曲薇　王玉紅　姜秀煜　魏婷婷　賈鵬博

摘要：? 以樺樹汁為原料，篩選出適合樺樹汁醋醋酸發(fā)酵的菌種；在此基礎(chǔ)上，通過單因素和響應(yīng)面試驗優(yōu)化樺樹汁醋發(fā)酵工藝。結(jié)果表明：最適用于樺樹汁醋酸發(fā)酵的商業(yè)菌種為滬釀1.01號醋酸菌；最佳發(fā)酵工藝為：初始酒精度7%、醋酸菌接種量11%、發(fā)酵溫度28 ℃，此條件下釀造的樺樹汁醋呈微黃色，透明澄清，入口清爽，具有果醋的酸味和樺樹汁的清香，風(fēng)格獨特，以期為樺樹汁醋工業(yè)化開發(fā)以及樺樹汁的綜合利用提供一定的理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：? 樺樹汁；? 樺樹液醋；? 菌種篩選；? 發(fā)酵工藝；? 響應(yīng)面法

中圖分類號：? ?TS 202. 1? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：? ?A? ? ? ? ? ? ? ? 文章編號：１００1 － 9499（２０24）03 － 0041 － 06

Optimization of Acetic Acid Fermentation Process of Birch

Juice by Response Surface Methodology

QU Wei WANG Yuhong JIANG Xiuyu WEI Tingting JIA Pengbo**

（Jiamusi Branch of Heilongjiang Academy of Forestry Sciences，? Heilongjiang Jiamusi 154000）

Abstract Using birch juice as raw material， the strains suitable for acetic acid fermentation of birch juice were screened. On this basis， the fermentation process of birch juice vinegar was optimized by single factor and response surface tests. The results showed that the most suitable commercial strain for acetic acid fermentation of birch juice was acetic acid bacterium HuNiang 1.01. The optimum fermentation process was as follows： the initial alcohol content was 7%， the inoculation amount of acetic acid bacteria was 11%， and the fermentation temperature was 28 ℃. Under these conditions， the brewing birch juice vinegar was slightly yellow， transparent and clear， and the mouth was fresh. It had the sour taste of fruit vinegar and the fragrance of birch juice， and the style was unique， in order to provide a certain theoretical basis for the industrial development of birch juice vinegar and the comprehensive utilization of birch juice.

Key words Birch juice; birch vinegar; strain screening; fermentation process; response surface methodology

樺樹（Betula platyphylla）是樺木科落葉喬木，具有較強的適應(yīng)性和抗寒性[ 1 ]，主要分布在我國的東北、西北以及西南山地區(qū)域[ 2 ]。將樺樹樹皮劃開或在樹身鉆孔，會流出無色或淡黃色透明液體，帶獨特木質(zhì)清香[ 3 ， 4 ]。樺樹汁含有天然蛋白質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)，但不同生長環(huán)境會對樺樹汁中的營養(yǎng)成分、理化性質(zhì)產(chǎn)生影響[ 5 ]。樺樹汁中蘊含著人體所需的各種氨基酸[ 6 ]、礦物質(zhì)、脂肪酸等常見營養(yǎng)成分，此外，還含有過氧化物酶、過氧化氫酶、樺芽酸、細(xì)胞分裂素、香精油和皂角甙化合物等活性成分[ 7 ]。

樺樹汁具有祛痰止咳、促進(jìn)人體新陳代謝、抗疲勞、增強機體免疫力等作用[ 8 ]。常見的樺樹汁飲品主要以復(fù)合果汁飲料和果酒的形式[ 9 - 11 ]。目前，關(guān)于樺樹汁醋的發(fā)酵產(chǎn)品鮮有報道[ 12 ]，而對樺樹汁醋發(fā)酵工藝的系統(tǒng)研究更少。本研究以樺樹液為主要原料，通過液態(tài)發(fā)酵工藝制備樺樹汁醋。通過試驗篩選適用于樺樹汁醋醋酸發(fā)酵的商業(yè)菌種，并采用單因素和響應(yīng)面試驗優(yōu)化樺樹汁醋的發(fā)酵工藝，旨在為樺樹汁醋工業(yè)化開發(fā)以及樺樹汁的綜合利用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 材料與試劑

