楊子鋒 黃琳婉 翁書凝 徐虎嘯 王聰勐 趙愛玉 湯蔚

摘要

氨肽酶是一類可以選擇性剪切氨基酸殘基的蛋白酶，液泡氨肽酶Y能夠調(diào)控堿性氨基酸殘基的剪切以及液泡的活性。本研究通過同源性比對獲得酵母液泡氨肽酶Y在稻瘟病菌中的同源基因PoAPE3，利用基因敲除法獲得?PoAPE3基因敲除突變體（ΔPoAPE3），并構(gòu)建回補體菌株進行生物學功能分析。表型測定結(jié)果表明，PoAPE3基因敲除突變體在產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率、致病性、侵染過程等方面與野生型均無明顯差異。突變體在完全培養(yǎng)基（CM）和稻稈培養(yǎng)基（SDC）上生長速率下降，且在應對脅迫劑H2O2時表現(xiàn)為更耐受，應對剛果紅時表現(xiàn)為更敏感。以上結(jié)果表明PoAPE3參與調(diào)控稻瘟病菌的營養(yǎng)生長和對外界環(huán)境脅迫的應答過程。

關(guān)鍵詞

稻瘟病菌;?氨肽酶Y;??基因敲除;?功能分析

中圖分類號：

S?43511141

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2023178

Functional?analysis?of?vacuolar?aminopeptidase?Y?gene?PoAPE3?in?Pyricularia?oryzae

YANG?Zifeng1，?HUANG?Linwan1，?WENG?Shuning1，?XU?Huxiao1，?WANG?Congmeng2，ZHAO?Aiyu3，?TANG?Wei1*

（1.?College?of?Plant?Protection，?Fujian?Agriculture?and?Forestry?University，?Fuzhou?350002，?China;

2.?Agricultural?and?Rural?Bureau?of?Yongchun?County，?Quanzhou?City，?Fujian?Province，

Quanzhou?362600，?China;?3.?Yongchun?Xingmao?Tea，?Fruit?and?Vegetable?Professional

Cooperative，?Quanzhou?City，?Fujian?Province，?Quanzhou?362600，?China）

Abstract

Aminopeptidases?belong?to?a?class?of?proteases?capable?of?selectively?cleaving?amino?acid?residues.?Acting?as?an?aminopeptidase，?vacuolar?aminopeptidase?Y?regulates?the?cleavage?of?basic?amino?acid?residues?and?influences?vacuolar?activity.?In?this?study，?the?homologous?gene?PoAPE3，?highly?consistent?with?vacuolar?aminopeptidase?Y?of?Saccharomyces?cerevisiae，?was?obtained?from?Pyricularia?oryzae.?Through?gene?knockout?techniques，?the?ΔPoAPE3?was?obtained，?and?a?complementary?strain?was?constructed?for?functional?analysis.?Phenotypic?determination?results?showed?that?the?ΔPoAPE3?exhibited?no?significant?differences?from?the?wildtype?strain?in?terms?of?spore?production，?spore?germination，?pathogenicity，?and?infection?process.?However，?ΔPoAPE3?displayed?slower?growth?on?CM?and?SDC?media，?increased?tolerance?to?H2O2，?and?heightened?sensitivity?to?Congo?Red.?These?results?indicate?that?PoAPE3?plays?a?role?in?vegetative?growth?and?the?response?to?external?environmental?stressors.

Key?words

Pyricularia?oryzae;?aminopeptidase?Y;?gene?knockout;?functional?analysis

稻瘟病菌Pyricularia?oryzae?引起的稻瘟病是水稻的重要病害之一，每年由于稻瘟病引起的水稻產(chǎn)量損失巨大［1］。除水稻外，稻瘟病菌還可以侵染大麥等多種重要經(jīng)濟作物［2］，同時稻瘟病菌簡便的遺傳操作體系，使其成為研究病原真菌較為理想的模式生物［3］。

