邵云飛 張今 王瑩瑩 江連強 劉蘇 仇騰騰 范子明 李茂業(yè)

摘要

小地老虎Agrotis?ipsilon是一種重要的農(nóng)業(yè)害蟲。小分子熱激蛋白（sHSP）是細胞抵御外界脅迫的關(guān)鍵蛋白，本文旨在探索sHSP基因在小地老虎不同發(fā)育階段以及在高溫和殺蟲劑脅迫下的響應模式。使用同源檢索方法從小地老虎轉(zhuǎn)錄組中鑒定到了一個sHSP

基因的cDNA序列，命名為AiHSP19.3。通過RTPCR技術(shù)克隆該序列，利用實時熒光定量PCR技術(shù)分析AiHSP19.3基因在小地老虎不同發(fā)育階段和不同組織中的轉(zhuǎn)錄模式，并分析了該基因在高溫和殺蟲劑脅迫下的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明，小地老虎AiHSP19.3基因的開放閱讀框為516?bp，編碼含171個氨基酸，分子量為19.3?kD的蛋白，具有sHSP典型的α晶狀體結(jié)構(gòu)域（ACD）。在供試小地老虎的不同發(fā)育階段和3齡幼蟲組織中均能檢測到AiHSP19.3的轉(zhuǎn)錄，其中在6齡幼蟲和3齡幼蟲脂肪體內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平最高。小地老虎幼蟲經(jīng)高溫和3種殺蟲劑（高效氯氟氰菊酯、氯蟲苯甲酰胺及辛硫磷）處理后AiHSP19.3的轉(zhuǎn)錄水平顯著提高，表明該基因可能在響應高溫及殺蟲劑脅迫中起到重要作用。

關(guān)鍵詞

小地老虎;?小分子熱激蛋白;?高溫;?殺蟲劑;?轉(zhuǎn)錄模式

中圖分類號：

S?433.82

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2023261

Identification?of?the?AiHSP19.3?gene?and?its?response?to?high?temperature?and?insecticide?stress?in?Agrotis?ipsilon

SHAO?Yunfei1#，?ZHANG?Jin1#，?WANG?Yingying1，?JIANG?Lianqiang2*，?LIU?Su1，QIU?Tengteng1，?FAN?Ziming3，?LI?Maoye1*

（1.?Key?Laboratory?of?Biology?and?Sustainable?Management?of?Plant?Diseases?and?Pests，?Anhui?Higher?Education?Institutes;

College?of?Plant?Protection，?Anhui?Agricultural?University，?Hefei?230036，?China;?2.?Liangshan?Branch?of?Sichuan?Tobacco

Corporation，?Xichang?615000，?China;?3.?Sinochem?Modern?Agriculture?（Ningxia）?Co.，?Ltd.，?Yinchuan?750021，?China）

Abstract

The?black?cutworm，?Agrotis?ipsilon，?is?an?important?agricultural?pest?insect.?Small?heat?shock?proteins?（sHSPs）?are?crucial?for?cellular?defense?against?external?stresses.?This?study?aims?to?explore?the?response?patterns?of?sHSP?gene?in?different?developmental?stages?of?A.ipsilon?and?under?high?temperature?and?insecticide?stresses.?A?cDNA?sequence?of?sHSP，?AiHSP19.3，?was?identified?from?the?A.ipsilon?transcriptome?using?homology?search?and?subsequently?cloned?by?RTPCR.?The?transcriptional?pattern?of?the?AiHSP19.3?gene?in?different?developmental?stages?and?tissues?of?A.ipsilon?was?analyzed?using?realtime?quantitative?PCR，?along?with?transcript?levels?under?high?temperature?and?insecticide?stresses.?The?results?showed?that?the?open?reading?frame?of?AiHSP19.3?was?516?bp，?encoding?a?protein?consisting?of?171?amino?acids?with?a?molecular?weight?of?19.3?kD.?AiHSP19.3?contained?an?αcrystallin?domain?（ACD），?a?hallmark?feature?of?sHSP.?Transcription?of?AiHSP19.3?was?detected?in?all?tested?developmental?stages?and?3rdinstar?larval?tissues，?with?the?highest?level?observed?in?the?6thinstar?larvae?and?fat?body?of?3rdinstar?larvae.?Transcription?levels?of?AiHSP19.3?significantly?increased?in?larvae?after?treatment?with?high?temperature?and?three?insecticides?（lambdacyhalothrin，?chlorantraniliprole，?and?phoxim），?indicating?that?this?gene?may?play?an?important?role?in?responding?to?high?temperature?and?insecticide?stresses.

