藺楠 胡俊月 叢龍美 杜靜婷 施俊鳳

摘要

為了明確拮抗酵母卡利比克邁耶氏酵母Meyerozyma?caribbica對果實采后病害的抑制效果及其對毒素的降解機制，本文研究了卡利比克邁耶氏酵母結(jié)合輔助因子褐藻寡糖（alginate?oligosaccharide，AOS），對草莓、梨、蘋果、番茄的青霉病、灰霉病和黑斑病的抑制效果，以及拮抗酵母不同處理液對展青霉素（patulin，PAT）體外降解的機制。結(jié)果表明，濃度為1×108?cfu/mL的M.caribbica可有效抑制草莓、梨、蘋果青霉病，草莓、番茄、葡萄灰霉病以及番茄、梨、葡萄黑斑病的發(fā)生，添加5?g/L的AOS能顯著增強M.caribbica的抑制效果;M.caribbica發(fā)酵液可以有效降解蘋果傷口處的PAT，處理后8?d其降解率為30.35%，經(jīng)AOS誘導后，其對PAT的降解效率達到39.15%。體外條件下，接種M.caribbica后27?h可將10?μg/mL的PAT完全降解;M.caribbica主要是通過活細胞代謝降解PAT，同時AOS可顯著增加M.caribbica?的降解能力，說明卡利比克邁耶氏酵母是一株生防潛力較好的菌株，本研究為該生防菌株的進一步應用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞

果實;?病原菌;?展青霉素;?拮抗酵母;?褐藻寡糖;?生物防治

中圖分類號：

S?436.611.16

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2023372

Inhibition?on?postharvest?fruit?diseases?by?Meyerozyma?caribbica?and?its?degradation?mechanism?to?patulin

LIN?Nan，?HU?Junyue，?CONG?Longmei，?DU?Jingting，?SHI?Junfeng*

（School?of?Food?Science?and?Engineering，?Shanxi?Agricultural?University，?Taiyuan?030031，?China）

Abstract

To?determine?the?inhibitory?effects?of?the?antagonistic?yeast?Meyerozyma?caribbica?on?postharvest?fruit?diseases?and?the?mechanism?of?toxin?degradation，?we?studied?the?combined?effect?of?M.caribbica?and?alginate?oligosaccharide?（AOS）?on?penicilliosis，?gray?mold，?and?black?spot?in?strawberries，?pears，?apples，?and?tomatoes.?The?mechanism?of?patulin?（PAT）?degradation?in?vitro?was?also?explored?using?different?treatment?solutions?of?antagonistic?yeast.?The?results?showed?that?M.caribbica?at?a?concentration?of?1×108?cfu/mL?could?effectively?inhibit?the?incidence?of?penicilliosis?in?strawberries，?pears，?and?apples，?gray?mold?in?strawberries，?tomatoes，?and?grapes，?and?black?spot?in?tomatoes，?pears，?and?grapes.?Adding?5?g/L?AOS?could?significantly?enhance?the?inhibitory?effect?of?M.caribbica.?The?fermentation?broth?of?M.caribbica?effectively?degraded?PAT?in?apple?wounds，?with?a?degradation?rate?of?30.35%?eight?days?after?treatment?and?39.15%?after?AOS?induction.?PAT?（10?μg/mL）?could?be?completely?degraded?by?M.caribbica?within?27?h?in?vitro.?Our?study?further?revealed?that?M.caribbica?mainly?degraded?PAT?through?intracellular?enzymes?produced?in?the?normal?metabolic?process?of?living?cells，?and?the?degradation?ability?of?M?caribbica?was?significantly?enhanced?after?AOS?induction，?highlighting?its?potential?as?a?biocontrol?strain?with?enhanced?capabilities.?This?study?lays?a?foundation?for?the?future?application?of?this?biocontrol?strain.

