吳慧芳 蒙耀 石暉琴 魏琳 沈碩

摘要

鐮孢菌引起的馬鈴薯干腐病是影響馬鈴薯貯存期間產(chǎn)量與品質(zhì)的重要病害之一。尋找高效低毒的防治馬鈴薯干腐病的生防藥劑對(duì)提高馬鈴薯的產(chǎn)量與質(zhì)量具有重要意義。本研究以腐皮鐮孢Fusarium?solani為病原菌，測(cè)定分離自馬鈴薯塊莖的菌株219CJK2的抑菌活性。該菌株發(fā)酵液、無(wú)菌發(fā)酵液、菌懸液、胞內(nèi)組分以及揮發(fā)性有機(jī)物對(duì)腐皮鐮孢均具有抑菌活性，抑制率分別為93.37%、61.92%、80.82%、44.01%和49.16%。結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化特征和多基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建鑒定其為貝萊斯芽胞桿菌Bacillus?velezensis。馬鈴薯切片試驗(yàn)和馬鈴薯塊莖試驗(yàn)表明，當(dāng)菌株發(fā)酵液濃度為1×109?cfu/mL時(shí)，對(duì)病原菌的抑制效果最好。除此之外，菌株可以分泌蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶，具有溶磷能力和生物膜形成能力，但不具有溶血性，并且對(duì)供試的其他6種病原真菌有較強(qiáng)的抑菌活性。研究表明貝萊斯芽胞桿菌219CJK2抑菌譜廣，具有生物安全性，對(duì)腐皮鐮孢有較強(qiáng)的抑菌活性，在植物病害防治中具有一定的應(yīng)用潛力，可為馬鈴薯干腐病生防制劑的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞

馬鈴薯干腐病;?腐皮鐮孢;?貝萊斯芽胞桿菌;?生物防治

中圖分類(lèi)號(hào)：?S?476

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2023408

Identification?of?a?biocontrol?bacterium?against?potato?dry?rot?and?its?antibacterial?activity

WU?Huifang，?MENG?Yao，?SHI?Huiqin，?WEI?Lin，?SHEN?Shuo*

（Key?Laboratory?of?Biotechnology?in?QinghaiTibet?Plateau，?Ministry?of?Education，?Key?Laboratory?of?Potato

Breeding?in?Qinghai?Province，?Engineering?Research?Center?of?Northwest?Potato，?Ministry?of?Education，

Qinghai?Academy?of?Agricultural?and?Forestry?Sciences，?Qinghai?University，?Xining?810016，?China）

Abstract

Potato?dry?rot?caused?by?Fusarium?is?one?of?the?important?diseases?affecting?both?the?yield?and?quality?of?potato?during?storage.?Finding?highly?efficient?and?lowtoxicity?biocontrol?agents?to?control?potato?dry?rot?holds?great?significance?in?improving?the?yield?and?quality?of?potato.?In?this?study，?the?antifungal?activity?of?strain?219CJK2?isolated?from?potato?tubers?against?Fusarium?solani?was?determined.?The?results?revealed?that?various?components?of?the?strain，?including?the?fermentation?broth，?sterile?fermentation?broth，?bacterial?suspension，?intracellular?components，?and?volatile?organic?compounds，?exhibited?notable?antifungal?activity?against?F.solani，?with?an?inhibition?rate?of?93.37%，?61.92%，?80.82%，?44.01%?and?49.16%，?respectively.?A?combination?of?morphological，?physiological，?and?biochemical?characteristics，?along?with?multigene?phylogenetic?analysis，?it?was?identified?as?Bacillus?velezensis.?Antifungal?test?using?potato?slice?and?tubers?showed?that?the?optimal?control?effect?was?achieved?when?the?concentration?of?the?fermentation?broth?was?1×109?cfu/mL.?In?addition，?the?strain?could?secrete?proteases，?amylases，?and?cellulases，?has?along?with?the?ability?to?dissolve?phosphate?and?form?biofilm，?but?it?lacked?hemolysis?activity?and?displayed?strong?antifungal?activity?against?six?other?pathogenic?fungi.?These?results?showed?that?B.velezensis?219CJK2?had?a?broad?antifungal?spectrum，?biosafety，?and?strong?antifungal?activity?against?F.solani.?Our?study?suggests?its?potential?application?in?the?prevention?and?control?of?plant?diseases，?thereby?laying?a?foundation?for?the?development?of?biocontrol?agents?for?potato?dry?rot.