樺樹液：采自伊春市帶嶺區(qū)東方紅林場；白砂糖：天津市鼎盛鑫化工有限公司；殼聚糖（食品級）：廣州天佳生物科技有限公司；澳大利亞DVI0釀酒酵母：上海杰兔工貿(mào)有限公司；許氏醋酸菌：上海保藏生物科技中心；巴氏醋酸菌：中科院微生物研究所；滬釀1.01號醋酸菌：上海工業(yè)微生物研究所；檸檬酸（分析純）：長春健鷹食品添加劑公司；氫氧化鈉（分析純）哈爾濱新春化工產(chǎn)品有限公司；偏重亞硫酸鉀（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1. 2 儀器與設(shè)備

ESJ182-4型電子天平：上海拓西電子科技有限公司；PHS-3C型精密pH計：杭州雷磁分析儀器廠；HJ-6磁力攪拌器：天津市濱海新區(qū)大港紅杉實驗設(shè)備廠；HWS-70B恒溫恒濕箱：青島明博環(huán)?？萍加邢薰?；721紫外可見分光光度計：上海力辰儀器科技有限公司；YXQ-LS-50SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博迅實業(yè)有限公司。

1. 3 試驗方法

1. 3. 1 樺樹汁醋的加工工藝流程

樺樹汁醋的加工工藝流程如圖1所示。

（1）采集樺樹汁

在樺樹葉還未長出前，樺樹汁開始流動時對樺樹汁進(jìn)行采集，并對采集的樺樹汁進(jìn)行密封后冷凍貯存。

（2）調(diào)節(jié)糖度、酸度

使用白砂糖將樺樹汁的糖度調(diào)整為20%，使用檸檬酸將pH值調(diào)整為5.5。

（3）酒精發(fā)酵

在釀酒酵母中加入10倍質(zhì)量的5%蔗糖溶液后，將其放置在32 ℃下活化20 min，得到酵母菌種子液。將酵母菌種子液接種到樺樹汁中（接種量為0.3%），攪拌均勻后，置于溫度為26 ℃，轉(zhuǎn)速為130 r/min的條件下進(jìn)行酒精發(fā)酵7 d。隨后對樺樹汁酒進(jìn)行85 ℃滅菌處理15 min，冷卻至室溫后，待用。

（4）醋酸發(fā)酵

參照何宇寧[ 13 ]的方法將醋酸菌進(jìn)行活化與培養(yǎng)，再將醋酸菌接種于樺樹汁酒中，在溫度為31 ℃，轉(zhuǎn)速為130 r/min的條件下進(jìn)行醋酸發(fā)酵，待醋酸含量不再增加時終止。

（5）澄清、過濾

參照王瑞璇的方法對樺樹汁醋進(jìn)行澄清處理[ 14 ]。

（6）殺菌、灌裝

將澄清后的樺樹汁醋置于80 ℃水浴下滅菌20 min后，無菌裝瓶，即得樺樹汁醋成品。

1. 3. 2 醋酸菌的篩選

將培養(yǎng)好的許氏醋酸菌、滬釀1.01號醋酸菌和巴氏醋酸菌分別作為1號、2號和3號醋酸菌種子液，并以11%的添加量加入到樺樹汁中，在28 ℃下進(jìn)行醋酸發(fā)酵，以樺樹汁醋的總酸含量作為醋酸發(fā)酵狀況的指標(biāo)，選出發(fā)酵性能好，樺樹汁醋口感佳的醋酸菌。

1. 3. 3 醋酸發(fā)酵的單因素實驗

通過酒精發(fā)酵制得樺樹汁酒，再對樺樹汁酒進(jìn)行醋酸發(fā)酵制得樺樹汁醋。在實驗過程中分別將初始酒精度、發(fā)酵溫度和醋酸菌的接種量作為自變量，用酸度作為評價指標(biāo)，探究不同的初始酒精度（5%、6%、7%、8%、9%）、發(fā)酵溫度（24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃）和醋酸菌接種量（5%、7%、9%、11%、13%）對樺樹汁醋的影響。

1. 3. 4 醋酸發(fā)酵的工藝優(yōu)化

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以初始酒精度（A）、發(fā)酵溫度（B）和醋酸菌接種量（C）作為自變量，總酸作為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗，相應(yīng)水平設(shè)計見表1。

1. 3. 5 總酸含量測定

樺樹汁發(fā)酵液酸度的測定參考國標(biāo)GB/T5009.