Key?words

Agrotis?ipsilon;?small?heat?shock?protein;?high?temperature;?insecticides;?transcriptional?pattern

熱激蛋白（heat?shock?protein，HSP）也稱為熱休克蛋白，是一類普遍存在于生物體內(nèi)的分子伴侶［1］。根據(jù)分子量大小、氨基酸序列和功能，HSP可分為HSP90、HSP70、HSP60和小分子熱激蛋白（small?heat?shock?protein，?sHSP）等不同家族［2］。sHSP于1974年從黑腹果蠅Drosophila?melanogaster中發(fā)現(xiàn)，分子量介于12～42?kD，結(jié)構(gòu)較為保守，都含有N末端區(qū)域、C末端區(qū)域和C端延伸區(qū)3部分，且C末端區(qū)域通常具有一個α晶狀體結(jié)構(gòu)域（αcrystallin?domain，?ACD）［3］。

在生物體內(nèi)，sHSP是細胞抵御外界脅迫的關(guān)鍵蛋白，可以有效阻止細胞質(zhì)中的其他蛋白質(zhì)發(fā)生變性［4］。在昆蟲中，sHSP響應極端溫度、病原微生物和殺蟲劑等外界脅迫，增強昆蟲對環(huán)境的適應能力。例如，柞蠶Antheraea?pernyi?sHSP21在其抵御外界高溫脅迫時具有保護機體穩(wěn)定的作用［5］;小菜蛾P(guān)lutella?xylostella?多個sHSP在響應高溫及農(nóng)藥脅迫中發(fā)揮關(guān)鍵作用［6］。此外，昆蟲sHSP還能調(diào)節(jié)生長發(fā)育、生殖和滯育等［7］。

小地老虎Agrotis?ipsilon屬鱗翅目Lepidoptera夜蛾科Noctuidae，是一種重要的遷飛性農(nóng)業(yè)害蟲，對玉米、小麥、棉花和蔬菜等多種糧食和經(jīng)濟作物造成嚴重危害［8］。小地老虎幼蟲白天藏于表土層，夜間取食幼苗，經(jīng)常導致田間作物缺苗斷壟［9］。極端溫度是影響昆蟲個體生理和種群動態(tài)的重要因子［10］，高溫同樣會對小地老虎的發(fā)生與為害產(chǎn)生影響［11］。另一方面，當前對小地老虎的防治主要依賴化學農(nóng)藥，其中高效氯氟氰菊酯、氯蟲苯甲酰胺和辛硫磷是3種常用的防治藥劑［1214］。在高溫和殺蟲劑脅迫下，小地老虎可能會通過調(diào)控sHSP基因的轉(zhuǎn)錄水平來增強蟲體抵御外界脅迫的能力。但截至目前，關(guān)于小地老虎sHSP基因及其響應外界脅迫的研究非常有限。

本研究針對小地老虎1個小分子熱激蛋白基因，對其編碼的蛋白質(zhì)序列進行生物信息學分析，并研究高溫和3種殺蟲劑（高效氯氟氰菊酯、氯蟲苯甲酰胺和辛硫磷）處理后該基因轉(zhuǎn)錄水平的變化，以期為探明其在小地老虎響應高溫及殺蟲劑脅迫中的功能奠定基礎。

1?材料與方法

1.1?供試蟲源

本研究所用小地老虎為本實驗室飼養(yǎng)種群。1齡和2齡幼蟲飼喂大白菜，幼蟲進入3齡后轉(zhuǎn)移至玻璃指形管中（每管1頭），飼喂人工飼料直至化蛹。羽化的成蟲用10%（V/V）蜂蜜水飼養(yǎng)。幼蟲和成蟲的飼養(yǎng)條件均為溫度（25±1.0）℃，相對濕度（65±2）%，光周期L∥D=16?h∥8?h。選取1～6齡幼蟲、蛹和雌雄成蟲進行后續(xù)試驗，其中1齡幼蟲50頭，其余齡期幼蟲、蛹和雌雄成蟲均取15頭。另取3齡幼蟲30頭，在冰上解剖獲得表皮、中腸、馬氏管和脂肪體等組織。樣本收集和組織解剖均設置3次生物學重復，用液氮速凍后保存于-80℃冰箱。