Key?words

potato?dry?rot;?Fusarium?solani;?Bacillus?velezensis;?biological?control

馬鈴薯Solanum?tuberosum?L.為茄科Solanaceae茄屬Solanum的一年生草本植物，栽培范圍廣、產(chǎn)量高，是僅次于小麥、玉米、水稻之外主要的非谷類(lèi)主糧作物［1］。在馬鈴薯栽培和貯藏期間會(huì)發(fā)生多種病害，其中由鐮孢菌Fusarium?spp.引起的馬鈴薯干腐病發(fā)生普遍，嚴(yán)重影響馬鈴薯的產(chǎn)量和品質(zhì)，并給加工業(yè)和消費(fèi)者帶來(lái)重大損失［2］。該病害在馬鈴薯栽培期和貯藏期均可發(fā)生，主要危害塊莖。發(fā)病初期薯塊表面出現(xiàn)黑褐色凹陷病斑，隨后擴(kuò)大形成較多輪紋狀褶皺;后期薯塊內(nèi)部變空，空腔內(nèi)布滿(mǎn)菌絲，整個(gè)薯塊變硬、變輕、干縮，呈灰褐色或深褐色［3］。

馬鈴薯干腐病病原菌以菌絲體或孢子在病殘組織或土壤中越冬，可以在土壤中存活多年，給該病害的防治帶來(lái)很大挑戰(zhàn)［4］。迄今為止，尚未有抗所有致病鐮孢的馬鈴薯品種，且不同鐮孢菌的致病力和危害方式也不同［5］。目前對(duì)馬鈴薯干腐病主要采取化學(xué)防治的手段，常用藥劑有噻菌靈、抑霉唑和仲丁胺等［67］。但長(zhǎng)期使用化學(xué)藥劑會(huì)導(dǎo)致病菌產(chǎn)生抗藥性和耐藥性，降低化學(xué)藥劑的防治效果。因此使用對(duì)人體和生態(tài)環(huán)境無(wú)害的生防菌菌劑替代化學(xué)藥劑，已成為世界范圍內(nèi)植物病害防治的方向。

芽胞桿菌作為生防菌的一大類(lèi)，具有抗逆性強(qiáng)和抑菌譜廣的特點(diǎn)，被廣泛用于植物病害防治。多項(xiàng)研究表明，貝萊斯芽胞桿菌可有效防治核桃黑斑?。?］、番茄灰霉?。?］、煙草青枯?。?0］、馬鈴薯炭疽?。?1］等多種病害，并且一些芽胞桿菌具有溶磷，產(chǎn)IAA和鐵載體的能力，并能促進(jìn)植物生長(zhǎng)［12］。沈碩［13］研究發(fā)現(xiàn)，特氏鹽芽胞桿菌Halobacillus?trueperi對(duì)馬鈴薯干腐病病原菌具有良好的抑制活性，抑制率為55.67%，其發(fā)酵液可以產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶等，并且能產(chǎn)生脂肽類(lèi)抑菌物質(zhì)。目前，用于馬鈴薯干腐病的芽胞桿菌類(lèi)生防菌的研究較少，本研究以腐皮鐮孢為病原菌，從多方面評(píng)估貝萊斯芽胞桿菌219CJK2的抑菌活性，旨在豐富馬鈴薯生防菌資源，為馬鈴薯干腐病的生物防治提供一定的理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?供試菌株

腐皮鐮孢Fusarium?solani，極細(xì)鏈格孢Alternaria?tenuissima，互生鏈格孢Alternaria?alternata，燕麥鐮孢Fusarium?avenaceum，球炭疽菌Colletotrichum?coccodes，立枯絲核菌Rhizoctonia?solani，灰葡萄孢Botrytis?cinerea，由青海省農(nóng)林科學(xué)院微生物研究室保存。菌株219CJK2分離自馬鈴薯塊莖，由青海省農(nóng)林科學(xué)院微生物研究室分離并保存。

1.1.2?供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200?g，葡萄糖20?g，瓊脂20?g，蒸餾水1?000?mL，自然pH?（不添加瓊脂為PDB液體培養(yǎng)基）。

