi)可以產(chǎn)生不同的影響，選擇合適的佐劑對(duì)提高免疫效果有促進(jìn)作用。CpG ODN是人工合成的有免疫刺激活性的DNA序列，它有和細(xì)菌DNA類似的免疫刺激作用，具有促進(jìn)Th1免疫應(yīng)答的特點(diǎn)，已在動(dòng)物臨床研究中被證明其具有免疫活性，能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答，增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答[21]。CpG ODN佐劑與氫氧化鋁聯(lián)合使用，可明顯增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答，產(chǎn)生高濃度的抗體[22]。而不同類型的CpG ODN佐劑效應(yīng)也有一定的差異，例如GTCGTT對(duì)人淋巴細(xì)胞具有良好的刺激活性，是人敏感基序；GACGTT對(duì)鼠淋巴細(xì)胞有較好的刺激活性，是鼠敏感基序[23-24]，CpG ODN1826是小鼠的最佳免疫佐劑。CpG ODN可通過化學(xué)方法大量合成，以凍干粉形式保存，狀態(tài)穩(wěn)定便于運(yùn)輸，且具有易于質(zhì)量控制，成本低等特點(diǎn)被廣泛關(guān)注和研究，其在腫瘤和傳染病等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，在人藥和疫苗研發(fā)中被廣泛應(yīng)用，例如乙肝疫苗等[25]。本研究以ASFV重組pA104R蛋白為抗原，CpG ODN聯(lián)合氫氧化鋁為佐劑免疫小鼠，全程免疫時(shí)間28 d即可結(jié)束，而使用傳統(tǒng)弗氏佐劑需要42 d的免疫時(shí)間，可節(jié)省14 d免疫時(shí)間。

本研究分別使用CpG ODN聯(lián)合氫氧化鋁免疫佐劑和ASFV pA104R蛋白、弗氏佐劑和ASFV pA104R蛋白免疫小鼠，通過半固體培養(yǎng)法和有限稀釋法共得到9株陽性雜交瘤細(xì)胞，對(duì)其中的3株進(jìn)行鑒定，均能和ASFV全病毒蛋白以及pA104R蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。雖已有研究制備了ASFV pA104R蛋白的單克隆抗體，但其使用的佐劑為傳統(tǒng)的弗氏佐劑，且使用傳統(tǒng)有限稀釋法制備單抗[26]。相比于先前的報(bào)道，本研究獲得的單克隆抗體9A4、11F5、9H6效價(jià)高，制備周期短，可節(jié)約大量的試驗(yàn)成本。本研究結(jié)果為ASFV pA104R蛋白功能鑒定和ASFV血清學(xué)診斷方法的建立奠定了重要基礎(chǔ)，還為單克隆抗體制備提供了新的策略。

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（責(zé)任編輯：成紓寒）

收稿日期：2023-03-30

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃政府間國(guó)際科技創(chuàng)新合作重點(diǎn)專項(xiàng)（2019YFE0107300）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新基金項(xiàng)目[CX（22）2037]

作者簡(jiǎn)介：劉蓓蓓（1989-），女，江蘇徐州人，本科，助理研究員，主要從事單抗制備研究。（E-mail）liubei2012203@163.com

通訊作者：馮志新，（E-mail）fzxjaas@163.com