陳景超 崔海蘭 于海燕 李志玲 李香菊

摘要

牛筋草是一年生禾本科惡性雜草，在我國黃淮海流域及長江以南地區(qū)的農(nóng)田危害嚴重。草甘膦是一種優(yōu)良的非選擇性除草劑，隨著生物育種產(chǎn)業(yè)化的推進，草甘膦會逐步在玉米、大豆等作物田登記應用。育種基地抗草甘膦雜草的產(chǎn)生是其快速傳播的潛在因素。為明確三亞一育種基地牛筋草種群對草甘膦的敏感性，本研究利用生物測定、分子生物學等方法檢測了待測種群的抗性水平，并分析了可能的分子機制。結果發(fā)現(xiàn)，草甘膦對牛筋草種群的生長抑制中量為2?053.0?g/hm2（有效成分用量），抗性指數(shù)（RI）為5.0;靶標基因EPSPS的保守區(qū)域無突變，但相對表達量是敏感種群的47.4倍;抗性植株中EPSPS蛋白的濃度是敏感植株的17.1倍。以上結果表明，該牛筋草種群對草甘膦產(chǎn)生了中等水平抗性，靶標基因過量表達是其抗性機制之一。

關鍵詞

牛筋草;?草甘膦;?抗藥性;?傳播

中圖分類號：

S?451.1

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2023167

Study?of?glyphosateresistant?Eleusine?indica?in?seed?breeding?base?in?Hainan

CHEN?Jingchao，?CUI?Hailan，?YU?Haiyan，?LI?Zhiling，?LI?Xiangju*

（State?Key?Laboratory?for?Biology?of?Plant?Diseases?and?Insect?Pests，?Institute?of?Plant?Protection，

Chinese?Academy?of?Agricultural?Sciences，?Beijing?100193，?China）

Abstract

Eleusine?indica?is?an?annual?malignant?Poaceae?weeds.?This?grass?inflicts?substantial?damage?to?farmlands?in?the?HuangHuaiHai?Region?and?south?of?the?Yangtze?River.?Glyphosate，?renowned?for?its?efficacy?as?a?nonselective?herbicide，?is?gradually?finding?application?in?corn，?soybean，?and?other?crop?fields?with?the?advancement?of?biological?breeding?industrialization.?The?emergence?of?glyphosateresistant?weeds?in?seed?breeding?bases?serves?as?a?potential?factor?for?their?rapid?spread.?To?clarify?the?susceptibility?of?E.indica?to?glyphosate?in?Sanya，?Hainan?province，?wholeplant?bioassays，?target?gene?mutation，?and?expression?detection?were?conducted?to?detect?the?resistance?levels?and?mechanisms.?The?results?showed?that?the?GR50?of?this?population?was?2?053.0?g/hm2，?with?a?resistance?index?（RI）?of?5.0.?There?was?no?significant?difference?in?the?conserved?region?of?EPSPS?between?the?resistant?and?susceptible?populations.?However，?the?relative?expression?level?of?the?target?gene?EPSPS?in?the?resistant?population?was?47.4?times?of?that?in?the?susceptible?population.?In?addition，?the?EPSPS?protein?concentration?in?resistant?plants?was?17.1?times?of?those?in?susceptible?plants.?These?results?suggest?the?evolution?of?glyphosate?resistance?within?the?population，?with?one?of?the?resistance?mechanisms?involving?an?increase?in?target?protein?content?due?to?EPSPS?overexpression.

Key?words

Eleusine?indica;?glyphosate;?resistance;?spread

牛筋草Eleusine?indica?（L.）?Gaertn.，俗名蟋蟀草，是一種分布在熱帶、亞熱帶以及溫帶地區(qū)的惡性雜草［12］。牛筋草是我國華南地區(qū)果園的優(yōu)勢雜草。在黃淮海等棉花、玉米產(chǎn)區(qū)，牛筋草也是田間危害嚴重的雜草之一［3］。草甘膦是一種優(yōu)良的非選擇性除草劑，具有殺草譜廣，對環(huán)境友好等優(yōu)點，1985年在我國登記使用，主要以莖葉噴霧方式防除果園、非耕地等的雜草，也應用于茶園、棉田、稻田等作物田埂或田間定向除草。草甘膦競爭性抑制莽草酸途徑中的5烯醇丙酮酰莽草酸3磷酸合成酶（EPSPS，EC2.5.1.19），阻斷植物體內芳香族氨基酸（色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸）的合成而引起植物死亡［4］。由于長期單一使用，我國已有多個省發(fā)現(xiàn)了抗草甘膦的牛筋草種群。華南地區(qū)的果園是抗草甘膦牛筋草發(fā)生的重災區(qū)，范圍廣，抗性水平高［56］。此外，茶園、棉田、直播稻田等也發(fā)現(xiàn)零星發(fā)生的抗性種群［710］。