Key?words

fruit;?pathogen;?patulin;?antagonistic?yeast;?algal?oligosaccharide;?biological?control

在世界范圍內(nèi)，水果和蔬菜的采后損失估計超過25%，其中大部分是由于采后腐爛造成的［1］。而由機械損傷引起的病原菌侵染發(fā)病，是造成其經(jīng)濟損失的最主要原因［2］。其中擴展青霉?Penicillum?expansum侵染速度快，適應環(huán)境能力強［3］，可分泌有毒代謝產(chǎn)物展青霉素（patulin，?PAT），是一種導致果實采后病害的重要病原菌［4］。

近年來，生物防治因其安全、綠色、高效等優(yōu)點有望成為一種可替代化學殺菌劑的防治方法。目前已篩選出的具有生防效果的拮抗微生物包括細菌、真菌等［5］。其中拮抗酵母由于具有繁殖速度快、競爭能力強、營養(yǎng)需求低、不產(chǎn)生毒素、環(huán)境友好等優(yōu)點，成為當前研究熱點［6］。Hassan等［7］發(fā)現(xiàn)阿氏絲孢酵母Trichosporon?asahii對木瓜采后炭疽病具有良好的控制效果;Castoria等［8］研究發(fā)現(xiàn)紅冬孢酵母Rhodosporidium?kratochvilovae?LS11可以有效降低擴展青霉產(chǎn)生的展青霉素的濃度，可以作為抑制絲狀真菌生長的生防制劑。

褐藻寡糖（alginate?oligosaccharide，AOS）是由褐藻膠降解得到的小分子物質(zhì)，具有抗氧化性、抑菌、調(diào)節(jié)免疫活性等多種生物學功能。關(guān)于其對果實采后病害的防治已有報道。Zhuo等［9］發(fā)現(xiàn)添加濃度為50?mg/L的褐藻寡糖可以有效控制獼猴桃果實灰霉病的發(fā)病率并使其病斑直徑下降。Han等［10］將褐藻寡糖添加于拮抗酵母季也蒙畢赤酵母Pichia?guilliermondii，對梨果采后青霉病的抑制效果大大加強，防治效果提升了50.01%。而關(guān)于其與卡利比克邁耶氏酵母Meyerozyma?caribbica相結(jié)合用于果實采后病害防治尚未見相關(guān)報道。

展青霉素可以氧化損傷人類細胞導致致突變性［11］、細胞毒性［12］、致病性［13］以及遺傳毒性［14］，是對人類危害最大的真菌毒素之一，在許多水果及其衍生制品中均有發(fā)現(xiàn)［15］。近年來許多研究者嘗試用不同的手段降低食品中展青霉素及其他真菌毒素的含量［16］。目前，由于生物降解安全性高、效率高、無污染等優(yōu)點，真菌毒素的生物降解已經(jīng)成為許多研究者關(guān)注的熱點。

卡利比克邁耶氏酵母由本實驗室從蟠桃果實表面分離，并進行了形態(tài)學、生理生化和分子鑒定。本試驗主要研究不同濃度卡利比克邁耶氏酵母及添加褐藻寡糖后對不同果實采后病害的控制作用，以及卡利比克邁耶氏酵母體外降解展青霉素的機制。

1?材料與方法

1.1?供試水果

蘋果、梨、草莓、葡萄、番茄均購于山西省太原市小店區(qū)水果市場。選擇無病蟲害、無機械損傷、成熟度、大小一致的果實，于0℃下貯藏備用。

展青霉素（PAT）標準品（CAS：149291，色譜級）購自北京索萊寶科技有限公司；褐藻寡糖（CAS：?9005383，分析純）購自青島博智匯力生物科技有限公司。

1.2?酵母菌株菌懸液和病原菌孢子懸浮液制備

酵母菌菌懸液：將劃線培養(yǎng)的卡利比克邁耶氏酵母接種于NYDB培養(yǎng)基（酵母膏5?g，牛肉膏5?g，葡萄糖10?g，蒸餾水1?L），25℃，120?r/min振蕩培養(yǎng)48?h后，得到酵母菌種子液，將種子液8?000?r/min離心15?min，棄上清，用無菌水配成菌懸液。

