謝帆 龔順 王澤瓊 肖玉雄 杜志強(qiáng) 仝鑄 何秀娟 邱文明 孫中海 潘志勇 肖翠

果蔬園藝作物種質(zhì)創(chuàng)新與利用全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?武漢?430070;?3.?宜昌三峽百景宜農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司，?宜昌?443600）

摘要

柑橘黃龍病是對(duì)柑橘產(chǎn)業(yè)最具毀滅性的病害，目前沒有可用的有效藥劑和抗病品種，分子檢測(cè)對(duì)黃龍病有效防控至關(guān)重要。本研究對(duì)國(guó)內(nèi)外常用的常規(guī)PCR和巢式PCR檢測(cè)引物進(jìn)行評(píng)價(jià)，針對(duì)多拷貝的nrdB和16S?rDNA基因，構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品并篩選適用于絕對(duì)定量PCR的最佳質(zhì)粒。結(jié)果表明，使用Es?Taq?MasterMix對(duì)感染?Candidatus?Liberibacter?asiaticus?（CLas）的柑橘樣品進(jìn)行常規(guī)PCR檢測(cè)時(shí)，在評(píng)價(jià)的16對(duì)引物中，OI1/OI2c、Las606/LSS和HLBF468/R877靈敏度最高，推薦同時(shí)使用檢測(cè)黃龍病菌含量低的樣品；各組巢式PCR檢測(cè)引物有其適用擴(kuò)增體系，部分引物用Es?Taq?MasterMix擴(kuò)增時(shí)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，F(xiàn)1/B1→F3/B3則適用Es?Taq?MasterMix體系，且最高可穩(wěn)定特異檢出105倍稀釋感染CLas柑橘總DNA樣品（2×10-3?ng/μL），是靈敏度最高的引物組，OI1/OI2c→S3/S4在Es?Taq?MasterMix和Ex?Taq?DNA聚合酶體系中均可穩(wěn)定特異檢出104倍稀釋感染CLas柑橘總DNA樣品（2×10-2?ng/μL），是適用擴(kuò)增體系最廣的引物組；構(gòu)建的5個(gè)絕對(duì)定量PCR質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品中，pnrdB83擴(kuò)增效率最接近100%，且在2次重復(fù)試驗(yàn)中波動(dòng)最小，穩(wěn)定性最強(qiáng)，并且作為標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)黃龍病待測(cè)樣品進(jìn)行絕對(duì)定量時(shí)，各樣品在2次重復(fù)試驗(yàn)中的拷貝數(shù)差值最小，是本研究篩選的最佳質(zhì)粒。本研究的結(jié)果將為柑橘黃龍病菌的定性和定量分子檢測(cè)提供參考。

關(guān)鍵詞

柑橘黃龍病;?常規(guī)PCR;?巢式PCR;?絕對(duì)定量PCR;?引物評(píng)價(jià)

中圖分類號(hào)：

S?436.661.12

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2023396

Molecular?detection?primer?evaluation?and?absolute?quantitative?PCR?system?optimization?of?Candidatus?Liberibacter?asiaticus?（CLas）

XIE?Fan1，2#，?GONG?Shun1，2#，?WANG?Zeqiong1，?XIAO?Yuxiong1，?DU?Zhiqiang3，?TONG?Zhu1，HE?Xiujuan1，?QIU?Wenming1，?SUN?Zhonghai1，?PAN?Zhiyong2，?XIAO?Cui1*

（1.?Hubei?Key?Laboratory?for?Germplasm?Innovation?and?Utilization?of?Fruit?Trees，?Institute?of?Fruit?and?Tea，?Hubei?Academy

of?Agricultural?Sciences，?Wuhan?430064，?China;?2.?National?Key?Laboratory?for?Germplasm?Innovation?and?Utilization?of

Horticultural?Crops，?College?of?Horticulture?and?Forestry?Sciences，?Huazhong?Agricultural?University，?Wuhan?430070，?China;