雜草對草甘膦的抗性主要分為兩大類，一類是靶標抗性。主要包括靶標基因EPSPS保守區(qū)域發(fā)生突變導致氨基酸替換，此外，靶標基因過表達也是一種常見的靶標抗性機制［1112］。另一類是非靶標抗性。通過改變植株葉片等器官組織的生理結構以及快速壞死等應激反應，來降低草甘膦的吸收與轉導是最為常見的非靶標抗性機制［13］。另外一種機制是將草甘膦代謝為無毒的乙醛酸和氨甲基膦酸等物質從而產(chǎn)生抗性［14］。

2020年以來，具有耐草甘膦性狀的多個轉基因玉米、大豆轉化體獲得我國農(nóng)業(yè)轉基因生物生產(chǎn)應用安全證書［15］。隨著我國生物育種產(chǎn)業(yè)化的逐步推進，草甘膦的應用范圍將會擴大。阻斷抗草甘膦雜草向轉基因作物田傳播，對轉基因作物及草甘膦的長期應用都至關重要。育種基地抗草甘膦雜草的防除及種子檢疫是阻斷其快速傳播的重要手段。本研究從海南某育種基地采集了疑似對草甘膦產(chǎn)生抗性的牛筋草種子，對其抗性水平和分子抗性機制進行了研究，研究結果可為育種基地雜草防除策略提供參考。

1?材料與方法

1.1?供試試劑及種子材料

41％草甘膦異丙胺鹽水劑，拜耳股份公司;植物總RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、2×PCR?Mix、DL?Marker?2000購于天根生化有限公司;引物訂購于生工生物工程（上海）股份有限公司;酵母提取物、胰蛋白胨、瓊脂糖等一般化學試劑購于北京索萊寶科技有限公司，均為國產(chǎn)分析純或化學純。

疑似對草甘膦產(chǎn)生抗性的牛筋草種群采集自海南省三亞市天涯區(qū)育種基地，敏感種群采自附近無草甘膦施用歷史的荒地。

1.2?牛筋草對草甘膦的敏感性及體內的莽草酸含量測定

選取成熟飽滿一致的牛筋草種子，用1%的赤霉素溶液浸泡24?h。洗凈后播種到盛有土壤表層土：有機質（3∶1）混合土壤的方形花盆中（7?cm×7?cm），置于L∥D=12?h∥12?h的溫室內培養(yǎng)，光照時溫度（27±4）℃，相對濕度（60±20）%;黑暗時溫度（20±4）℃，相對濕度（50±20）%［16］。選取生長一致的牛筋草，每盆保留8株備用。牛筋草生長至5～6葉期時莖葉噴霧處理。草甘膦施用劑量為0（清水對照）、225、450、900、1?800、3?600、7?200、14?400?g/hm2，每處理重復4次，噴霧后繼續(xù)光暗交替培養(yǎng)，14?d后剪取各濃度處理植株地上部分稱量鮮重。

將抗性與敏感種群牛筋草培養(yǎng)至5～6葉期，分別噴施草甘膦（1?800?g/hm2）及清水對照，在第1、3、5、7天，剪取地上葉片，參照婁遠來等的方法［17］檢測葉片中莽草酸的含量，并比較不同處理間的差異。

1.3?牛筋草中EPSPS擴增和測序

隨機剪取20株抗性植株的新鮮葉片保存于-80℃冰箱。按照說明書的步驟使用試劑盒提取DNA，利用Primer?5.0設計引物擴增包含常見突變位點的EPSPS目的片段，長度為461?bp。上游引物為：5′AGATAAGAAGCAGCCGCCTT3′；下游引物為5′GCACTCCATCAAGCACATAACT3′。

PCR反應體系25?μL，包含2×Taq?PCR?Master?Mix?12.5?μL，去離子水9.5?μL，10?μmol/L上、下游引物各1?μL，DNA模板1?μL。反應程序為：94℃?5?min；94℃?40?s，55℃?30?s，72℃?30?s，循環(huán)30次；?72℃?7?min。

PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定之后送交生工生物工程（上海）股份有限公司測序，根據(jù)序列和峰圖判斷突變類型及純合性。

1.4?牛筋草抗性和敏感種群中EPSPS基因表達分析

分別剪取8～10抗性植株與敏感植株的新鮮葉片保存至-80℃冰箱。利用常規(guī)方法提取葉片的RNA并反轉錄。利用Oligo?7.0設計EPSPS基因的熒光定量PCR引物，上游引物EF：5′CTGATGGCTG

CTCCTTTAGCTC3′；下游引物ER：5′CCCAGCTATCAGAATGCTCTGC3′。選取ALS基因作為內參基因，上游引物ALSF：5′GCAATTTCCCCAG

TGACGACC3′；下游引物ALSR：5′GCAAAAGCCTCTATCTTCCCTGT3′。利用常規(guī)方法繪制引物的標準曲線。利用2-△△Ct的方法檢測靶標基因EPSPS的表達量，ΔΔCt=［（Ct待測靶標-Ct待測ALS）-（Ct敏感靶標-Ct敏感ALS）］［18］。

結果為待測植株EPSPS表達量相對于敏感植株EPSPS表達量的倍數(shù)。

1.5?酶聯(lián)免疫試劑盒檢測EPSPS含量

取0.1?g牛筋草葉片（抗性與敏感種群各檢測10株）液氮研磨成粉末轉移至1.5?mL離心管，加入250?mL樣品提取液，振蕩混勻離心取上清，待測。用2?mL樣品提取液溶解EPSPS標準品配制成32?μg/L的溶液，梯度稀釋制成16、8、4、2、1?μg/L標準溶液;將100?μL空白對照（樣品提取液）/標準品/待測樣品對應的上清加入微孔，輕輕振蕩混勻，25℃避光環(huán)境中反應45?min;將孔內液體甩干、洗滌、拍干，重復3次;加入抗體工作液（100?μL/孔），輕輕振蕩混勻，25℃避光孵育30?min;加入酶標抗體（100?μL/孔），振蕩混勻，25℃避光反應45?min;加入顯色劑（100?μL/孔），置于25℃避光反應15?min;加入終止液（100?μL/孔），輕輕振蕩混勻;酶標儀測定每孔OD450?nm值。根據(jù)標準品的OD值繪制標準曲線;通過標準曲線和檢測樣品的OD值計算出待測樣品中EPSPS的濃度［19］。

1.6?數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所得的數(shù)據(jù)通過統(tǒng)計軟件SigmaPlot?12.0（Systat?Software，?San?Jose，?CA.）進行非線性回歸擬合，模型為Y=C+（D-C）/［1+（X/X0）b］，式中Y代表鮮重抑制率，X代表處理劑量，X0代表GR50，b代表曲線在X0處的斜率，D代表待測指標上限，C代表待測指標下限［20］?？剐灾笖?shù)（RI）計算方法為疑似抗性種群的GR50與敏感種群GR50的比值。不同種群之間EPSPS基因的相對表達量、蛋白含量差異通過軟件SPSS?13.0?（SPSS，?Chicago，?USA）分析。

2?結果與分析

2.1?疑似抗性和敏感牛筋草種群的抗性水平與莽草酸含量

隨著草甘膦劑量的增加，抗性種群與敏感種群受抑制的程度明顯不同。在900?g/hm2的劑量處理后14?d，抗性植株鮮重是對照植株的77.6%，敏感植株鮮重僅為對照的39.6%。當劑量達到1?800?g/hm2時，敏感植株全部死亡，而抗性植株的鮮重為對照植株的47.6%。草甘膦對抗性種群的GR50為2?053.0?g/hm2，抗性指數(shù)（RI）為5.0，表明該種群對草甘膦產(chǎn)生了中等水平的抗性（圖1）。草甘膦1?800?g/hm2處理牛筋草植株后第5天，敏感種群植株的莽草酸濃度顯著升高（345.7?μg/g，P<0.05），是抗性植株的2.2倍（圖2）。抗性植株體內的莽草酸濃度與對照植株無顯著差異（P>0.05）。

2.2?EPSPS基因的突變檢測

從抗性種群中隨機選取20株，敏感種群中選取10株牛筋草檢測EPSPS基因保守區(qū)域是否存在突變。通過DNA測序得到的測序峰圖判斷突變位點的純合性。結果表明，所檢測抗性植株序列和峰圖（圖3）與敏感植株無差異，表明抗性植株的EPSPS核苷酸序列均未發(fā)生突變。