酵母菌與褐藻寡糖（AOS）共培養(yǎng)發(fā)酵液：在NYDB培養(yǎng)基中添加不同濃度的AOS，再接入酵母菌種子液，25℃，120?r/min振蕩培養(yǎng)48?h得到AOS與NYDB共培養(yǎng)發(fā)酵液。

病原菌孢子懸浮液：將擴展青霉Penicillium?expansum、灰葡萄孢Botrytis?cinerea和鏈格孢Alternaria?alternaria在PDA平板上26℃培養(yǎng)3?d，用無菌涂布器刮取分生孢子，采用血球計數(shù)法配制成1×105?個/mL的孢子懸浮液。

1.3?不同濃度的M.caribbica菌懸液對水果采后病害的抑制

取蘋果、梨、草莓、葡萄、番茄健果，用2%?NaClO對果實表面消毒3?min，于果實赤道部位刺直徑為4?mm、深4?mm的傷口，其中蘋果、梨每果4個傷口，草莓、葡萄、番茄每果1個傷口。在傷口處分別加1×105、1×106、1×107、1×108、1×109?cfu/mL的酵母菌菌懸液50?μL，對照加等量無菌水。2?h后在傷口處分別接1×105?個/mL的P.expansum、B.cinerea和A.alternaria?20?μL，26℃下保溫培養(yǎng)7?d后測量病斑直徑并計算抑制率。抑制率=（對照病斑直徑-處理病斑直徑）/對照病斑直徑×100%。每處理10個果，試驗重復3次，取平均值。

1.4?添加褐藻寡糖的M.caribbica發(fā)酵液對水果采后病害的抑制

果實處理同1.3。在傷口處分別滴加50?μL分別添加4、4.5、5、5.5、6?g/L?AOS的M.caribbica發(fā)酵液，以對應濃度的AOS處理和M.caribbica發(fā)酵液處理為對照。2?h后在傷口處分別接種1×105?個/mL的P.expansum、B.cinerea和A.alternaria孢子懸浮液20?μL，26℃下保溫培養(yǎng)，7?d后測量病斑直徑并計算抑制率。每處理10個果，試驗重復3次，取平均值。

1.5?M.caribbica發(fā)酵液體外降解展青霉素的機制

1.5.1?M.caribbica發(fā)酵液對蘋果傷口處展青霉素積累的影響

參考Yang等［17］的方法，在蘋果上制造傷口后滴加50?μL?M.caribbica（1×108?cfu/mL）發(fā)酵液或添加5?g/L?AOS的M.caribbica發(fā)酵液，以等量無菌水為對照，2?h后接入20?μL?1×105?個/mL的P.expansum孢子懸浮液，于不同時間取傷口周圍正常果肉組織加無菌水和果膠酶過夜，乙酸乙酯萃取旋干，使用孔徑0.22?μm濾膜過濾后。采用液相色譜儀檢測展青霉素含量，紫外檢測器檢測波長：276?nm;色譜柱：Agilent?C18柱（250?mm×4.6?mm）;流動相：乙腈（10%），水（90%）;流速：1?mL/min;進樣量：20?μL。

1.5.2?M.caribbica發(fā)酵液對培養(yǎng)基中展青霉素的降解作用測定

參考Cao等［18］的方法，在50?mL?NYDB培養(yǎng)基中接入1?mL?1×108?cfu/mL?M.caribbica發(fā)酵液或添加5?g/L?AOS的M.caribbica發(fā)酵液，以加入等量無菌水作空白對照，再加入展青霉素色譜級標準品（終濃度為10?μg/mL），振蕩培養(yǎng)27?h，從6?h開始每3?h取1次樣離心取上清液過濾后測定展青霉素含量。同時用無菌水洗滌酵母菌體，液氮研磨粉碎，乙酸乙酯萃取，靜置獲得提取液，旋轉(zhuǎn)蒸干后用乙酸乙酯溶解過濾，對濾液中展青霉素的含量進行測定。測定方法同1.5.1。