1.2?高溫處理

取生長狀況較為一致的小地老虎3齡幼蟲，置于潔凈的玻璃試管（11?cm×2.5?cm）中，每管1頭，置于25（對照）、32、35、38℃和41℃的恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）中處理1?h后立即放入液氮中冷凍，隨后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存。每處理設3次生物學重復，每個重復包括20頭試蟲。

1.3?殺蟲劑處理

高效氯氟氰菊酯和氯蟲苯甲酰胺購自上海阿拉丁公司;辛硫磷購自北京百靈威公司。3種藥劑純度均≥97%。配制3種殺蟲劑的LC50濃度藥液，用浸蟲法處理小地老虎3齡幼蟲，分別在處理后3、6、12、24?h和48?h收集存活試蟲，用液氮速凍后保存于-80℃冰箱。以等量丙酮水溶液處理作為對照。每處理進行3次生物學重復，每個重復包含30頭試蟲。

1.4?AiHSP19.3克隆與序列分析

使用RNAiso?Plus試劑（寶生物，大連）提取各小地老虎樣本的總RNA，分別使用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop?2000超微量分光光度計（Thermo?Fisher?Scientific，美國）檢測RNA完整性和濃度。使用Hifair?Ⅲ?1st?Strand?cDNA?Synthesis?SuperMix?for?qPCR（gDNA?digester?plus，翌圣，上海）合成cDNA。

利用BioEdit軟件中的BLAST程序，以同為鱗翅目的云杉色卷蛾Choristoneura?fumiferana?sHSP序列為模板［15］，檢索已公布的小地老虎轉(zhuǎn)錄組［16］，得到1條編碼小地老虎sHSP的cDNA序列，命名為AiHSP19.3。據(jù)此設計基因特異性引物（表1），以小地老虎cDNA為模板擴增AiHSP19.3。PCR擴增體系（50?μL）：2×Taq?MasterMix（Dye）（康為，江蘇）25?μL，10?μmol/L上、下游引物各2?μL，cDNA模板1?μL，超純水20?μL。反應程序為：94℃?2?min;94℃?30?s，55℃?30?s，72℃?30?s，35個循環(huán);72℃?2?min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測、純化回收后連入pColdⅡ表達載體，送通用生物（安徽）股份有限公司測序。使用ORFfinder（www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）預測AiHSP19.3的開放閱讀框;使用ExPASy工具（web.expasy.org/compute_pi/）計算AiHSP19.3理論分子量和等電點;分別使用SignalP?5.0（www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）和TMHMM?2.0（www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預測信號肽和跨膜區(qū);多序列聯(lián)配使用Clustal?Omega程序進行（www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalo/）;使用MEGA?11軟件的鄰近法（neighborjoining?method）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，各進化分支的置信度采用bootstrap法進行1?000次重復檢驗［17］。

1.5?AiHSP19.3基因轉(zhuǎn)錄模式分析

利用實時熒光定量PCR分析AiHSP19.3的轉(zhuǎn)錄模式。所用引物見表1。以小地老虎核糖體蛋白（RpS3）和肌動蛋白（βactin）基因作為雙內(nèi)參基因。熒光定量PCR反應體系（20?μL）：Hieff?qPCR?SYBR?Green?Master?Mix（翌圣，上海）10?μL，10?μmol/L上、下游引物各0.4?μL，cDNA?1?μL，超純水8.2?μL。擴增反應在CFX96型定量PCR儀（BioRad，美國）上進行，反應程序為：95℃?5?min;95℃?10?s，60℃?30?s，40個循環(huán)。試驗設3次生物學重復，使用Pfaffl方法［18］計算相對轉(zhuǎn)錄水平。

1.6?數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用DPS?7.05軟件進行統(tǒng)計分析，其中不同發(fā)育歷期，不同組織，不同溫度和殺蟲劑不同處理時間之間AiHSP19.3轉(zhuǎn)錄水平的差異顯著性采用單因素方差分析（Oneway?ANOVA）和Duncan氏新復極差法進行檢驗，顯著性水平設為α=0.05。