3.?Yichang?Three?Gorges?Baijingyi?Agricultural?Science?and?Technology?Development?Co.，?Ltd.，?Yichang?443600，?China）

Abstract

Citrus?Huanglongbing?（HLB）?is?the?most?devastating?disease?for?the?citrus?industry.?Currently，?there?are?no?effective?cure?and?diseaseresistant?varieties?available.?Molecular?detection?is?crucial?for?the?effective?prevention?and?management?of?Huanglongbing.?In?this?study，?we?evaluated?the?commonly?and?worldwidely?employed?primers?for?conventional?PCR?and?nested?PCR?detection，?and?constructed?plasmid?standards?based?on?multiplecopy?nrdB?and?16S?rDNA?genes，?and?then?screened?the?best?plasmids?suitable?for?absolute?quantitative?PCR.?The?results?showed?that?among?the?16?pairs?of?primers?evaluated?in?this?study，?OI1/OI2c，?Las606/LSS?and?HLBF468/R877?had?the?highest?sensitivity?when?using?Es?Taq?MasterMix?for?conventional?PCR?detection?of?Candidatus?Liberibacter?asiaticus?（CLas）?infecting?citrus?samples，?which?was?recommended?to?detect?samples?with?low?CLas?titer.?Each?nested?PCR?detection?primer?had?their?applicable?amplification?systems，?and?some?primers?showed?strong?nonspecific?amplification?when?amplified?with?Es?Taq?MasterMix，?while?F1/B1→F3/B3?were?suitable?for?Es?Taq?MasterMix?system，?and?could?stably?and?specifically?detect?the?105fold?diluted?citrus?total?DNA?samples?（2×10-3?ng/μL）?infected?with?CLas，?which?was?the?primer?set?with?the?highest?sensitivity.?OI1/OI2c→S3/S4?could?stably?and?specifically?detect?104fold?diluted?citrus?total?DNA?samples?（2×10-2?ng/μL）?infected?with?CLas?both?in?Es?Taq?MasterMix?and?Ex?Taq?DNA?polymerase?systems，?which?was?the?primer?set?with?the?widest?applicable?amplification?systems.?Among?the?five?plasmid?standards?constructed?for?absolute?quantitative?PCR，?pnrdB83?was?the?best?plasmid?whose?amplification?efficiency?was?closest?to?100%?and?with?the?least?fluctuation?and?strongest?stability?between?two?repeated?experiments.?Besides，?when?used?pnrdB83?as?a?standard?for?absolute?quantification?of?Huanglongbing?samples，?the?copy?number?difference?of?each?sample?between?the?two?repeated?experiments?is?the?smallest.?The?results?will?provide?a?reference?for?qualitative?and?quantitative?molecular?detection?of?CLas.

Key?words

citrus?Huanglongbing;?conventional?PCR;?nested?PCR;??absolute?quantitative?PCR;?primer?evaluation

柑橘是世界第一大水果［1］，目前我國(guó)柑橘產(chǎn)業(yè)規(guī)模位居世界首位，產(chǎn)量占世界的1/3左右［2］，是我國(guó)南方鄉(xiāng)村振興的支柱產(chǎn)業(yè)［3］。柑橘黃龍病是對(duì)柑橘產(chǎn)業(yè)最具毀滅性的病害，其病原菌是無(wú)法在培養(yǎng)基上分離培養(yǎng)的韌皮部桿菌屬Candidatus?Liberibacter細(xì)菌［4］。柑橘受到黃龍病菌侵染后樹體長(zhǎng)勢(shì)嚴(yán)重削弱，植株表現(xiàn)葉片斑駁黃化，果實(shí)畸形且著色不均等癥狀［57］，目前沒有針對(duì)黃龍病的有效藥劑和抗病品種［8］，主要通過嚴(yán)格檢疫、及時(shí)砍除病樹、應(yīng)用無(wú)病苗木、防治傳播媒介柑橘木虱進(jìn)行防控［3，910］。