NB培養(yǎng)基：蛋白胨10?g，牛肉膏3?g，氯化鈉5?g，蒸餾水1?000?mL，pH?7.2～7.4?（添加瓊脂為NA固體培養(yǎng)基）。

蒙金娜無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基：葡萄糖10?g，硫酸銨0.5?g，氯化鈉0.3?g，氯化鉀0.3?g，硫酸鎂0.3?g，硫酸亞鐵0.03?g，硫酸錳0.03?g，磷酸鈣10?g，瓊脂16?g，蒸餾水1?000?mL，pH?7.0～7.5。

蛋白酶檢測(cè)培養(yǎng)基：脫脂奶粉12?g，瓊脂粉20?g，蒸餾水1?000?mL，自然pH。

淀粉酶檢測(cè)培養(yǎng)基：蛋白胨5?g，牛肉膏3?g，可溶性淀粉10?g，瓊脂18?g，蒸餾水1?000?mL，自然pH。

纖維素酶檢測(cè)培養(yǎng)基：?蛋白胨5?g，酵母浸粉5?g，羧甲基纖維素鈉5?g，氯化鈉2.5?g，磷酸二氫鉀0.5?g，瓊脂8?g，蒸餾水500?mL。

血瓊脂培養(yǎng)基：胰酶消化酪蛋白10?g，氯化鈉5?g，肉胃酶消化物5?g，玉米淀粉1?g，心胰酶消化物3?g，酵母浸粉5?g，瓊脂15?g，蒸餾水1?000?mL，pH?7.1～7.5。121℃高壓滅菌15?min，冷卻至55℃左右加入7%～10%無(wú)菌脫纖維羊血，混勻后制成平板。無(wú)菌脫纖維羊血（貨號(hào)TX0020100ml）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?菌株219CJK2對(duì)腐皮鐮孢的抑菌活性

采用平板對(duì)峙法［14］，將腐皮鐮孢在PDA平板上于28℃黑暗培養(yǎng)5?d，在菌落邊緣打取直徑7?mm的菌餅，置于PDA平板中心，在距離菌餅25?mm相對(duì)四點(diǎn)處，用接種針點(diǎn)接生防菌株，以不接種生防菌株為空白對(duì)照。待對(duì)照菌絲快長(zhǎng)滿(mǎn)整個(gè)培養(yǎng)皿時(shí)測(cè)量菌落直徑，并計(jì)算生防菌株對(duì)腐皮鐮孢的抑制率，每個(gè)處理重復(fù)3次。抑菌率=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑）×100%。在對(duì)峙平板上挑取病原菌菌落邊緣菌絲，置于光學(xué)顯微鏡下觀察病原菌菌絲形態(tài)。

1.2.2?菌株219CJK2培養(yǎng)液不同組分對(duì)腐皮鐮孢的抑菌活性

菌株種子液制備：挑取菌株219CJK2單菌落接種在NB液體培養(yǎng)基中，28℃，180?r/min過(guò)夜培養(yǎng)，即為種子液。

發(fā)酵液制備：將種子液按1%接種量接種到NB液體培養(yǎng)基中，28℃，180?r/min培養(yǎng)72?h，獲得發(fā)酵液。

無(wú)菌發(fā)酵液制備：將發(fā)酵液在4℃，12?000?r/min離心15?min，收集上清，經(jīng)0.22?μm孔徑濾膜過(guò)濾除去菌體，即為無(wú)菌發(fā)酵液。

菌懸液制備：將發(fā)酵液在4℃，12?000?r/min離心15?min，收集菌體，使用PBS緩沖液清洗3遍后，加入PBS緩沖液至原體積，即為菌懸液。

胞內(nèi)組分制備：將菌懸液在冰浴下破碎6?s，間隔6?s，破碎20?min，4℃，12?000?r/min離心15?min，收集上清，即為胞內(nèi)組分。

在錐形瓶中加入90?mL?PDA培養(yǎng)基并滅菌，待培養(yǎng)基冷卻至50℃左右分別加入10?mL發(fā)酵液，無(wú)菌發(fā)酵液，菌懸液和胞內(nèi)組分，使各組分的最終含量為10%?（V/V），搖勻后倒平板，以不添加其他成分的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照，每處理重復(fù)3次。平板凝固后在平板中央接入直徑為7?mm的腐皮鐮孢菌餅，28℃培養(yǎng)7?d，測(cè)量菌落直徑，計(jì)算抑菌率。