液泡是由單層膜與其內(nèi)部的細胞液組成的細胞器，主要存在于植物細胞中。真菌中也存在液泡，并與植物中的液泡有著相似的功能。蛋白酶是水解蛋白質(zhì)肽鏈的一類酶的總稱，在液泡中主要存在有PEP4（與哺乳動物組織蛋白酶D相關(guān)的天冬酰胺內(nèi)肽酶）［4］和Prb1（絲氨酸內(nèi)肽酶）兩種蛋白酶［5］，液泡中的許多水解酶在其成熟過程中需要經(jīng)過這兩種酶的加工［6］。根據(jù)蛋白酶降解多肽的方式可以將蛋白酶分成內(nèi)肽酶和端肽酶，其中端肽酶又可分為羧肽酶和氨肽酶。氨肽酶是一類可以從蛋白質(zhì)和多肽的N端選擇性切除氨基酸殘基的蛋白酶，其廣泛存在于動植物體內(nèi)［7］。目前已知在液泡中有3種氨肽酶，分別為APE1（液泡氨肽酶Ⅰ）、APE4（天冬酰胺氨肽酶）和APE3（液泡氨肽酶Y）。APE1能在谷胱甘肽代謝中發(fā)揮作用［89］;APE4可能幫助自噬蛋白的轉(zhuǎn)運［1011］;APE3是一種特異性液泡蛋白酶，能特異性切割N末端的堿性氨基酸。目前已有研究表明，APE3在成熟過程中受到Prb1的調(diào)控，形成70?kD和75?kD兩種分子［12］。在酵母中過表達ScAPE3后液泡活性增強，且ScAPE3在30℃時形成包涵體從而不進入液泡［13］。

APE3基因編碼的液泡氨肽酶能對堿性末端的氨基酸進行剪切從而參與到液泡的活動中。為探究稻瘟病菌中APE3同源基因是否也有相似的功能，本研究對稻瘟病菌PoAPE3進行生物學功能分析，以期對PoAPE3在稻瘟病菌中的功能有更深入的了解，同時為其他病原真菌中氨肽酶的研究提供一定參考。

1?材料與方法

1.1?供試材料

稻瘟病菌野生型菌株Guy11、大腸桿菌Escherichia?coli菌株DH5α、載體pCX62，?pKNTmCherry均由本實驗保存。水稻品種為‘CO39，大麥品種為‘Golden?Promise。

1.2?PoAPE3蛋白序列的獲得

在酵母數(shù)據(jù)庫（https：∥www.yeastgenome.org/）中查找APE3并獲得釀酒酵母Saccharomyces?cerevisiae?ScAPE3的氨基酸序列，然后于NCBI網(wǎng)站（https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/）中使用Blastp搜索工具比對得到一個與ScAPE3高度同源的稻瘟病菌的氨基酸序列（MGG_09692），命名為PoAPE3。

1.3?PoAPE3敲除突變體的獲取

以野生型菌株Guy11?的DNA為模板，用引物PoAPE3F1/PoAPE3F2擴增PoAPE3基因上游1?167?bp?的DNA片段，用引物PoAPE3F3/PoAPE3F4擴增該基因下游918?bp的DNA片段，同時以質(zhì)粒pCX62為模板，用引物HYGF/HYGR擴增潮霉素基因全長。通過融合PCR將PoAPE3基因上游片段、潮霉素基因和PoAPE3基因下游片段融合成長度約為3?453?bp的片段，用引物NEXTF/NEXTR擴增融合片段，并轉(zhuǎn)化到稻瘟病菌野生型菌株Guy11的原生質(zhì)體中［14］，用潮霉素（600?μg/mL）對轉(zhuǎn)化子進行篩選，陽性轉(zhuǎn)化子用PoAPE3F1/KOR驗證PoAPE3基因是否被HYG基因替換;用PoAPE3F1/HYGR驗證潮霉素基因是否被轉(zhuǎn)入［15］。試驗所用引物（表1）均為自行設(shè)計，并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4?PoAPE3回補體菌株的獲取