嚴(yán)格檢疫和及時(shí)砍除病樹等黃龍病防控措施均需依靠對(duì)黃龍病的準(zhǔn)確診斷。黃龍病田間診斷多以葉片斑駁黃化、“紅鼻子果”等典型癥狀作為判斷依據(jù)，但除結(jié)果期的“紅鼻子果”外，葉片癥狀也可能由缺素等引起，故田間診斷只能作為初步判斷依據(jù)。處于黃龍病潛伏期和早期無(wú)癥狀的柑橘植株，則需要使用更為有效的分子檢測(cè)進(jìn)行診斷。常規(guī)PCR、巢式PCR、熒光定量PCR是目前各實(shí)驗(yàn)室常用的柑橘黃龍病菌分子檢測(cè)方法。16S?rDNA基因、β操縱子（rplKAJLrpoBC）和外膜蛋白基因（OMP）等保守看家基因被作為分子檢測(cè)靶標(biāo)廣泛用于柑橘黃龍病菌常規(guī)PCR和巢式PCR檢測(cè)的特異引物設(shè)計(jì)［10］。常規(guī)PCR和巢式PCR可以對(duì)黃龍病菌進(jìn)行定性檢測(cè)，但由于黃龍病菌在柑橘植株體內(nèi)分布不均，各分子檢測(cè)所用組織部位不同，引物靈敏度各異，PCR反應(yīng)受模板DNA質(zhì)量和濃度、擴(kuò)增反應(yīng)體系和程序等影響，易導(dǎo)致同一樣品在不同實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果不一致而出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性。相比常規(guī)PCR和巢式PCR，定量PCR靈敏度更高，且可對(duì)病原菌含量進(jìn)行定量。Li等以16S?rDNA基因?yàn)榉肿影袠?biāo)，設(shè)計(jì)了柑橘黃龍病菌亞洲種、非洲種和美洲種特異的熒光定量PCR引物和探針［11］，并建立了絕對(duì)定量PCR體系［12］。為了提高檢測(cè)靈敏度，Zheng等針對(duì)具有5個(gè)拷貝的nrdB基因設(shè)計(jì)了RNRf/RNRr引物，檢測(cè)靈敏度可提高3倍［13］，但基于該引物的qPCR體系僅通過Ct值分析進(jìn)行黃龍病菌的定量，沒有建立相應(yīng)的絕對(duì)定量PCR體系。

本研究固定取樣部位和模板DNA濃度，經(jīng)qPCR檢測(cè)后，篩選陽(yáng)性樣品DNA并混合為單一黃龍病菌陽(yáng)性樣品，用此樣品對(duì)國(guó)內(nèi)外常用的常規(guī)PCR和巢式PCR分子檢測(cè)引物進(jìn)行評(píng)價(jià)，分別篩選靈敏度高、特異性好、穩(wěn)定性強(qiáng)的檢測(cè)引物，為柑橘黃龍病菌常規(guī)定性分子檢測(cè)提供參考。同時(shí)針對(duì)具有5個(gè)拷貝的nrdB基因和3個(gè)拷貝16S?rDNA基因，分別構(gòu)建質(zhì)粒和絕對(duì)定量PCR體系并進(jìn)行評(píng)價(jià)，篩選適用于定量檢測(cè)黃龍病菌的最佳質(zhì)粒及引物，為柑橘黃龍病菌定量分子檢測(cè)提供參考。