2?結(jié)果與分析

2.1?AiHSP19.3基因序列及系統(tǒng)進化位置

從小地老虎轉(zhuǎn)錄組中鑒定到一個編碼小分子熱激蛋白的cDNA序列，命名為AiHSP19.3，該序列包含516?bp的開放閱讀框，編碼1個由171個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。在線軟件預測表明，該蛋白理論分子量為19.3?kD，等電點為5.67。結(jié)構(gòu)域分析表明AiHSP19.3具有可變的N末端區(qū)域（氨基酸殘基1－62），保守的α晶狀體結(jié)構(gòu)域（氨基酸殘基63－141）和C末端區(qū)域（氨基酸殘基142－171），是一種典型的sHSP。AiHSP19.3氨基酸序列中未預測出信號肽序列和跨膜區(qū)，表明該蛋白位于胞質(zhì)內(nèi)。BLAST比對結(jié)果顯示，AiHSP19.3與草地貪夜蛾Spodoptera?frugiperda?SfHSP19.3（登錄號：XP_035456993.1;一致性90.06%）、黏蟲Mythimna?separata?MsHSP19.3（登錄號：ATN45241.1;一致性90.00%）和斜紋夜蛾Spodoptera?litura?SlHSP19.3（登錄號：XP_022837060.1;一致性89.47%）具有較高的氨基酸一致性。多序列聯(lián)配結(jié)果（圖1）表明，AiHSP19.3具有保守的α晶狀體結(jié)構(gòu)域，且與其他昆蟲的sHSP序列具有較高的相似性?；诓煌锓NsHSP的氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹顯示，AiHSP19.3與鱗翅目昆蟲sHSP聚為同一進化分支，且與草地貪夜蛾SfHSP19.3（登錄號：XP_035456993.1）親緣關(guān)系最近（圖2）。

2.2?AiHSP19.3時空轉(zhuǎn)錄模式

AiHSP19.3在所有齡期小地老虎樣本中均能檢測到轉(zhuǎn)錄（圖3a），在1齡和2齡幼蟲期轉(zhuǎn)錄水平最低，其后隨著齡期增加，轉(zhuǎn)錄水平逐漸升高，在6齡幼蟲期轉(zhuǎn)錄水平達到最大，且顯著高于其他發(fā)育階段（圖3a）。在蛹期和成蟲期，AiHSP19.3轉(zhuǎn)錄水平顯著下降（圖3a）。AiHSP19.3在小地老虎3齡幼蟲不同組織中也有不同程度的轉(zhuǎn)錄（F3，8=309.40，P=0.000?1），在脂肪體中的轉(zhuǎn)錄水平最高，且顯著高于其在體壁、馬氏管和中腸中的轉(zhuǎn)錄水平（圖3b）。

2.3?AiHSP19.3在高溫脅迫下的轉(zhuǎn)錄模式

高溫處理1?h對AiHSP19.3轉(zhuǎn)錄水平有顯著影響（F4，10=39.14，P=0.000?1）。其中，32℃處理誘導AiHSP19.3轉(zhuǎn)錄水平升高至對照組的1.97倍;35℃處理下AiHSP19.3轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)最高，達到對照組的2.52倍。但當溫度繼續(xù)升高至38℃和41℃時，AiHSP19.3的轉(zhuǎn)錄水平開始下降，但仍顯著高于對照組（圖4）。

2.4?AiHSP19.3在殺蟲劑脅迫下的轉(zhuǎn)錄模式

3種殺蟲劑（高效氯氟氰菊酯、氯蟲苯甲酰胺和辛硫磷）LC50劑量處理均能誘導AiHSP19.3轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)（高效氯氟氰菊酯：F5，12=166.49，P=0.000?1;氯蟲苯甲酰胺：F5，12=77.31，P=0.000?1;辛硫磷：F5，12=120.29，P=0.000?1），AiHSP19.3轉(zhuǎn)錄水平分別在高效氯氟氰菊酯處理后12?h，氯蟲苯甲酰胺處理后3?h和辛硫磷處理后6?h達到最高（圖5）。同時觀察到，3種藥劑處理后，AiHSP19.3轉(zhuǎn)錄水平均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，但始終高于對照組。

3?結(jié)論與討論

已有研究報道，昆蟲絕大多數(shù)sHSP含有1個α晶狀體結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域在分子識別和分子伴侶功能方面具有重要作用，并且可作為sHSP的典型特征［1920］。本研究通過分析小地老虎AiHSP19.3序列，發(fā)現(xiàn)該基因編碼的蛋白質(zhì)具有α晶狀體結(jié)構(gòu)域，表明AiHSP19.3屬于典型的sHSP。AiHSP19.3序列的獲得為深入分析該基因響應外界脅迫的分子機制奠定了基礎。