以野生型菌株Guy11的DNA為模板，用PKNTF/PKNTR引物擴增包括PoAPE3基因及啟動子的片段，將其連接至pKNTmCherry載體上并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，構(gòu)建回補載體。用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方式將回補載體轉(zhuǎn)入突變體菌株中，用600?μg/mL?G418（遺傳霉素）對轉(zhuǎn)化子進行篩選。采用PoAPE3F1/KOR驗證PoAPE3基因是否回補，PoAPE3F1/HYGR驗證潮霉素基因是否還保留。試驗所用引物（表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.5?PoAPE3敲除突變體的表型分析

1.5.1?菌株生長狀況觀察及生長速率測定

從野生型、敲除突變體和回補體菌株菌落邊緣切取直徑2?mm的圓形菌塊，分別接種于完全培養(yǎng)基CM（complete?medium）、基本培養(yǎng)基MM（minimal?medium）、稻稈培養(yǎng)基SDC（rice?decoction?&?corn?medium）上［16］，28℃培養(yǎng)7?d后測量菌落直徑并拍照。

完全培養(yǎng)基（CM）：每升培養(yǎng)基中含有50?mL硝酸鹽，1?mL?微量元素，?1?mL維生素，10?g葡萄糖，1?g酸水解酪蛋白，1?g酵母提取物，固體培養(yǎng)基加入20?g瓊脂粉。

微量元素：?每100?mL?蒸餾水中含有22?g七水硫酸鋅，11?g硼酸，05?g四水氯化錳，05?g七水硫酸鐵，017?g六水氯化鈷，016?g五水硫酸銅，015?g五水鉬酸鈉，5?g乙二酸四乙酸二鈉。

維生素：每100?mL?蒸餾水中含有001?g生物素，001?g維生素B，001?g硫胺素，001?g?核黃素，001?g對氨基苯甲酸，001?g煙酸。

基本培養(yǎng)基（MM）：每升培養(yǎng)基中含有6?g硝酸鈉，052?g氯化鉀，0312?g七水硫酸鎂，152?g磷酸二氫鉀，001?g硫胺素，1?mL微量元素，10?g葡萄糖，固體培養(yǎng)基加入20?g瓊脂粉。

稻稈培養(yǎng)基（SDC）：每升培養(yǎng)基中含有25?g玉米粉，?100?g稻稈，20?g瓊脂粉。

1.5.2?產(chǎn)孢量與孢子萌發(fā)測定

在野生型、敲除突變體和回補體菌株菌落邊緣切取直徑2?mm的圓形菌塊接種于SDC培養(yǎng)基上，28℃黑暗條件下培養(yǎng)5?d后刮去菌絲，置于黑光燈下28℃誘導產(chǎn)孢3?d，測量菌落直徑。用2?mL無菌水洗平板，單層miracloth過濾，定容至2?mL，用血球計數(shù)板統(tǒng)計孢子數(shù)，計算單位面積的產(chǎn)孢量。產(chǎn)孢量=孢子液濃度×孢子液體積/菌落生長面積。取10?μL孢子液滴于疏水蓋玻片上，放置于保濕盒內(nèi)28℃條件下培養(yǎng)，于0、2、4、8、12?h觀察孢子形態(tài)并拍照，統(tǒng)計孢子萌發(fā)率及附著胞形成率，以50個孢子為1組，統(tǒng)計5組。孢子萌發(fā)率=已萌發(fā)孢子數(shù)/總孢子數(shù)×100%;附著胞形成率=形成附著胞結(jié)構(gòu)的孢子數(shù)/總孢子數(shù)×100%。