1?材料與方法

1.1?供試樣品

常規(guī)PCR和巢式PCR檢測(cè)引物評(píng)價(jià)試驗(yàn)所用柑橘黃龍病陽(yáng)性樣品采集自廣西壯族自治區(qū)北海市合浦縣沙田鎮(zhèn)柑橘黃龍病重癥果園，品種為‘愛媛28號(hào)，植株具有典型黃龍病癥狀。取植株上黃龍病菌高度富集的主葉脈和葉柄，參考本實(shí)驗(yàn)室改良的CTAB法［14］提取樣本DNA。用超微量核酸濃度測(cè)定儀測(cè)定樣品DNA濃度，并統(tǒng)一定量至200?ng/μL，用1％瓊脂糖凝膠電泳檢查DNA濃度定量準(zhǔn)確性以及DNA質(zhì)量。用高靈敏度引物RNRr/RNRf［13］對(duì)樣品DNA進(jìn)行qPCR檢測(cè)，以本實(shí)驗(yàn)室人工氣候箱中實(shí)生播種，經(jīng)qPCR檢測(cè)為黃龍病陰性的桃葉橙DNA作為陰性對(duì)照，以超純水作為清水對(duì)照，每樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。根據(jù)qPCR檢測(cè)結(jié)果，將Ct值≤20，且熔解曲線吸收峰為單峰的樣品確定為黃龍病陽(yáng)性樣品，并將這些陽(yáng)性樣品DNA混合，以獲得足量單一黃龍病菌陽(yáng)性樣品DNA用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2?常規(guī)PCR檢測(cè)引物評(píng)價(jià)

根據(jù)黃龍病菌常規(guī)PCR檢測(cè)相關(guān)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)以及國(guó)家發(fā)明專利，收集了16對(duì)PCR檢測(cè)引物進(jìn)行比較，引物由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成（表1）。對(duì)上述黃龍病陽(yáng)性樣品DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋，取101，102，103，104，105，106，107，108，109倍稀釋的黃龍病陽(yáng)性樣品DNA分別作為模板進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，以本實(shí)驗(yàn)室人工氣候箱中實(shí)生播種，經(jīng)qPCR檢測(cè)為黃龍病陰性的桃葉橙DNA作為陰性對(duì)照，以超純水作為清水對(duì)照。反應(yīng)體系：2×Es?Taq?MasterMix（Dye）12.5?μＬ，10?μmol/L上、下游引物各1?μＬ，模板DNA?1.25?μＬ，ddH2O補(bǔ)足至總體積25?μＬ。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2?min；94℃變性30?s，53～67℃退火30?s（各引物退火溫度見表1），72℃延伸15～45?s（延伸時(shí)間根據(jù)各引物擴(kuò)增片段大小進(jìn)行調(diào)整，各引物擴(kuò)增片段大小見表1），35個(gè)循環(huán)；72℃延伸2?min。反應(yīng)完成后，取10?μL?PCR產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠中電泳，并于凝膠成像儀中觀察拍照。

1.3?巢式PCR檢測(cè)引物評(píng)價(jià)

根據(jù)黃龍病菌巢式PCR檢測(cè)相關(guān)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，收集了5組巢式/半巢式PCR檢測(cè)引物，此外根據(jù)βoperon基因序列對(duì)P535f/r、P400f/r兩對(duì)引物序列進(jìn)行糾正，設(shè)計(jì)P535CORf/r、P400CORf/r兩對(duì)引物，引物由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成（表2）。分別采用Es?Taq?MasterMix（Dye）和Ex?Taq?DNA?Polymerase（TaKaRa）反應(yīng)體系進(jìn)行比較。Es?Taq?MasterMix（Dye）的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照1.2常規(guī)PCR檢測(cè)。Ex?Taq?DNA?Polymerase（TaKaRa）反應(yīng)體系：TaKaRa?Ex?Taq（5?U/μＬ）?0.125?μＬ，10×Ex?Taq?Buffer（Mg2+?plus）（20?mmol/L）?2.5?μＬ，dNTPs（各2.5?mmol/L）?2?μＬ，10?μmol/L上、下游引物各1?μＬ，模板DNA?1.25?μＬ，ddH2O補(bǔ)足至總體積25?μＬ；反應(yīng)條件為：98℃變性10?s，53～62℃退火30?s（各引物退火溫度見表2），72℃延伸30～60?s（延伸時(shí)間根據(jù)各引物擴(kuò)增片段大小進(jìn)行調(diào)整，各引物擴(kuò)增片段大小見表2），35個(gè)循環(huán)。兩種反應(yīng)體系第1輪PCR擴(kuò)增模板為10倍梯度稀釋系列（101～109）黃龍病陽(yáng)性樣品DNA、黃龍病陰性對(duì)照和清水對(duì)照，第2輪PCR擴(kuò)增模板為第一輪PCR產(chǎn)物的25倍稀釋液。反應(yīng)完成后，取10?μL?PCR產(chǎn)物于1.2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳（TaKaRa?Ex?Taq?DNA?Polymerase?PCR產(chǎn)物需加入2?μL?6×Loading?buffer混勻后再上樣），電泳結(jié)束后于凝膠成像儀中觀察拍照。