1.5.3?M.caribbica活細胞和熱殺死細胞對展青霉素降解的影響

參考Zheng等［19］的方法，在50?mL?NYDB培養(yǎng)基中分別接入：1）?1?mL?M.caribbica發(fā)酵液；2）?1?mL?添加5?g/L?AOS?的M.caribbica發(fā)酵液；3）?1?mL經(jīng)熱處理（121℃滅菌30?min）的M.caribbica發(fā)酵液；4）?1?mL?添加5?g/L?AOS?的M.caribbica熱處理發(fā)酵液；5）?1?mL等量無菌水（空白對照）。上述發(fā)酵液中M.caribbica濃度均為1×108?cfu/mL。在上述5個處理中分別加入展青霉素（終濃度為10?μg/mL），振蕩培養(yǎng)27?h，從6?h開始每3?h取1次樣分為離心組與非離心組，離心組取上清過濾后檢測展青霉素含量，非離心組取培養(yǎng)液直接過濾后檢測。

1.5.4?M.caribbica發(fā)酵濾液對展青霉素的降解作用測定

參考Zheng等［19］的方法，在50?mL?NYDB培養(yǎng)基中接入1?mL?1×108?cfu/mL?M.caribbica或M.caribbica+5?g/L?AOS。以添加等量無菌水為對照，振蕩培養(yǎng)20?h后離心過濾獲得無細胞濾液，在無細胞濾液中加入一定量展青霉素（10?μg/mL），振蕩培養(yǎng)27?h，從6?h開始每3?h取1次樣離心過濾后，對展青霉素的含量進行測定。

1.5.5?展青霉素誘導下M.caribbica發(fā)酵濾液對展青霉素的降解作用測定

參考Zheng等［19］的方法，略作修改。在50?mL?NYDB培養(yǎng)基中分別加入1?mL?M.caribbica發(fā)酵液和1?mL含5?g/L?AOS?的M.caribbica發(fā)酵液，然后分別加入10?μg/mL展青霉素進行誘導培養(yǎng)，6?h后離心過濾得無細胞濾液，檢測濾液中展青霉素含量。重新取50?mL?NYDB，分別加入1?mL?上述無細胞濾液，以未進行PAT誘導的發(fā)酵液為對照，向上述4個處理組中加入展青霉素，使各處理終濃度均為10?μg/mL，上述M.caribbica發(fā)酵液濃度均為1×108?cfu/mL，振蕩培養(yǎng)27?h，從6?h開始每3?h取1次樣離心過濾后測定展青霉素含量。

1.5.6?展青霉素誘導下M.caribbica胞內(nèi)酶對展青霉素的降解作用測定

參考Zhu等［20］的方法略作修改。在50?mL?NYDB培養(yǎng)基中分別接入：1?mL?M.caribbica發(fā)酵液，或1?mL添加5?g/L?AOS?的M.caribbica發(fā)酵液，然后分別加入展青霉素，使終濃度為5?μg/mL，振蕩培養(yǎng)48?h后離心洗滌獲得菌體，從不同處理中稱取等量菌體液氮研磨，離心后的上清液為粗酶制劑，吸取一定量的上清進行檢測，確保無展青霉素殘留后重新取50?mL?NYDB培養(yǎng)基，分別接入1?mL上述經(jīng)展青霉素誘導并檢測無展青霉素殘留的粗酶制劑，以未進行展青霉素誘導的M.caribbica粗酶液，添加5?g/L?AOS?的M.caribbica粗酶液（1×108?cfu/mL）為非誘導對照，上述發(fā)酵液中M.caribbica濃度均為1×108?cfu/mL。在上述4個處理中分別加入展青霉素（終濃度為5?μg/mL），以加入無菌水為空白對照；振蕩培養(yǎng)27?h取樣離心過濾后，對展青霉素的含量進行測定。

1.5.7?放線菌酮對M.caribbica發(fā)酵液降解展青霉素的影響

參考Fu等［21］的方法，在50?mL?NYDB培養(yǎng)基中接入1?mL?1×108?cfu/mL?M.caribbica發(fā)酵液或添加5?g/L?AOS的M.caribbica發(fā)酵液，然后分別加入展青霉素，使展青霉素終濃度為10?μg/mL，分別進行3個處理：1）加入展青霉素的同時添加放線菌酮，使其終濃度為5?μg/mL;2）添加展青霉素6?h后加入放線菌酮，使其終濃度為5?μg/mL;3）不添加放線菌酮作對照，振蕩培養(yǎng)27?h，從6?h開始每?3?h?取1次樣離心過濾后，對展青霉素的含量進行測定。