239-2016《食品酸度的測定》酸堿滴定法。

1. 3. 6 感官評價

選擇食品專業(yè)10名感官品評人員對樺樹汁醋進(jìn)行感官評價，并按照表2樺樹汁醋的感官評分細(xì)則給予相應(yīng)的分?jǐn)?shù)。

1. 3. 7 微生物微指標(biāo)測定

菌落總數(shù)、大腸菌群及沙門氏菌的測定分別參照GB 4789.2-2022、GB 4789.3-2016和GB 4789.4-2016項下方法及標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與分析

2. 1 醋酸菌的篩選

2. 1. 1 不同醋酸菌菌種對樺樹汁發(fā)酵液產(chǎn)酸量的影響

從圖2可以看出，隨著發(fā)酵時間的增加，發(fā)酵液中酸度呈現(xiàn)先增高后平緩的現(xiàn)象。其中添加2號醋酸菌種子液的發(fā)酵液總酸含量最高達(dá)到5.30 g/? 100 mL，并且發(fā)酵用時為8 d，最短；添加3號醋酸菌種子液的發(fā)酵液總酸含量最低為3.91 g/100mL，發(fā)酵用時為10 d。

2. 1. 2 不同醋酸菌菌種對樺樹汁發(fā)酵醋感官品質(zhì)的影響

由圖3可知，選用2號醋酸菌種子液發(fā)酵的樺樹汁醋整體可接受度最高，選用3號醋酸菌種子液發(fā)酵的樺樹汁醋整體可接受度最低。色澤方面，選用2號醋酸菌種子液和1號醋酸菌種子液發(fā)酵的樺樹汁醋評分相同，色澤差別較小，均呈現(xiàn)微黃色，光澤度較高，選用3號醋酸菌種子液發(fā)酵的樺樹汁醋光澤度較差；香氣方面，選用2號醋酸菌種子液發(fā)酵的樺樹汁醋香氣純正，具有果醋的酸味和樺樹汁的清香，評分最高，1號醋酸菌種子液發(fā)酵的樺樹汁醋香氣較淡，3號醋酸菌種子液發(fā)酵的樺樹汁醋香氣最次；口感方面，選用2號醋酸菌種子液發(fā)酵的樺樹汁醋入口清爽、口味協(xié)調(diào)，1號醋酸菌種子液發(fā)酵的樺樹汁醋入口較清爽、口味有待協(xié)調(diào)，3號醋酸菌種子液發(fā)酵的樺樹汁醋入口無清爽感、口味差；澄清度方面，選用2號醋酸菌種子液和1號醋酸菌種子液發(fā)酵的樺樹汁醋澄清透明，無肉眼可見的雜質(zhì)，選用3號醋酸菌種子液發(fā)酵的樺樹汁醋有少許沉淀物。

2. 2 樺樹汁醋醋酸發(fā)酵單因素試驗結(jié)果

2. 2. 1 發(fā)酵溫度對樺樹汁醋酸度的影響

將初始酒精含量為7%的樺樹汁酒接種醋酸菌（接種量為11%）后分別在24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃下進(jìn)行醋酸發(fā)酵。從圖4可以看出，發(fā)酵溫度32 ℃發(fā)酵液中總酸最少，這主要歸因于發(fā)酵溫度過高時，醋酸菌的生長代謝過旺，以及高溫對產(chǎn)物累積不利等因素所致[ 15 ]；發(fā)酵溫度28 ℃時樺樹汁醋發(fā)酵液中的總酸含量達(dá)到最大值；當(dāng)溫度低于28 ℃時，會使總酸含量較低，其原因可能是溫度偏低導(dǎo)致醋酸菌的活躍性會有所下降。因此，樺樹汁醋的最適發(fā)酵溫度為28 ℃。