1.4?絕對(duì)定量PCR質(zhì)粒構(gòu)建及標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

圍繞具有5個(gè)拷貝的nrdB基因以及具有3個(gè)拷貝的16S?rDNA基因構(gòu)建質(zhì)粒。針對(duì)nrdB基因設(shè)計(jì)2對(duì)新引物RNRn1f/RNRn1r和RNRn2f/RNRn2r進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段大小分別為?83?bp?和113?bp，同時(shí)對(duì)文獻(xiàn)已報(bào)道的引物RNRf/RNRr［13］，HLBas/HLBr［1112］，OI1/OI2c［15］進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段大小分別為81、76?bp和1?160?bp。將PCR擴(kuò)增獲得的目的片段，經(jīng)膠回收純化后，通過TA克隆，克隆到pCloneEZTA（1?865?bp）載體中，挑取陽(yáng)性克隆經(jīng)測(cè)序確定后獲得用于絕對(duì)定量PCR的重組質(zhì)粒，分別命名為pnrdB83（1?948?bp），pnrdB113（1?978?bp），pnrdB81（1?946?bp），p16SrDNA76?（1?941?bp），p16SrDNA1160（3?025?bp），其質(zhì)粒濃度分別為123.35，118.55，140.25，255.00，121.05?ng/μL。根據(jù)公式每微升拷貝數(shù)（拷貝/μL）=［質(zhì)粒濃度（ng/μL）×10-9×6.02×1023］/（質(zhì)粒DNA長(zhǎng)度×660），計(jì)算上述質(zhì)粒的拷貝數(shù)，進(jìn)而計(jì)算出質(zhì)?？截悢?shù)的對(duì)數(shù)值分別為10.76，10.74，10.82，11.08，10.56。對(duì)上述各質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，取102～107倍梯度稀釋的pnrdB83、pnrdB113、pnrdB81質(zhì)粒DNA分別作為模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，取103～108倍梯度稀釋的p16SrDNA76質(zhì)粒DNA作為模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，取103～107倍梯度稀釋的p16SrDNA1160質(zhì)粒DNA作為模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，以本實(shí)驗(yàn)室人工氣候箱中實(shí)生播種，經(jīng)qPCR檢測(cè)為黃龍病陰性的桃葉橙DNA作為陰性對(duì)照，以超純水作為清水對(duì)照，設(shè)置3孔機(jī)械重復(fù)，兩次重復(fù)試驗(yàn)（第2次重復(fù)試驗(yàn)將p16SrDNA76質(zhì)粒稀釋為133.85?ng/μL，其質(zhì)?？截悢?shù)的對(duì)數(shù)值為10.80，取102～107倍梯度稀釋的質(zhì)粒DNA作為模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增）。pnrdB83，pnrdB113，pnrdB81，p16SrDNA76質(zhì)粒構(gòu)建的目的片段擴(kuò)增引物直接用于它們的qPCR反應(yīng)，p16SrDNA1160質(zhì)粒的qPCR反應(yīng)引物為HLBas/HLBr。qPCR反應(yīng)體系：2×SYBR?Green?qPCR?Mix（莫納生物）5μL，10?μmol/L上、下游引物各0.2?μＬ，質(zhì)粒DNA?1?μＬ，ddH2O補(bǔ)足至總體積10?μＬ。qPCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性10?s，60～62℃退火10?s（各引物退火溫度見表3），72℃延伸15?s，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線分析：95℃?15?s（1.6℃/s），60℃?1?min（1.6℃/s），95℃?15?s（0.15?℃/s）。反應(yīng)完成后，以質(zhì)?？截悢?shù)的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)（Y），Ct值為橫坐標(biāo)（X），利用Excel進(jìn)行線性回歸分析繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得線性回歸方程并計(jì)算相關(guān)系數(shù)R2，根據(jù)公式（10-斜率-1）計(jì)算擴(kuò)增效率（AE：amplification?efficiency）。