1.6?數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用Excel作圖，用SPSS?22.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析，采用Duncan氏新復極差法進行差異顯著性分析，顯著水平設(shè)置為0.05。

2?結(jié)果與分析

2.1?不同濃度M.caribbica菌懸液對水果病害的抑制效果

2.1.1?對草莓、梨、蘋果青霉病的抑制效果

將不同濃度M.caribbica菌懸液接種于各種水果培養(yǎng)7?d后，由P.expansum引起的草莓、梨、蘋果采后青霉病均被抑制。隨著發(fā)酵液濃度的升高，抑制率上升。在濃度為1×105?cfu/mL時抑制率分別為26.65%、33.54%、34.54%，在濃度為1×108?cfu/mL時抑制效果最好，抑制率分別為56.49%、56.14%、54.14%。而在濃度為1×109?cfu/mL時，抑制率有所下降（圖1）。

2.1.2?對草莓、番茄、葡萄灰霉病的抑制效果

處理后7?d，M.caribbica菌懸液能顯著降低由B.cinerea引起的草莓、番茄、葡萄采后灰霉病發(fā)病率。隨著濃度的升高，對草莓、番茄、葡萄灰霉病的抑制率上升。其在濃度1×108?cfu/mL時抑制效果顯著高于其他處理組，抑制率分別為56.09%、56.54%、56.54%，與其對青霉病的抑制效果一致的是，濃度1×109?cfu/mL時抑制率顯著降低（圖2）。

2.1.3?對番茄、梨、葡萄黑斑病的抑制效果

如圖3所示，處理后7?d，M.caribbica菌懸液能顯著降低由A.alternaria引起的番茄、梨、葡萄采后黑斑病發(fā)病率。隨著濃度的升高，對番茄、梨、葡萄黑斑病的抑制率上升。在濃度為1×105?cfu/mL時抑制率較低，隨著濃度的增加，抑制率有所上升，在濃度為1×108?cfu/mL時抑制率分別為54.14%、60.14%、55.54%，與濃度為1×109?cfu/mL時相差不大。

2.2?添加褐藻寡糖的M.caribbica發(fā)酵液對水果病害的抑制效果

處理后7?d，相較于M.caribbica發(fā)酵液或AOS單獨處理，添加AOS的M.caribbica發(fā)酵液對多數(shù)果實采后病害的抑制效果顯著增強，其中AOS添加量為5.0?g/L時最佳（表1）。

添加5.0?g/L?AOS的M.caribbica發(fā)酵液對草莓、梨和蘋果青霉病的抑制率分別為80.22%、78.28%和84.29%，比不加AOS的抑制率分別提升了23.73%、22.13%和30.14%，相較于AOS單獨處理，抑制率分別提升了33.06%、27.87%、34.80%，當AOS添加量繼續(xù)增加，其抑制率反而呈下降趨勢;酵母發(fā)酵液單獨處理草莓、番茄、葡萄后其對灰霉病的抑制率為56.09%、56.55%和56.55%，添加5.0?g/L?AOS后，抑制率分別提升到了87.48%、85.39%和84.60%;添加5.0?g/L?AOS的M.caribbica發(fā)酵液對梨、番茄、葡萄黑斑病的抑制率為87.28%、88.37%和85.35%，相較于M.caribbica或5.0?g/L?AOS單獨處理，抑制率分別提升了27.13%、34.11%、29.80%和30.55%、39.03%、39.98%。

2.3?M.caribbica發(fā)酵液處理后蘋果傷口處展青霉素的積累

各處理蘋果傷口處PAT積累情況如圖4所示。圖中可看出，M.caribbica發(fā)酵液可以顯著減少蘋果傷口處PAT的積累，而添加AOS的M.caribbica發(fā)酵液對PAT的降解作用增強。M.caribbica發(fā)酵液處理后8?d?PAT的濃度為0.92?μg/mL，而添加AOS后，PAT的濃度為0.80?μg/mL，對照組PAT濃度為1.31?μg/mL。