前人研究表明，大部分昆蟲sHSP基因在其不同發(fā)育階段和不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平均不相同。如棉鈴蟲Helicoverpa?armigera?sHSP22.0在4齡和5齡幼蟲期轉(zhuǎn)錄水平最高，而在蛹期和成蟲期轉(zhuǎn)錄水平極低［21］;煙草甲Lasioderma?serricorne?HSP21.7在血淋巴中的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于其在表皮、中腸與脂肪體中的轉(zhuǎn)錄水平［22］。本研究在小地老虎不同發(fā)育階段均檢測到AiHSP19.3轉(zhuǎn)錄，但該基因在6齡幼蟲期的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于其他齡期。sHSP基因在高齡幼蟲期大量轉(zhuǎn)錄的現(xiàn)象也普遍存在于其他昆蟲中，例如棉鈴蟲sHSP22.0和桃蚜Myzus?persicaes?HSP22.0均在高齡幼蟲個體中轉(zhuǎn)錄水平最高，以此增強其對外界脅迫的耐受性［21，23］。由此推測AiHSP19.3可能參與小地老虎高齡幼蟲抵御外界脅迫。通過組織特異性分析發(fā)現(xiàn)，AiHSP19.3在小地老虎3齡幼蟲脂肪體中的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于其他組織。脂肪體不僅是昆蟲重要的代謝和貯能器官，還參與昆蟲生長、發(fā)育和生殖等過程［24］。推測AiHSP19.3在脂肪體中高轉(zhuǎn)錄可能與小地老虎sHSP合成、代謝調(diào)節(jié)及變態(tài)發(fā)育有關(guān)。

sHSP對高溫脅迫的響應是昆蟲適應外界溫度變化的重要保護機制［25］。本研究發(fā)現(xiàn)AiHSP19.3轉(zhuǎn)錄水平在高溫處理后均顯著上調(diào)。高溫脅迫引起昆蟲sHSP轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)的現(xiàn)象在其他昆蟲中多有報道，例如腰帶長體繭蜂Macrocentrus?cingulum在受到高溫脅迫后其HSP23.8基因轉(zhuǎn)錄水平會顯著增加［26］;高溫脅迫下小菜蛾12個sHSP基因轉(zhuǎn)錄水平均顯著上調(diào)［6］。AiHSP19.3在高溫脅迫下轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，表明它可能參與了小地老虎響應高溫脅迫的過程，在保護蟲體的正常生理活動中發(fā)揮重要作用。

除了極端高溫之外，殺蟲劑也是昆蟲重要的外界脅迫因子。昆蟲sHSP在響應殺蟲劑脅迫中的作用已有報道，白蛾周氏嚙小蜂Chouioia?cunea經(jīng)蘇云金芽胞桿菌、阿維菌素、高效氯氰菊酯和滅幼脲4種農(nóng)藥處理后其sHSP12.2基因轉(zhuǎn)錄水平均顯著增加［27］;此外，當草地貪夜蛾、中華按蚊Anopheles?sinensis和舞毒蛾Lymantria?dispar等昆蟲受到氯蟲苯甲酰胺、擬除蟲菊酯和甲萘威等藥劑脅迫后，sHSPs基因轉(zhuǎn)錄水平均顯著上調(diào)［2830］。本研究發(fā)現(xiàn)小地老虎幼蟲經(jīng)LC50劑量高效氯氟氰菊酯、氯蟲苯甲酰胺和辛硫磷處理后AiHSP19.3基因轉(zhuǎn)錄水平均顯著上調(diào)，推測其細胞內(nèi)可能會大量合成AiHSP19.3蛋白，進而增強小地老虎對殺蟲劑的防御能力。有研究表明，桃蚜和中華蜜蜂Apis?cerana?cerana在殺蟲劑處理后體內(nèi)活性氧含量升高，產(chǎn)生氧化脅迫，sHSP隨之大量表達，以增強試蟲對活性氧的耐受性［23，31］。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)3種殺蟲劑處理后，小地老虎AiHSP19.3基因轉(zhuǎn)錄水平達到最高的時間不同，這可能是由于試蟲在不同殺蟲劑脅迫下存在不同的反應機制，從而導致了響應時間上的差異。