1.5?絕對(duì)定量PCR體系在田間樣品黃龍病菌含量分析中的應(yīng)用

對(duì)實(shí)驗(yàn)室前期經(jīng)常規(guī)PCR（引物：OI1/OI2c）和qPCR（引物：RNRf/RNRr）Ct值分析確定的19個(gè)黃龍病陽(yáng)性DNA樣品［14］進(jìn)一步進(jìn)行絕對(duì)定量PCR分析。分別對(duì)pnrdB83，pnrdB113，pnrdB81，p16SrDNA76，p16SrDNA1160等5個(gè)質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，利用各質(zhì)粒對(duì)應(yīng)的qPCR引物對(duì)各質(zhì)粒的梯度稀釋液和19個(gè)黃龍病陽(yáng)性DNA樣品（200?ng/μL）進(jìn)行qPCR反應(yīng)，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參考1.4，設(shè)置3孔機(jī)械重復(fù)，2次重復(fù)試驗(yàn)。反應(yīng)完成后，以質(zhì)?？截悢?shù)的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)（Y），Ct值為橫坐標(biāo)（X），利用Excel進(jìn)行線性回歸分析繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得線性回歸方程，將各待測(cè)樣品的Ct值代入線性回歸方程中計(jì)算出各待測(cè)樣品DNA拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值。

2?結(jié)果與分析

2.1?常規(guī)PCR檢測(cè)引物特異性和靈敏度比較

以同一黃龍病陽(yáng)性柑橘總DNA的10倍梯度稀釋樣品為模板，使用Es?Taq?MasterMix（Dye）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，評(píng)價(jià)本研究收集的柑橘黃龍病菌常規(guī)PCR檢測(cè)引物。結(jié)果如圖1所示：?1）Hlbsf/Hlbsr有很強(qiáng)的非特異性擴(kuò)增且不能擴(kuò)增到目的條帶（507?bp），HLBF/R和CalsppsecF/R在陰性對(duì)照、清水對(duì)照以及所有梯度稀釋樣品中均能擴(kuò)增到目的條帶，這3對(duì)引物不適宜使用Es?Taq?MasterMix（Dye）進(jìn)行柑橘黃龍病菌PCR檢測(cè)。2）其余13對(duì)引物中，OI1/OI2c、Las606/LSS、HLBF468/R877靈104倍稀釋（濃度為2×101～2×10-2?ng/μL）感染CLas柑橘總DNA樣品。?3）引物組OI1/OI2c→S3/S4在兩種反應(yīng)體系中均可穩(wěn)定特異檢出101～104倍稀釋（濃度為2×101～2×10-2?ng/μL）樣品，用Ex?Taq?DNA?Polymerase進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)偶爾可檢出濃度低于2×10-2?ng/μL?的樣品。4）引物組fD1/rD1→OI1/OI2c利用Es?Taq?MasterMix（Dye）進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)最高可穩(wěn)定特異檢出104倍稀釋樣品（2×10-2?ng/μL），利用Ex?Taq?DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)最高可穩(wěn)定特異檢出103倍稀釋樣品（2×10-1?ng/μL），偶爾可檢出濃度低于2×10-1?ng/μL?的樣品。5）引物組F1/B1→F3/B3利用Es?Taq?MasterMix（Dye）進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)最高可穩(wěn)定特異檢出105倍稀釋樣品（2×10-3?ng/μL），偶爾可檢出濃度低于2×10-3?ng/μL?的樣品，利用Ex?Taq?DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)最高可穩(wěn)定檢出104倍稀釋樣品（2×10-2?ng/μL），但有非特異性擴(kuò)增條帶。