1.2.3?菌株219CJK2產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)物對(duì)腐皮鐮孢的抑菌活性

采用平板對(duì)扣法，將菌株219CJK2的種子液100?μL涂布于NA平板上，將7?mm的腐皮鐮孢菌餅接種于PDA平板中央，將2個(gè)平板對(duì)扣，用封口膜密封，28℃黑暗培養(yǎng)7?d，測(cè)量菌落直徑，計(jì)算抑菌率。每處理重復(fù)3次，對(duì)照使用空白NA平板。

1.2.4?菌株219CJK2的鑒定

1.2.4.1?形態(tài)學(xué)鑒定

參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［15］對(duì)生防菌株219CJK2進(jìn)行形態(tài)學(xué)特征觀察。將菌株在NA平板上劃線，35℃培養(yǎng)48?h，觀察記錄菌落形態(tài)、顏色和透明程度，并對(duì)菌株219CJK2進(jìn)行革蘭氏染色并置于顯微鏡下觀察。

1.2.4.2?生理生化鑒定

參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［15］的方法對(duì)生防菌株219CJK2進(jìn)行甘露醇、乳糖、檸檬酸鹽、丙酸鹽的利用，耐鹽性，VP試驗(yàn)，硝酸鹽還原等生理生化特性鑒定。

1.2.4.3?分子生物學(xué)鑒定

利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株219CJK2基因組DNA，選擇可用于鑒定芽胞桿菌種屬的保守基因16S?rDNA、DNA回旋酶亞基A（DNA?gyrase?subunit?A，?gyrA）、DNA回旋酶亞基B（DNA?gyrase?subunit?B，?gyrB）和RNA聚合酶β亞基（RNA?polymerase?subunit?β，?rpoB）進(jìn)行PCR擴(kuò)增與測(cè)序。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)后回收，送至艾優(yōu)稷生物科技（西安）有限公司測(cè)序，所得序列上傳至NCBI獲得登錄號(hào)（表1）。以軟件MEGA?7.0和Sequence?Matrix將16S?rDNA、gyrA、gyrB、rpoB的基因序列連接后比對(duì)，采用最大似然法（自展值設(shè)為1?000）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，確定219CJK2分類(lèi)地位［16］。

1.2.5?菌株219CJK2發(fā)酵液對(duì)馬鈴薯干腐病菌的抑制作用

菌株219CJK2不同濃度發(fā)酵液制備：按照1.2.2制備生防菌株發(fā)酵液，用空白培養(yǎng)基將發(fā)酵液分別稀釋為1×105、1×106、1×107、1×108、1×109?cfu/mL。

病原菌孢子懸浮液制備：將腐皮鐮孢Fusarium?solani菌餅接種于PDB培養(yǎng)基中，28℃，180?r/min培養(yǎng)4?d，用3層無(wú)菌紗布過(guò)濾除去菌絲，濾液在4℃，10?000?r/min離心10?min，棄上清，用無(wú)菌水將孢子濃度調(diào)整為1×107個(gè)/mL。

1.2.5.1?馬鈴薯切片抑菌試驗(yàn)

參照Loria等［17］的方法，用馬鈴薯塊莖切片法評(píng)價(jià)菌株219CJK2不同濃度發(fā)酵液對(duì)腐皮鐮孢的抑菌活性。用自來(lái)水洗凈馬鈴薯上的泥土，在室溫下晾干后用1%的次氯酸鈉溶液消毒10?min后切片（直徑27?mm，厚度3?mm）。將馬鈴薯切片放在不同濃度的發(fā)酵液中浸泡15?min，以在無(wú)菌水中浸泡15?min為對(duì)照，置于含有濕潤(rùn)無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中。2?h后接種直徑為5?mm的F.solani菌餅。每處理3次重復(fù)，在28℃條件下黑暗培養(yǎng)5?d，觀察病原菌在塊莖切片上受抑制情況及馬鈴薯切片發(fā)病情況。

1.2.5.2?馬鈴薯塊莖抑菌試驗(yàn)