綜上所述，本研究闡明了小地老虎AiHSP19.3的序列特征、系統(tǒng)進化關(guān)系和轉(zhuǎn)錄模式，發(fā)現(xiàn)高溫及3種殺蟲劑均能誘導AiHSP19.3基因轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，表明AiHSP19.3可能參與了小地老虎高溫和殺蟲劑脅迫的過程。

參考文獻

［1］?張旺和，?徐進，?李偉，?等.?熱激蛋白在昆蟲生殖中的功能及作用機制［J］.?生物安全學報，?2023，?32（2）：?109117.

［2］?DENLINGER?D?L.?Regulation?of?diapause?［J］.?Annual?Review?of?Entomology，?2002，?47（1）：?93122.

［3］?KRIEHUBER?T，?RATTEI?T，?WEINMAIER?T，?et?al.?Independent?evolution?of?the?core?domain?and?its?flanking?sequences?in?small?heat?shock?proteins?［J］.?The?FASEB?Journal，?2010，?24（10）：?36333642.

［4］?BASHA?E，?ONEILL?H，?VIERLING?E.?Small?heat?shock?proteins?and?αcrystallins：?dynamic?proteins?with?flexible?functions?［J］.?Trends?in?Biochemical?Sciences，?2012，?37（3）：?106117.

［5］?LIU?Qiuning，?LIU?Yu，?XIN?Zhaozhe.?A?small?heat?shock?protein?21?（sHSP21）?mediates?immune?responses?in?Chinese?oak?silkworm?Antheraea?pernyi?［J］.?International?Journal?of?Biological?Macromolecules，?2018，?111：?10271031.

［6］?CHEN?Xien，?ZHANG?Yalin.?Identification?of?multiple?small?heatshock?protein?genes?in?Plutella?xylostella?（L.）?and?their?expression?profiles?in?response?to?abiotic?stresses?［J］.?Cell?Stress?&?Chaperones，?2015，?20：?2335.

［7］?陸明星，?徐靜，?杜予州.?昆蟲小分子量熱激蛋白的研究進展［J］.?應用昆蟲學報，?2015，?52（6）：?13261332.

［8］?吳豫.?榕江縣小地老虎發(fā)生特點及防治措施［J］.?植物醫(yī)生，?2016，?29（5）：?6263.

［9］?吳海斌，?范昆，?張坤鵬，?等.?13種殺蟲劑對小地老虎卵和幼蟲的生物活性［J］.?環(huán)境昆蟲學報，?2013，?35（3）：?409414.

［10］MA?Chunsen，?MA?Gang，?PINCEBOURDE?S.?Survive?a?warming?climate：?insect?responses?to?extreme?high?temperatures?［J］.?Annual?Review?of?Entomology，?2021，?66：?163184.

［11］向玉勇，?劉同先，?張世澤.?溫濕度、光周期和寄主植物對小地老虎求偶及交配行為的影響［J］.?植物保護學報，?2018，?45（2）：?235242.

［12］于偉麗，?杜軍輝，?胡延萍，?等.?六種殺蟲劑對小地老虎的毒力及對土壤生物安全性評價［J］.?植物保護學報，?2012，?39（3）：?277282.

［13］何發(fā)林，?姜興印，?姚晨濤，?等.?氯蟲苯甲酰胺與6種藥劑復配對小地老虎的聯(lián)合毒力［J］.?植物保護，?2018，?44（6）：?236241.

［14］ZHANG?Zhengqun，?XU?Chunmei，?DING?Jinfeng，?et?al.?Cyantraniliprole?seed?treatment?efficiency?against?Agrotis?ipsilon?（Lepidoptera：?Noctuidae）?and?residue?concentrations?in?corn?plants?and?soil?［J］.?Pest?Management?Science，?2019，?75（5）：?14641472.

［15］QUAN?Guoxing，?DUAN?Jun，?LADD?T，?et?al.?Identification?and?expression?analysis?of?multiple?small?heat?shock?protein?genes?in?spruce?budworm，?Choristoneura?fumiferana?（L.）?［J］.?Cell?Stress?&?Chaperones，?2018，?23（1）：?141154.