1.5.3?敲除突變體對大麥和水稻的致病情況分析與侵染觀察

調(diào)整野生型、敲除突變體和回補體菌株孢子懸浮液濃度為1×105個/mL，并加入2%明膠（50?μL/mL），采用點滴法對出苗后7?d的大麥葉片進行離體接種，在葉片正面點3滴（20?μL/滴），每處理3個重復，將接種的大麥葉片放置在28℃黑暗保濕1?d后轉(zhuǎn)移至28℃，L∥D=12?h∥12?h的培養(yǎng)箱中繼續(xù)保濕培養(yǎng)6?d，培養(yǎng)完成后觀察大麥葉片上病斑擴展直徑分析致病情況;同時，選用2～3周齡的水稻，利用噴壺將孢子懸浮液均勻噴灑于活體水稻葉片上，28℃黑暗，相對濕度為80%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24?h后放置于28℃恒溫，L∥D=12?h∥12?h的接種室，7?d后觀察水稻發(fā)病情況并拍照和進行病斑分級統(tǒng)計［17］。

孢子懸浮液中加入2%明膠（50?μL/mL）備用。剪取生長7?d的大麥葉片，在葉片背面沿著葉脈兩側(cè)采用點滴法（2?μL/滴）接種孢子懸浮液，在28℃黑暗條件下保濕培養(yǎng)12、24、40?h及48?h后撕取大麥葉背表皮，于光學顯微鏡下觀察侵染情況并拍照。

1.5.4?外界環(huán)境脅迫對菌株的生長抑制測定

在野生型、敲除突變體和回補體菌株菌落邊緣切取直徑2?mm的圓形菌塊接種于含有3?mmol/L?過氧化氫（H2O2）、2?mmol/L?二硫蘇糖醇（DTT）、02?g/L?剛果紅（CR）以及未添加脅迫劑的CM培養(yǎng)基中，28℃黑暗培養(yǎng)7?d后測量菌落直徑并拍照，計算生長抑制率。生長抑制率=（CM培養(yǎng)基上菌落直徑－脅迫處理下菌落直徑）/CM培養(yǎng)基上菌落生長直徑×100%。

1.6?實時熒光定量PCR檢測PoAPE3基因的表達情況

在野生型菌株菌落邊緣切取直徑為2?mm的菌塊于添加了3?mmol/L?過氧化氫（H2O2）、02?g/L?剛果紅（CR）以及未添加脅迫劑的50?mL?CM培養(yǎng)液中，28℃，150?r/min培養(yǎng)2?d，使用總RNA提取試劑盒（Promega）提取不同處理的菌株總RNA。使用SYBR試劑盒（諾唯贊）并用特異性引物APE3QRTF/APE3QRTR（表1）進行定量PCR。以肌動蛋白基因作為內(nèi)源性內(nèi)參基因?；蛳鄬Ρ磉_水平通過2-ΔΔCt方法進行評估［18］，每個樣本的所有試驗均獨立重復3次。

1.7?數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

孢子萌發(fā)率、附著胞形成率、生長抑制率和基因相對表達量在Excel?2019中運算，運用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行統(tǒng)計分析，采用Duncan氏新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2?結(jié)果與分析

2.1?基因敲除與回補體菌株的獲得

為探究PoAPE3在稻瘟病菌中的功能，通過擴增PoAPE3的上、下游片段，與潮霉素基因連接，采用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方式進行基因敲除（圖1a），獲得具有潮霉素抗性的轉(zhuǎn)化子。以清水為空白對照，野生型Guy11基因組DNA為陽性對照，通過上臂引物PoAPE3F1和基因內(nèi)部引物KOR進行PCR驗證，共獲得兩個敲除突變體ΔPoAPE310和ΔPoAPE322（圖1b）。通過上臂引物PoAPE3F1和潮霉素內(nèi)部引物HYGR確定ΔPoAPE310和ΔPoAPE322均攜帶潮霉素基因（圖1c），隨機選用ΔPoAPE310進行后續(xù)試驗。獲得的回補體菌株命名為ΔPoAPE3C，并以相同的方式驗證確定回補體菌株攜帶PoAPE3基因和潮霉素基因。