2. 2. 2 醋酸菌接種量對樺樹汁醋酸度的影響

將初始酒精含量為7%的樺樹汁酒分別接種5%、7%、9%、11%、13%的醋酸菌后，在28 ℃下進(jìn)行醋酸發(fā)酵。從圖5可以看出，發(fā)酵液內(nèi)總酸含量隨接種醋酸菌數(shù)量增多呈先升后降變化趨勢，這是因為醋酸菌的產(chǎn)酸速度隨著醋酸菌數(shù)量的增多而加快。醋酸菌接種量為11%時，發(fā)酵液內(nèi)總酸含量達(dá)到最大值5.79 g/100 mL；醋酸菌接種量大于11%后發(fā)酵液總酸含量下降，這可能是因為醋酸菌接種量過大，菌體增長繁殖耗費了樺樹汁發(fā)酵液內(nèi)大部分營養(yǎng)，使得醋酸發(fā)酵相關(guān)的底物含量降低，不利于醋酸發(fā)酵；也可能是菌體快速消耗營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生大量的代謝物質(zhì)，使得醋酸菌提前衰老、自溶，從而降低了發(fā)酵液的總酸含量[ 16 ]。因此，樺樹汁醋的最適醋酸菌接種量為11%。

2. 2. 3 初始酒精度對樺樹汁醋酸度的影響

將初始酒精含量為5%、6%、7%、8%、9%的樺樹汁酒分別接種醋酸菌（接種量為11%）后在28 ℃下進(jìn)行醋酸發(fā)酵。從圖6可以看出，隨著初始酒精度數(shù)的升高，發(fā)酵液內(nèi)總酸含量也逐漸升高。當(dāng)初始酒精含量為7%時，樺樹汁發(fā)酵液內(nèi)總酸含量最高達(dá)到5.81 g/100 ml；當(dāng)初始酒精含量高于7%時，發(fā)酵液內(nèi)總酸含量出現(xiàn)下降的趨勢，這可能是因為發(fā)酵初始階段，高濃度的酒精使醋酸菌的成長、代謝受到限制，從而導(dǎo)致發(fā)酵液內(nèi)總酸含量降低[ 17 ]。因此，樺樹汁醋的最適初始酒精含量為7%。

2. 3 樺樹汁醋醋酸發(fā)酵響應(yīng)面試驗結(jié)果

利用Design-Expert 13.0 軟件對表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到總酸與各因素的二次多項回歸方程模型為：

總酸（g/100 mL）=5.80-0.055A+0.03B-0.1025C+0.005AB-0.055AC-0.105BC-0.6283A2-0.2733B2-0.3583C2。

由表4和圖7可知，該模型F值為25.78，P值=0.001 1＜0.01，表明該模型因子具有顯著性意義。模型的方程相關(guān)系數(shù)R2=0.978 9，校正系數(shù)R2Adj= 0.940 9，表明該模型的擬合度和可信度較好，可以對樺樹汁醋醋酸發(fā)酵工藝進(jìn)行預(yù)測和分析。各因素對總酸含量的影響依次為：發(fā)酵溫度（B）<初始酒精度（A）<醋酸菌接種量（C）。通過軟件Design-Expert 13.0分析，在初始酒精度為6.963%vol，發(fā)酵溫度為28.167 ℃，醋酸菌接種量為10.694%時，醋酸發(fā)酵工藝最佳，此時樺樹汁醋總酸含量理論值為5.807 g/100 mL。為了便于實際操作，對樺樹汁醋最佳工藝參數(shù)進(jìn)行修正，即初始酒精度為7%vol，發(fā)酵溫度為28 ℃，醋酸菌接種量為11%。平行3次試驗，樺樹汁醋酸度實際值為（5.81±0.01）g/100 mL，與模型的理論預(yù)測值接近。因此，該模型可行。

2. 4 優(yōu)化醋酸發(fā)酵工藝前、后樺樹汁醋的感官評價

由圖8可知，優(yōu)化醋酸發(fā)酵工藝后樺樹汁醋的香氣、口感和整體可接受度大幅度提升。優(yōu)化醋酸發(fā)酵工藝制得的樺樹汁醋醋樣為清亮透明的微黃色，無肉眼可見的雜質(zhì)，香味協(xié)調(diào)，具有果醋的酸味和樺樹汁的清香，入口清爽，整體可接受度高。