2.4?M.caribbica發(fā)酵液在對培養(yǎng)基中展青霉素的降解作用

如圖5所示，M.caribbica發(fā)酵液和添加AOS的M.caribbica發(fā)酵液具有降解PAT的能力。M.caribbica發(fā)酵液在27?h內(nèi)，使PAT濃度從10?μg/mL下降到0.14?μg/mL，下降了98%。添加AOS的發(fā)酵液，PAT濃度在27?h內(nèi)從10?μg/mL下降到0.07?μg/mL，下降了99%，而對照組中的PAT濃度沒有明顯降低。同時發(fā)現(xiàn)，在添加和未添加AOS的情況下，菌體經(jīng)液氮粉碎后均未能檢測到PAT。由此推斷，對于PAT的降解主要依賴于活細胞作用，而非細胞吸附。

圖5?卡利比克邁耶氏酵母發(fā)酵液對PAT的體外降解作用

Fig.5?Degradation?of?PAT?in?vitro?by?Meyerozyma

caribbica?fermentation?broth

2.5?M.caribbica活細胞和熱殺死細胞對展青霉素的吸附作用

如圖6a，6b所示，經(jīng)過27?h培養(yǎng)后，M.caribbica活細胞和添加AOS的M.caribbica活細胞的2個處理組中PAT含量基本相似，表明M.caribbica活細胞細胞壁對PAT沒有吸附作用;與對照相比，M.caribbica活細胞的離心組與未離心組都對PAT有明顯的降解作用。如圖6c，6d所示，熱殺死M.caribbica細胞和添加AOS的M.caribbica熱殺死細胞的2個處理中PAT濃度無明顯變化，培養(yǎng)27?h后PAT濃度低于10%，而活細胞的降解率可以達到100%，表明M.caribbica死細胞細胞壁對PAT沒有吸附作用。由此證明PAT含量的降低并不是由于M.caribbica細胞壁吸附，可能是由于M.caribbica活細胞代謝產(chǎn)生的酶類起作用。

2.6?M.caribbica發(fā)酵濾液對展青霉素的降解作用

M.caribbica的無細胞濾液對PAT降解作用如圖7所示。培養(yǎng)27?h內(nèi)，未添加和添加AOS處理的PAT含量從10?μg/mL分別降為9.02?μg/mL和8.47?μg/mL，而對照組中PAT含量從10?μg/mL降為9.71?μg/mL，說明M.caribbica代謝產(chǎn)物不是降解PAT的主要原因。

2.7?展青霉素誘導下M.caribbica發(fā)酵濾液對展青霉素的降解作用

如圖8所示，M.caribbica或M.caribbica+AOS與PAT共培養(yǎng)6?h后，濾除M.caribbica，培養(yǎng)基中PAT含量在9?h有顯著降低，降至7.6?μg/mL和7.27?μg/mL，隨后18?h保持較平穩(wěn)狀態(tài)。而M.caribbica發(fā)酵液和添加5?g/L?AOS的M.caribbica發(fā)酵液在整個過程中一直降解PAT，6～27?h中，M.caribbica發(fā)酵液處理下PAT濃度由8.32?μg/mL降低至0.14?μg/mL，添加5?g/L?AOS的M.caribbica發(fā)酵液處理下PAT濃度由8.01?μg/mL降低至0.07?μg/mL。結(jié)果表明，PAT誘導下，M.caribbica和添加AOS的M.caribbica發(fā)酵濾液前期對PAT有一定降解作用，但作用較弱。