參照Z(yǔ)hang等［18］的方法，評(píng)價(jià)不同濃度發(fā)酵液對(duì)馬鈴薯干腐病的防治效果。用自來(lái)水洗凈馬鈴薯上的泥土，在室溫下晾干后用1%的次氯酸鈉溶液消毒10?min，在超凈臺(tái)上晾干。用無(wú)菌打孔器在馬鈴薯塊莖表面制造1個(gè)圓形傷口（直徑5?mm，深7?mm）。分別接種不同濃度的219CJK2發(fā)酵液40?μL，以無(wú)菌水作為對(duì)照。2?h后，每個(gè)創(chuàng)面接種40?μL?F.solani孢子懸浮液（1×107個(gè)/mL）。自然干燥后，置于28℃，相對(duì)濕度90%～95%的培養(yǎng)箱中貯藏7?d，測(cè)量其病灶直徑及腐爛情況。抑菌率=（對(duì)照病灶直徑-處理病灶直徑）/（對(duì)照病灶直徑-5?mm）×100%。每處理重復(fù)3次，每次10個(gè)馬鈴薯塊莖。

1.2.6?菌株219CJK2胞外酶活性、解磷能力檢測(cè)及溶血安全性的評(píng)價(jià)

按照1.2.2制備生防菌種子液。采用透明圈法測(cè)定生防菌株219CJK2的產(chǎn)酶能力。在蛋白酶檢測(cè)培養(yǎng)基、淀粉酶檢測(cè)培養(yǎng)基和蒙金娜無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基平板上各打3孔（d=7?mm），每孔加入100?μL種子液，28℃恒溫培養(yǎng)3?d，查看蛋白酶檢測(cè)平板是否出現(xiàn)水解圈，有水解圈表明菌株能產(chǎn)生蛋白酶。將魯戈氏碘液加入淀粉酶檢測(cè)平板，若淀粉酶檢測(cè)培養(yǎng)基出現(xiàn)水解圈，表明菌株能產(chǎn)生淀粉酶。將適量0.1%剛果紅染液加入纖維素酶檢測(cè)平板，靜置染色15?min，用NaCl溶液沖洗，觀察是否出現(xiàn)黃色暈圈，若有則表明菌株能產(chǎn)生纖維素酶。查看蒙金娜無(wú)機(jī)磷平板是否出現(xiàn)水解圈，有水解圈表明菌株有解磷能力。將菌株劃線接種于血瓊脂平板上，置于35℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24?h，觀察菌株溶血現(xiàn)象，判斷其安全性。

1.2.7?菌株219CJK2生物膜形成能力檢測(cè)

在6孔板中加入5?mL?LB培養(yǎng)基，而后接種新鮮過(guò)夜培養(yǎng)的500?μL種子液，置于35℃培養(yǎng)箱分別靜置培養(yǎng)24?h和48?h;小心取出6孔板，用無(wú)菌注射器小心吸出6孔板中生物膜下的培養(yǎng)基和游離細(xì)胞，用無(wú)菌PBS輕輕柔洗1遍后，加入5?mL甲醇溶液固定15?min;小心棄去甲醇溶液，在室溫下靜置至生物膜干燥，加入5?mL?1%結(jié)晶紫溶液染色15?min，小心棄去染色劑，用無(wú)菌PBS將染液洗凈，倒置放在37℃恒溫培養(yǎng)箱中烘干;加入5?mL?33%冰醋酸溶液在37℃溫浴30?min使生物膜完全溶解，分光光度計(jì)測(cè)定OD590。每處理重復(fù)6次，以空白培養(yǎng)基為對(duì)照。

1.2.8?菌株219CJK2抑菌譜測(cè)定

參照1.2.1中平板對(duì)峙法測(cè)定菌株219CJK2對(duì)其他6種病原菌的抑菌活性。

2?結(jié)果與分析

2.1?菌株219CJK2對(duì)腐皮鐮孢的抑菌活性

平板對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)對(duì)照菌落長(zhǎng)至7.76?cm時(shí)，對(duì)峙菌落僅長(zhǎng)至3.21?cm，生防菌對(duì)腐皮鐮孢有很強(qiáng)的抑菌活性，菌絲生長(zhǎng)抑制率為64.45%。正常的腐皮鐮孢可形成完整的輻射狀菌落，而生防菌株219CJK2能明顯抑制腐皮鐮孢菌絲的生長(zhǎng)。使用顯微鏡觀察對(duì)峙菌絲和對(duì)照菌絲，發(fā)現(xiàn)與正常生長(zhǎng)的腐皮鐮孢菌絲相比，與219CJK2對(duì)峙培養(yǎng)的腐皮鐮孢菌絲頂端膨大，且形成不規(guī)則畸變，整個(gè)菌絲呈不規(guī)則彎曲凸起狀（圖1）。