2.3?抗性和敏感牛筋草中EPSPS表達量分析

為明確抗性種群牛筋草植株中是否存在靶標基因EPSPS過表達，本研究檢測了抗性與敏感種群中EPSPS基因的表達水平。結果表明，抗性種群植株中EPSPS的表達量顯著增加，其相對表達量是敏感種群的47.4倍（圖4）。

2.4?抗性和敏感牛筋草中EPSPS蛋白含量

為了確定EPSPS基因表達量的變化對酶含量

的影響，本研究利用研發(fā)的牛筋草EPSPS酶聯(lián)免疫試劑盒檢測了抗性和敏感種群中EPSPS蛋白含量，結果發(fā)現(xiàn)，抗性植株中EPSPS蛋白含量為3.3?μg/g，

是敏感植株的17.1倍。這表明EPSPS基因在抗性植株的過量表達導致了該蛋白濃度的升高（圖5）。

3?結論與討論

近10年來，國內多個科研機構對分布在華南地區(qū)果園、黃淮海及長江流域棉田等作物田的牛筋草種群進行了抗性檢測。2012年就發(fā)現(xiàn)廣東省果園牛筋草對草甘膦產(chǎn)生抗性［5］。近期又有報道廣西壯族自治區(qū)甘蔗田牛筋草對草甘膦產(chǎn)生了較高水平的

抗性，可達109倍，甚至對莠去津等除草劑產(chǎn)生了多抗性［6］。黃河流域及長江流域部分棉田的牛筋草種群對草甘膦也產(chǎn)生不同程度的抗性，其中湖北地區(qū)部分種群的抗性指數(shù)可以達到14.4，湖南棉田部分種群的抗性水平可以達到10.2［7］。雖然不同報道使用的生物測定方法不一，但是均證實對草甘膦有抗性的種群已經(jīng)產(chǎn)生。本研究發(fā)現(xiàn)位于三亞育種基地的牛筋草對草甘膦的抗性水平為5.0，屬于中等水平抗性。

國內外大量研究發(fā)現(xiàn)，靶標基因EPSPS發(fā)生突變是雜草對草甘膦產(chǎn)生抗性的機制之一。發(fā)生氨基酸替換的位置常在106位，如P106S、P106T、P106A、P106L，與敏感種群相比，這些突變使雜草對草甘膦產(chǎn)生的抗性水平相對較低，抗性倍數(shù)在2～5之間。2015年，在馬來西亞首次發(fā)現(xiàn)了發(fā)生雙重突變（T102I和P106S）的抗性牛筋草，且抗性水平很高，可以在21?600?g/hm2的草甘膦劑量處理下存活［21］。隨后在我國也發(fā)現(xiàn)了具有相同突變類型的牛筋草種群，對草甘膦也能產(chǎn)生較高水平抗性（抗性倍數(shù)可以達到13.4倍）［22］。EPSPS基因過量表達是另一種靶標抗性機制，EPSPS過表達與其在染色體上的拷貝數(shù)增加有關。目前報道的靶標擴增機制中EPSPS的相對拷貝數(shù)是可變的。如與敏感植株相比，長芒莧Amaranthus?palmeri的拷貝數(shù)從2到160倍不等，而在地膚Bassia?scoparia中，拷貝數(shù)低至2～9倍，大多數(shù)雜草EPSPS拷貝數(shù)與其表達量正相關［23］。另外，Zhang等

利用基因組測序分析證實EPSPS基因在染色體亞端粒位置發(fā)生了拷貝數(shù)擴增變異［24］。此外，

牛筋草EPSPS啟動子片段長度的改變也顯著提高了EPSPS在抗性種群中的表達量［25］。

隨著草甘膦在我國登記應用范圍的擴大，草甘膦的使用頻率和使用量將有明顯的提高。最新研究顯示，我國玉米田牛筋草等主要禾本科雜草對草甘膦表現(xiàn)敏感［26］。切斷抗草甘膦雜草向新登記應用作物田的傳播是防止抗草甘膦雜草迅速蔓延的重要手段。在繁種基地的田埂等草甘膦已經(jīng)長期使用的區(qū)域，可以采用不同作用方式的除草劑輪換應用除草，或采用物理除草、人工除草等方式，避免抗草甘膦雜草的產(chǎn)生，杜絕育種基地成為抗草甘膦雜草的潛在傳播源頭。

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（責任編輯：楊明麗）