2.2?敲除突變體ΔPoAPE3的表型分析

2.2.1?ΔPoAPE3的營養(yǎng)生長情況

為探究PoAPE3對稻瘟病菌生長的影響，將野生型菌株Guy11、突變體菌株ΔPoAPE310、回補體菌株ΔPoAPE3C接種于CM、MM、SDC平板上，結(jié)果表明，ΔPoAPE310在MM平板上生長速率與Guy11無顯著差異（圖2a），而在CM、SDC平板上的生長速率有所下降，分別比野生型下降了213%和215%（圖2b），說明PoAPE3參與了稻瘟病菌的營養(yǎng)生長。

2.2.2?ΔPoAPE3對孢子萌發(fā)、附著胞形成和產(chǎn)孢量的影響

為明確PoAPE3是否參與稻瘟病菌附著胞發(fā)育過程，收集野生型菌株Guy11、突變體菌株ΔPoAPE310及回補體菌株ΔPoAPE3C的分生孢子，調(diào)好孢子液濃度后滴于疏水蓋玻片上，置于盒中保濕培養(yǎng)。結(jié)果表明，野生型與突變體的孢子形態(tài)和產(chǎn)孢量均沒有顯著差異，產(chǎn)孢量均約為4×104個/cm2（F2，2=1104，P=0951）（圖3a，?3b）;在2?h時，突變體萌發(fā)率約為90%?（F2，2=2192，?P=0087），4?h時孢子均已萌發(fā)，至8?h時附著胞的形成率約為93%（F2，2=5548，?P=0305），均與野生型菌株沒有明顯差異（圖3c，?3d），說明PoAPE3不參與調(diào)控稻瘟病菌的分生孢子產(chǎn)生以及附著胞的形成過程。

2.2.3?ΔPoAPE3的致病性分析

配制濃度為1×105個/mL的野生型菌株Guy11、敲除突變體ΔPoAPE3以及回補體菌株ΔPoAPE3C的孢子懸浮液，點滴法接種于離體大麥葉片正面，噴霧法接種于2周齡水稻苗上。結(jié)果表明，野生型菌株和ΔPoAPE3接種大麥后，大麥葉片上均產(chǎn)生約15?cm寬病斑，接種水稻后病斑形態(tài)也沒有明顯差異，均可觀察到典型病斑（圖4a，4b）。對侵染水稻后的病斑分級統(tǒng)計結(jié)果也表明，野生型菌株與突變體菌株導致的各級病斑數(shù)目無顯著差異（F4，4=1300，?P=0806）（圖4c），說明PoAPE3不參與調(diào)控稻瘟病菌的致病過程。

2.2.4?ΔPoAPE3對稻瘟菌侵染過程的影響

在大麥葉片背面接種孢子懸浮液后于28℃保濕培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)12、24、40?h和48?h時撕取大麥葉背表皮觀察侵染情況。結(jié)果表明，ΔPoAPE3與野生型菌株Guy11的孢子在培養(yǎng)12?h時均可以正常形成侵染結(jié)構(gòu)，并在24?h時可以正常侵入，且在40?h和48?h時能穿透鄰近細胞（圖5），說明PoAPE3不影響稻瘟病菌的侵染過程。

2.2.5?ΔPoAPE3對脅迫因子的敏感性分析

為探究PoAPE3應對不同脅迫因子的能力，本研究將野生型菌株Guy11、敲除突變體ΔPoAPE3和回補體菌株ΔPoAPE3C分別接種于含有不同脅迫劑（氧化壓力脅迫劑H2O2、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力脅迫劑DTT、細胞壁脅迫劑CR）的CM培養(yǎng)基中。結(jié)果表明，突變體菌株在含有H2O2的平板上生長直徑大于野生型，表現(xiàn)出更耐受，而在含有CR的平板上生長直徑小于野生型，表現(xiàn)為更敏感（圖6a）。統(tǒng)計分析表明，H2O2對突變體菌株的抑制率較野生型菌株下降5%;CR對突變體菌株的抑制率顯著高于野生型和回補體菌株（P<001）（圖6b），說明敲除PoAPE3基因可以影響脅迫因子對菌株生長的抑制作用。由于ΔPoAPE3在脅迫處理下的生長抑制率與Guy11和ΔPoAPE3C有顯著差異，我們推測PoAPE3基因的表達可能受到脅迫因子的誘導，因此通過實時熒光定量PCR檢測野生型菌株的PoAPE3基因在不同脅迫處理下的表達情況，結(jié)果表明，在脅迫處理下，PoAPE3基因的表達水平均顯著上升（P<001）（圖6c），說明PoAPE3基因受環(huán)境脅迫因子的誘導參與調(diào)控應對氧化壓力和細胞壁脅迫的應答。