2.2?菌株219CJK2不同組分對(duì)腐皮鐮孢的抑菌活性

使用添加菌株219CJK2不同組分的培養(yǎng)基進(jìn)行抑菌活性測(cè)定，不同組分對(duì)腐皮鐮孢均有抑菌活性（表2）。添加菌株219CJK2發(fā)酵液的抑菌活性最高，抑菌率為93.37%;添加菌懸液對(duì)腐皮鐮孢的抑菌率為80.82%;添加無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)腐皮鐮孢抑菌率為61.92%，添加胞內(nèi)活性組分對(duì)腐皮鐮孢生長(zhǎng)抑制能力較弱，抑菌率為44.01%。

2.3?菌株219CJK2揮發(fā)性有機(jī)物對(duì)腐皮鐮孢的抑菌活性

腐皮鐮孢經(jīng)菌株219CJK2揮發(fā)性有機(jī)物處理7?d后，對(duì)照菌落直徑為7.82?cm，處理菌落直徑為4.32?cm，菌絲生長(zhǎng)明顯受到抑制，抑菌率為49.16%，表明菌株219CJK2揮發(fā)性有機(jī)物對(duì)腐皮鐮孢有較好的抑菌活性。

2.4?菌株219CJK2的鑒定結(jié)果

2.4.1?形態(tài)學(xué)鑒定

菌株219CJK2在NA平板上生長(zhǎng)狀態(tài)良好，35℃培養(yǎng)48?h后，菌落圓形或不規(guī)則形，邊緣光滑濕潤(rùn)，表皮有褶皺，乳白色不透明，挑取時(shí)呈黏稠狀。顯微鏡觀察菌株呈單細(xì)胞桿狀，革蘭氏染色呈陽(yáng)性（圖2）。

2.4.2?生理生化鑒定

菌株219CJK2能利用甘露醇、乳糖和葡萄糖，VP試驗(yàn)陽(yáng)性，能在7%氯化鈉、pH?5.7條件下生長(zhǎng)，不能利用檸檬酸鹽和丙酸鹽，不能還原硝酸鹽，不產(chǎn)生IAA（表3）。

2.4.3?分子生物學(xué)鑒定

基于菌株219CJK2的16S?rDNA、gyrA、gyrB和rpoB基因序列，構(gòu)建219CJK2多基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖3）。結(jié)果表明，菌株219CJK2與貝萊斯芽胞桿菌LMG?22478聚在同一支。綜合菌落形態(tài)、生理生化和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，最終將菌株219CJK2鑒定為貝萊斯芽胞桿菌Bacillus?velezensis。

2.5?菌株219CJK2發(fā)酵液對(duì)馬鈴薯干腐病的抑制效果

2.5.1?馬鈴薯切片抑菌試驗(yàn)結(jié)果

不同濃度的219CJK2發(fā)酵液對(duì)腐皮鐮孢引起的馬鈴薯切片腐爛有不同的抑制效果（圖4A）。對(duì)照切片上布滿(mǎn)菌絲，且呈現(xiàn)出褐變。與對(duì)照相比，1×109?cfu/mL的219CJK2處理防治效果最好，切片沒(méi)有發(fā)生褐變，菌絲在切片上幾乎不生長(zhǎng)，抑制效果呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性。

2.5.2?馬鈴薯塊莖抑菌試驗(yàn)結(jié)果

菌株219CJK2對(duì)馬鈴薯塊莖上腐皮鐮孢的抑制效果如圖4B和表4。由圖表可看出，馬鈴薯塊莖的病灶直徑隨著發(fā)酵液濃度增加而減小，且明顯小于對(duì)照。防治效果隨著發(fā)酵液濃度的增加，呈上升趨勢(shì)。1×105、1×106、1×107、1×108?cfu/mL和1×109?cfu/mL濃度處理的防治效果分別為26.92%、40.44%、57.85%、80.99%和88.55%。結(jié)果表明，219CJK2對(duì)馬鈴薯干腐病具有明顯的抑制效果。