2.8?展青霉素刺激下M.caribbica胞內(nèi)酶對展青霉素的降解作用

如圖9所示，M.caribbica胞內(nèi)酶和添加AOS培養(yǎng)所得M.caribbica胞內(nèi)酶與PAT共培養(yǎng)27?h后，PAT終濃度為2.83?μg/mL和1.48?μg/mL，而前期經(jīng)PAT誘導培養(yǎng)的M.caribbica胞內(nèi)酶和PAT誘導并添加AOS的M.caribbica胞內(nèi)酶降解PAT的能力顯著高于未經(jīng)PAT誘導培養(yǎng)的酵母胞內(nèi)酶，其培養(yǎng)液中PAT濃度低于檢測限，顯著低于對照組和未經(jīng)PAT誘導培養(yǎng)的M.caribbica和M.caribbica+AOS處理。由此可知，經(jīng)PAT誘導培養(yǎng)的M.caribbica和M.caribbica+AOS的胞內(nèi)酶對PAT降解有重要作用。

2.9?放線菌酮對M.caribbica和M.caribbica+AOS降解PAT的影響

如圖10所示，M.caribbica和M.caribbica+AOS單獨處理組，在培養(yǎng)27?h后PAT含量顯著降低;在0?h添加PAT同時添加放線菌酮的處理組，培養(yǎng)27?h后，PAT的含量由10?μg/mL降為5.66?μg/mL和5.18?μg/mL;當添加PAT共培養(yǎng)6?h后再添加放線菌酮時，PAT的含量隨著時間延長而降低，培養(yǎng)?27?h?后2個處理組中PAT含量分別為3.60?μg/mL和3.24?μg/mL;PAT降解速率依次為未添加放線菌酮組＞6?h后添加放線菌酮組＞0?h后添加放線菌酮組，這表明放線菌酮的確會影響各酵母處理組PAT的降解速率，但并未完全阻止其對PAT的降解。

3?結(jié)論與討論

本試驗結(jié)果表明，卡利比克邁耶氏酵母M.caribbica能顯著降低草莓、梨、蘋果采后青霉病、灰霉病、黑斑病的發(fā)病率。其中濃度為1×108?cfu/mL時對病原菌抑制效果最好，對梨果實黑斑病抑制效果可達60%以上，對其他水果的抑制率也達到54%以上。

褐藻寡糖（AOS）由于其溶解性強、性質(zhì)穩(wěn)定、安全無毒等特點，在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、生活日用等方面有廣闊的應用空間［22］。王學江等［23］發(fā)現(xiàn)施用AOS可有效提高蕹菜的產(chǎn)量和品質(zhì)，在提升蕹菜凈重、株高、莖粗的同時，也提高了蕹菜中可溶性糖、可溶性蛋白、葉綠素等營養(yǎng)成分的含量;Xi等［2］發(fā)現(xiàn)，0.5%?AOS可增強拮抗酵母漢遜德巴利酵母Debaryomyces?hansenii對蘋果采后青霉病的抑制效果，發(fā)病率降至21.6%，D.hansenii單獨處理后發(fā)病率為37.5%。

一些可增強拮抗酵母菌對水果采后病害防治效果的方法已經(jīng)被廣泛應用。Li等［24］發(fā)現(xiàn)海藻糖培養(yǎng)的羅倫隱球酵母Cryptococcus?laurentii細胞內(nèi)有較高濃度的海藻糖積累，并顯著提高該酵母對蘋果青霉病的控制效果。He［25］發(fā)現(xiàn)茉莉酸甲酯誘導的季也蒙畢赤酵母Meyerozyma?guilliermondii比M.guilliermondii單獨作用控制蘋果青霉病的效果更好。本研究發(fā)現(xiàn)，AOS與拮抗酵母結(jié)合可有效控制草莓、梨、蘋果的青霉病、灰霉病和黑斑病，M.caribbica經(jīng)AOS誘導后其防治效果比單獨使用M.caribbica效果更好，對果實上PAT的降解效率更高。Zhuo［9］等采用AOS處理獼猴桃，發(fā)現(xiàn)能使寄主的抗性增強。