3?結(jié)論與討論

氨肽酶作為一種蛋白酶廣泛存在于不同的動植物體內(nèi)，是生物體內(nèi)重要的切割氨基酸殘基的蛋白酶［7］。目前液泡氨肽酶Y在絲狀真菌中的報道較少，僅在酵母中有報道［1920］。在酵母中，氨肽酶APE3的成熟受到Prb1蛋白酶的調(diào)控［12］，有研究表明，稻瘟病菌中Prb1的同源蛋白PoSPM1參與調(diào)控稻瘟病菌的致病性［21］，而PoSPM1在稻瘟病菌中如何調(diào)控PoAPE3尚不明確。本研究從稻瘟病菌中鑒定到一個與釀酒酵母液泡氨肽酶Y同源的基因PoAPE3，并研究了其在稻瘟病菌中的生物學功能。

通過對PoAPE3在稻瘟病菌中的生物學表型分析發(fā)現(xiàn)，由于突變體在MM培養(yǎng)基中并沒有生長缺陷且MM培養(yǎng)基主要由無機物組成，說明PoAPE3不參與稻瘟病菌利用無機物進行營養(yǎng)生長的過程。而ΔPoAPE3在CM和SDC培養(yǎng)基上的生長速率減慢，分別減少213%和215%。相比于MM培養(yǎng)基，CM或SDC培養(yǎng)基增加了有機物或植物元素，表明PoAPE3參與稻瘟病菌對部分營養(yǎng)物質(zhì)的吸收過程。此外，與野生型菌株相比突變體菌株對細胞壁脅迫劑以及氧化壓力脅迫劑的敏感性發(fā)生了改變，說明PoAPE3可能在脅迫處理下加速對氨基酸的切割，但是加速處理的過程會損害液泡功能使稻瘟病菌對氧化壓力的耐受性降低，同時產(chǎn)生的氨基酸可以用于穩(wěn)定細胞壁從而增加對細胞壁脅迫的耐受性。根據(jù)脅迫試驗結(jié)果推測，PoAPE3基因缺失后，稻瘟病菌的細胞壁組分或結(jié)構(gòu)可能發(fā)生了改變，細胞的新陳代謝可能發(fā)生了變化，且這些變化或許使細胞壁的滲透能力和對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力受到影響，從而影響了稻瘟病菌的營養(yǎng)生長，進而導致突變體的生長速率減慢。但是致病性以及侵染試驗中突變體與野生型菌株相比并沒有明顯的變化，這說明缺失突變體在細胞壁組分以及細胞新陳代謝中的改變較為輕微，不足以影響稻瘟病菌的致病能力。與酵母ScAPE3功能進行比較，稻瘟病菌中PoAPE3降低菌株營養(yǎng)生長的速率，對細胞壁脅迫劑更敏感方面與其表現(xiàn)較為一致，但是稻瘟病菌PoAPE3在應對氧化壓力脅迫時耐受性更好，說明PoAPE3與ScAPE3的功能存在一定的差異，?推測稻瘟病菌可能存在與酵母不同的通過PoAPE3基因所介導的營養(yǎng)物質(zhì)的利用的機制。

綜上所述，PoAPE3不參與調(diào)控稻瘟病菌的附著胞形成及致病過程，但其調(diào)控稻瘟病菌的營養(yǎng)生長過程和外界環(huán)境應答過程。對于PoAPE3如何影響稻瘟病菌對營養(yǎng)物質(zhì)的利用的機制還有待進一步研究。

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（責任編輯：楊明麗）