2. 5 樺樹汁醋微生物指標(biāo)檢測結(jié)果

樺樹汁醋的菌落總數(shù)為28 cfu/mL，未檢出大腸菌群、致病菌，符合國標(biāo)中微生物限量標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié) 論

本試驗篩選出適用于樺樹汁醋醋酸發(fā)酵的商業(yè)菌種為滬釀1.01號醋酸菌。根據(jù)單因素試驗和響應(yīng)面試驗得到的最佳發(fā)酵工藝條件為：發(fā)酵溫度為28 ℃，醋酸菌接種量為11%，初始酒精度為7%。在此條件下制得的樺樹汁醋酸度為5.81 g/100 mL，醋樣呈現(xiàn)清亮透明的微黃色，無肉眼可見的雜質(zhì)，香味協(xié)調(diào)，具有果醋的酸味和樺樹汁的清香，入口清爽，整體可接受度高，且其微生物指標(biāo)符合國家標(biāo)準(zhǔn)。

參考文獻(xiàn)

［1］ 蔣中海.? 黑龍江樺樹汁的研究［J］.? 食品工業(yè)科技， 2002（10）：62 - 63.

［2］ 李娜，? 常洪娟，? 譚毅，? 等.? 樺樹汁發(fā)酵酒的研制［J］.? 釀酒，2008（3）： 101 - 102.

［3］ 譚淇丹，? 燕欣，? 胡鐘月，? 等.? 樺樹汁發(fā)酵前后成分分析及護(hù)膚功效評價［J］. 中國化妝品， 2022（11）： 118 - 123.

［4］ 裴蕾.? 樺樹汁發(fā)酵醋飲料加工工藝研究［D］. 長春： 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2016.

［5］ 盛艷，? 吳澤柱.? 樺樹汁營養(yǎng)成分及功能利用研究進(jìn)展［J］. 農(nóng)產(chǎn)品加工， 2017（14）： 49 - 52.

［6］ 王永奇，? 李延忠，? 張育新，? 等.? 樺樹汁中的微量元素和氨基酸［J］. 中國林副特產(chǎn)， 1988（2）： 32.

［7］ KALLIO H. Aroma of birch syrup［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 1989， 37（5）： 1367 - 1371.

［8］ 趙華文，? 覃軍.? 樺樹液應(yīng)用現(xiàn)狀與開發(fā)方向［J］. 中國林副特產(chǎn)， 2001（2）： 38 - 40.

［9］ 曲迪.? 響應(yīng)面法優(yōu)化樺樹液酒發(fā)酵工藝［J］. 食品研究與開發(fā)， 2016， 37（23）： 124 - 128.

［10］ 范廣菊.? 樺樹汁椰子水復(fù)合果汁飲料的研制［J］. 食品工業(yè)，2023， 44（4）： 46 - 50.

［11］ 宋來新.? 樺樹液啤酒［J］. 釀酒科技， 1995（2）： 44 - 45.

［12］ 賈鵬博，? 周建宇，? 姜秀煜，? 等.? 樺樹液醋醋酸發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化［J］. 中國林副特產(chǎn)， 2019（6）： 31 - 33.

［13］ 何宇寧.? 菠蘿蜜果醋發(fā)酵醋酸菌選育與發(fā)酵工藝研究［D］.湛江： 廣東海洋大學(xué)， 2021.

［14］ 王瑞璇，? 張莉，? 周霞，? 等.? 響應(yīng)面法優(yōu)化芋頭蓮藕復(fù)合醋釀造工藝的研究［J］. 中國調(diào)味品， 2021， 46（5）： 93 - 97 + 106.

［15］ 齊海麗，? 呂云皓，? 楊雙銘，? 等.? 黑枸杞果醋發(fā)酵工藝條件優(yōu)化［J］. 中國釀造， 2021， 40（12）： 204 - 210.

［16］ 楊麗萍，? 單春會，? 唐鳳仙.? 響應(yīng)面法優(yōu)化紅提果醋的發(fā)酵條件［J］. 中國調(diào)味品， 2019， 44（3）： 36 - 41.

［17］ 王瑞璇，? 張莉，? 周霞，? 等.? 響應(yīng)面法優(yōu)化芋頭蓮藕復(fù)合醋釀造工藝的研究［J］. 中國調(diào)味品， 2021， 46（5）： 93 - 97.