已有研究表明，拮抗酵母清除PAT的機制主要包括酵母細胞壁的吸附作用、酵母細胞的吸收作用、酵母分泌的胞內(nèi)酶與胞外酶的降解作用等［16，20］。本研究結(jié)果表明，M.caribbica與添加AOS的M.caribbica活細胞在體外降解PAT的效果顯著，而熱殺死細胞則不能降解PAT，說明酵母細胞壁的吸附作用不是降解PAT的主要機制，這與Yang等的研究結(jié)果相似［26］。且無論是否添加AOS，失活的酵母細胞并不能有效降解培養(yǎng)基中的PAT，而活細胞則能顯著降解（圖5），這也進一步驗證了拮抗酵母M.caribbica的細胞壁對PAT沒有吸附作用。

酵母細胞在生長代謝過程中會產(chǎn)生各種代謝物分泌到胞外。本研究中無細胞濾液始終不能有效降解PAT。而PAT與M.caribbica和M.caribbica+AOS共同培養(yǎng)6?h后，濾去細胞得到的無細胞濾液前期PAT可被降解在后續(xù)培養(yǎng)過程中不再繼續(xù)降解PAT。表明PAT誘導拮抗菌產(chǎn)生的代謝物對PAT沒有明顯的降解作用。而Zheng等［19］的研究結(jié)果表明，P.caribbica在PAT的誘導下可以產(chǎn)生大量的胞內(nèi)和胞外代謝物，可以繼續(xù)降低PAT的濃度。

另外，研究發(fā)現(xiàn)，無論是否添加AOS，酵母胞內(nèi)酶都具有降解PAT的能力。此外，酵母菌與PAT共培養(yǎng)后，其胞內(nèi)酶對PAT的降解效力大大提高。表明M.caribbica降解PAT是可誘導的，這一結(jié)果與Ianiri等［27］的研究結(jié)果相符，與PAT共培養(yǎng)的酵母對PAT表現(xiàn)出更高的降解效率，但相關(guān)降解通路研究尚少。

放線菌酮可以阻斷蛋白質(zhì)的生物合成，從而影響很多酶的正常合成。因此我們通過研究添加放線菌酮對M.caribbica和M.caribbica+AOS降解PAT能力的影響，來探究細胞中酶在分解PAT中的作用。結(jié)果顯示，無論AOS是否存在，0?h添加放線菌酮會影響M.caribbica對毒素的降解，特別是9?h后，PAT降解速率趨于平緩，27?h后PAT含量仍處于較高水平;6?h后添加放線菌酮，兩個處理組均一直保持較高降解能力，且降解效率高于0?h添加組，但低于不添加放線菌酮組。根據(jù)上述結(jié)果，我們推測在PAT的誘導下，不同處理組產(chǎn)生了一些具有降解作用的酶，這些酶對降解PAT起關(guān)鍵的作用。對于0?h添加組而言，體系中放線菌酮阻止了一些可降解的相關(guān)酶類，因此抑制了拮抗菌對PAT的降解能力。而對于6?h添加組而言，在6?h內(nèi)，在PAT的誘導下，M.caribbica已合成了降解PAT的酶類，因此6?h后再添加放線菌酮，雖然對酵母菌降解PAT的能力有一定的影響，但并不能完全抑制M.caribbica對PAT的降解。

綜上所述，本試驗研究發(fā)現(xiàn)M.caribbica能夠顯著提升果實抗病原菌的能力，且AOS能增強這種能力，但相關(guān)機制尚不清楚，Han等［10］研究發(fā)現(xiàn)，5?g/L?AOS與季也蒙邁耶氏酵母Meyerozyma?guilliermondii結(jié)合可促進酵母生長，提高梨果抗性相關(guān)酶活性和物質(zhì)含量來抑制P.expansum生長繁殖，降低梨果發(fā)病率。M.caribbica降解PAT的主要機制是M.caribbica活細胞在PAT誘導下產(chǎn)生的胞內(nèi)酶對PAT進行降解。這一結(jié)果與孫藝文［5］的研究結(jié)果相似，S.pararoseus?Y16降解PAT的機制不是由于S.pararoseus?Y16細胞壁對PAT的吸附作用，也不是由于酵母細胞的吸收作用，而是活的酵母細胞在正常代謝過程中產(chǎn)生的胞內(nèi)酶對PAT的降解作用。此外，AOS能顯著增強M.caribbica降解PAT的能力。

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