2.6?菌株219CJK2胞外酶活性、解磷能力檢測(cè)及溶血安全性的評(píng)價(jià)

胞外酶活性及解磷能力檢測(cè)結(jié)果表明，生防菌219CJK2具有產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶和解磷的能力（圖5）。

將菌株219CJK2接種于血瓊脂平板中培養(yǎng)24?h后，溶血性試驗(yàn)結(jié)果如圖5f所示。結(jié)果顯示，在培養(yǎng)24?h后，血瓊脂平板上未出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，因此可認(rèn)為菌株219CJK2不具溶血性，初步認(rèn)為219CJK2為一株安全的菌株。

2.7?菌株219CJK2生物膜形成能力

結(jié)晶紫染色后，孔板內(nèi)壁形成一圈紫環(huán)，說(shuō)明菌株219CJK2能形成生物膜。靜置培養(yǎng)24?h和48?h，其在590?nm處的吸光度分別為2.989和3.240，說(shuō)明48?h生物膜形成量比24?h略有增長(zhǎng)。

2.8?菌株219CJK2的抑菌譜

平板對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株219CJK2對(duì)其他6種病原菌均表現(xiàn)出良好的抑菌活性（圖6），抑菌率均在55%以上，其中對(duì)球炭疽菌的抑菌活性最強(qiáng)，抑菌率可達(dá)86.60%，對(duì)互生鏈格孢的抑菌活性最弱，抑菌率為59.77%（表5）。

3?結(jié)論與討論

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上經(jīng)常依賴(lài)化學(xué)藥劑和化肥來(lái)獲得豐厚的農(nóng)業(yè)產(chǎn)出［19］。在過(guò)去的幾個(gè)世紀(jì)里，農(nóng)藥對(duì)提高作物的質(zhì)量和產(chǎn)量起到了非常重要的作用［20］。近年來(lái)，由于環(huán)境污染和農(nóng)藥殘留對(duì)人類(lèi)健康和地球生態(tài)系統(tǒng)的影響，人們對(duì)化學(xué)肥料和農(nóng)藥的態(tài)度發(fā)生了變化［21］。相對(duì)于化學(xué)防治，生物防治具有專(zhuān)一性，對(duì)環(huán)境友好，對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物安全無(wú)害，是化學(xué)防治的良好替代措施［22］。芽胞桿菌已成為很有吸引力的生物菌劑，其能夠產(chǎn)生堅(jiān)硬、耐藥的芽胞和抗生素，對(duì)多種病原菌都有抑制作用［23］。據(jù)報(bào)道，芽胞桿菌屬中的貝萊斯芽胞桿菌可以抑制多種微生物病原體的生長(zhǎng)，包括細(xì)菌、真菌和線蟲(chóng)［24］。

本研究從馬鈴薯塊莖中分離得到一株生防細(xì)菌219CJK2，其對(duì)馬鈴薯干腐病病原腐皮鐮孢有很強(qiáng)的抑菌活性，抑制率為64.45%。對(duì)其不同組分抑菌活性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液的抑菌活性最高，抑制率為93.37%，胞內(nèi)組分抑菌活性最低，抑制率為44.01%。微生物產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物有的分泌于細(xì)胞外，形成細(xì)胞外次生代謝產(chǎn)物，有的則留在細(xì)胞內(nèi)，形成細(xì)胞內(nèi)次生代謝產(chǎn)物［25］。目前對(duì)于芽胞桿菌的抑菌活性物質(zhì)的研究多集中在細(xì)胞外代謝產(chǎn)物，對(duì)于芽胞桿菌細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物研究甚少［26］，菌株219CJK2的胞內(nèi)抑菌活性物質(zhì)有待進(jìn)一步研究。無(wú)菌發(fā)酵液的抑制率為61.92%，有較強(qiáng)的抑菌活性，說(shuō)明菌株219CJK2產(chǎn)生的胞外次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌有良好的抑菌活性。