［16］GU?Shaohua，?WU?Kongming，?GUO?Yuyuan，?et?al.?Identification?of?genes?expressed?in?the?sex?pheromone?gland?of?the?black?cutworm?Agrotis?ipsilon?with?putative?roles?in?sex?pheromone?biosynthesis?and?transport?［J/OL］.?BMC?Genomics，?2013，?14：?636.?DOI：?10.1186/14712164/14/636.

［17］TAMURA?K，?STECHER?G，?KUMAR?S.?MEGA11：?molecular?evolutionary?genetics?analysis?version?11?［J］.?Molecular?Biology?and?Evolution，?2021，?38（7）：?30223027.

［18］PFAFFL?M?W.?A?new?mathematical?model?for?relative?quantification?in?realtime?RTPCR?［J/OL］.?Nucleic?Acids?Research，?2001，?29（9）：?e45.?DOI：?10.1093/nar/29.9.e45.

［19］MONTFORT?R?V，?SLINGSBY?C，?VIERLING?E.?Structure?and?function?of?the?small?heat?shock?protein/αcrystallin?family?of?molecular?chaperones?［J］.?Advances?in?Protein?Chemistry，?2001，?59：?105156.

［20］SUN?Y，?MACRAE?T?H.?Small?heat?shock?proteins：?molecular?structure?and?chaperone?function?［J］.?Cellular?and?Molecular?Life?Sciences，?2005，?62（21）：?24602476.

［21］楊朔，?劉少凱，?趙少軒，?等.?棉鈴蟲小分子熱激蛋白sHSP22.0基因的克隆及表達譜分析［J］.?植物保護，?2021，?47（3）：?6169.

［22］黃巖.?煙草甲熱激蛋白基因的鑒定、表達模式和功能研究［D］;?合肥：?安徽農(nóng)業(yè)大學，?2022.

［23］董寶.?桃蚜2個熱激蛋白基因?qū)Ω邷睾蜌⑾x劑脅迫的響應及其功能研究［D］;?合肥：?安徽農(nóng)業(yè)大學，?2022.

［24］ARRESE?E?L，?SOULAGES?J?L.?Insect?fat?body：?energy，?metabolism，?and?regulation?［J］.?Annual?Review?of?Entomology，?2010，?55：?207225.

［25］李慧，?何玄玉，?陶蓉，?等.?松墨天牛小熱激蛋白基因的克隆、表達譜及對溫度脅迫的響應［J］.?昆蟲學報，?2018，?61（7）：?749760.

［26］XU?Pengjun，?XIAO?Jinhua，?LIU?Li，?et?al.?Molecular?cloning?and?characterization?of?four?heat?shock?protein?genes?from?Macrocentrus?cingulum?（Hymenoptera：?Braconidae）?［J］.?Molecular?Biology?Reports，?2010，?37：?22652272.

［27］范偉健，?相偉芳，?王靜，?等.?農(nóng)藥與紫外脅迫對白蛾周氏嚙小蜂小分子熱激蛋白sHSP12.2基因表達的影響［J］.?林業(yè)科學，?2019，?55（2）：?128136.

［28］SAMANTA?S，?BARMAN?M，?CHAKRABORTY?S，?et?al.?Involvement?of?small?heat?shock?proteins?（sHsps）?in?developmental?stages?of?fall?armyworm，?Spodoptera?frugiperda?and?its?expression?pattern?under?abiotic?stress?condition?［J/OL］.?Heliyon，?2021，?7（4）：?e06906.?DOI：?10.1016/j.heliyon.2021.e06906.

［29］SI?Fengling，?QIAO?Liang，?HE?Qiyi，?et?al.?HSP?superfamily?of?genes?in?the?malaria?vector?Anopheles?sinensis：?diversity，?phylogenetics?and?association?with?pyrethroid?resistance?［J］.?Malaria?Journal，?2019，?18：?115.

［30］劉鵬，?孫麗麗，?張琪慧，?等.?舞毒蛾小分子熱激蛋白基因分析及對甲萘威脅迫的響應［J］.?北京林業(yè)大學學報，?2017，?39（1）：?7884.

［31］ZHANG?Yuanying，?LIU?Yaling，?GUO?Xulei，?et?al.?sHsp22.6，?an?intronless?small?heat?shock?protein?gene，?is?involved?in?stress?defence?and?development?in?Apis?cerana?cerana?［J］.?Insect?Biochemistry?and?Molecular?Biology，?2014，?53：?112.

（責任編輯：楊明麗）