細(xì)菌產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)物（volatile?organic?compounds，?VOCs），能夠影響病原真菌的生長(zhǎng)代謝，促進(jìn)植物的生長(zhǎng)。Fernando等［27］從油菜和大豆以及相關(guān)作物土壤中分離出的假單胞菌Pseudomonas?adaceae產(chǎn)生的揮發(fā)物有抑制菌核活性和限制子囊孢子產(chǎn)生和萌發(fā)的作用。陳奕鵬等［28］從健康香蕉植株分離得到一株解淀粉芽胞桿菌Bacillus?amyloliquefaciens?BEB17，該菌株揮發(fā)性有機(jī)物可抑制多種病原菌生長(zhǎng)，并能抑制病原菌孢子萌發(fā)。菌株219CJK2揮發(fā)性有機(jī)物對(duì)腐皮鐮孢具有較強(qiáng)的抑菌活性，有開(kāi)發(fā)為生物熏蒸劑的潛力，其產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)物物質(zhì)還待進(jìn)一步研究鑒定。

胞外酶可以通過(guò)溶解病原菌的細(xì)胞壁、抑制菌絲生長(zhǎng)、孢子生長(zhǎng)等，干擾病原菌對(duì)植物的侵染，從而防治植物病害，可以用來(lái)評(píng)估生防菌的生防潛力［2930］。已報(bào)道的相關(guān)胞外酶有幾丁質(zhì)酶、蛋白酶、纖維素酶等。張紅霞等［31］發(fā)現(xiàn)致病疫霉Phytophthora?infestans可誘導(dǎo)細(xì)菌HT6產(chǎn)生纖維素酶，且纖維素酶在抑制致病疫霉菌絲生長(zhǎng)和引起菌絲體畸變中發(fā)揮了重要作用。土壤中含有較多磷元素，但大多以溶解度極低的化合物形態(tài)存在，難以被植物吸收和利用，自然環(huán)境中普遍存在可利用磷缺少的情況［3234］。芽胞桿菌是主要的解磷細(xì)菌之一，能通過(guò)分泌有機(jī)酸溶解土壤中的無(wú)機(jī)磷［35］，促進(jìn)植物生長(zhǎng)和對(duì)其他微量營(yíng)養(yǎng)元素的吸收。本研究獲得的生防菌219CJK2能夠分泌蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶，同時(shí)具有溶磷能力，表明分泌水解酶是其抑菌機(jī)理之一，且菌株219CJK2具有潛在的促生能力。

生防菌在植物體內(nèi)成功定殖直接決定其生防能力，而菌株生物膜的形成是菌株定殖成功的關(guān)鍵因素。司方潔等［9］通過(guò)構(gòu)建貝萊斯芽胞桿菌5YN8生物膜相關(guān)基因突變體發(fā)現(xiàn)，生物膜形成能力增強(qiáng)突變體菌株在番茄葉面的定殖能力增強(qiáng)，對(duì)番茄灰霉病的防治效果顯著增強(qiáng)，為80.77%，而生物膜形成能力減弱突變體菌株在葉面的定殖能力顯著降低，對(duì)灰霉病的防效顯著降低，僅為16.02%。菌株219CJK2具有形成生物膜的能力，且隨著時(shí)間增長(zhǎng)，生物膜形成量增加。有溶血性的芽胞桿菌具有致病性，能引起人和動(dòng)物的多種疾病［36］。菌株219CJK2溶血安全性試驗(yàn)表明，菌株不具有溶血性，可作為開(kāi)發(fā)為生防菌劑的候選菌株。

本研究以腐皮鐮孢為病原菌，檢測(cè)貝萊斯芽胞桿菌219CJK2的抑菌活性。該菌株發(fā)酵液、無(wú)菌發(fā)酵液、菌懸液、胞內(nèi)組分和揮發(fā)性有機(jī)物對(duì)腐皮鐮孢均具有良好的抑菌活性。該菌株能分泌多種胞外酶，具有解磷能力、生物膜形成能力和溶血安全性，對(duì)其他6種植物病原菌均具有抑菌活性，是一株有應(yīng)用潛力的生防菌株。接下來(lái)將進(jìn)一步探索菌株219CJK2的抑菌機(jī)理，通過(guò)盆栽試驗(yàn)檢測(cè)生防菌株實(shí)際抑菌效果和抑菌穩(wěn)定性，為生防菌的開(kāi)發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）