2.3?絕對(duì)定量PCR質(zhì)粒和引物穩(wěn)定性比較

對(duì)構(gòu)建的質(zhì)粒經(jīng)10倍梯度稀釋后進(jìn)行qPCR反應(yīng)，經(jīng)2次重復(fù)試驗(yàn)獲得各質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性回歸方程并計(jì)算相關(guān)系數(shù)R2、擴(kuò)增效率（AE），平均ΔCt值，如表4和圖3所示，2次重復(fù)試驗(yàn)下，pnrdB81質(zhì)粒的相關(guān)系數(shù)分別為0.996?9、0.998?2，擴(kuò)增效率分別為111.35%、101.28%，平均ΔCt值分別為2.97、3.25；pnrdB83質(zhì)粒的相關(guān)系數(shù)分別為0.995?2、0.994，擴(kuò)增效率分別為99.34%、98.29%，平均ΔCt值分別為3.29、3.26；pnrdB113質(zhì)粒的相關(guān)系數(shù)分別為0.995?7、0.991?8，擴(kuò)增效率分別為105.49%、91.87%，平均ΔCt值分別為3.08、3.69；p16SrDNA76質(zhì)粒的相關(guān)系數(shù)分別為0.994?1、0.992?1，擴(kuò)增效率分別為97.61%、100.26%，平均ΔCt值分別為3.26、3.15；p16SrDNA1160質(zhì)粒的相關(guān)系數(shù)分別為0.999?6、0.998，擴(kuò)增效率分別為66.19%、62.97%，平均ΔCt值分別為4.51、4.75。上述結(jié)果表明，p16SrDNA1160質(zhì)粒的擴(kuò)增效率未能達(dá)到qPCR反應(yīng)擴(kuò)增效率范圍90%～110%，不適宜用于絕對(duì)定量qPCR分析；pnrdB83質(zhì)粒的擴(kuò)增效率最接近于理想擴(kuò)增效率100%，其平均ΔCt值也最接近于理想值3.33，且在2次重復(fù)試驗(yàn)下的波動(dòng)最小，穩(wěn)定性最強(qiáng)，因此pnrdB83為本研究篩選的最佳質(zhì)粒。

敏度最高，最高可檢出104倍稀釋感染CLas柑橘總DNA樣品（2×10-2?ng/μL）；Omp1218f/2026r、16sf/16sr最高可檢出103倍稀釋樣品（2×10-1?ng/μL）；UP2/DP2、CQULA03F/03R、SEQIDNO.1/NO.2最高可檢出102倍稀釋樣品（2×100?ng/μL）；P1/P2、P535f/r、OI2/23S1最高可檢出的稀釋倍數(shù)雖然為102，但102倍稀釋樣品（2×100?ng/μL）擴(kuò)增條帶微弱；S3/S4、A2/J5最高可檢出的稀釋倍數(shù)雖然為102，但能擴(kuò)增出非特異條帶且102倍稀釋樣品（2×100?ng/μL）擴(kuò)增條帶微弱；因此13對(duì)引物的靈敏度由高到低依次為：OI1/OI2c=Las606/LSS=HLBF468/R877＞Omp1218f/2026r=16sf/16sr＞UP2/DP2=CQULA03F/03R=SEQIDNO.1/NO.2＞P1/P2=P535f/r=OI2/23S1＞S3/S4=A2/J5。

2.2?巢式PCR檢測(cè)引物特異性和靈敏度比較

以同一黃龍病陽(yáng)性柑橘總DNA的10倍梯度稀釋樣品為模板，使用Es?Taq?MasterMix（Dye）和Ex?Taq?DNA?Polymerase分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，評(píng)價(jià)本研究收集的柑橘黃龍病菌巢式PCR檢測(cè)引物。結(jié)果如圖2所示：1）A2/J5→A2/J5n這一組引物用兩種反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，均在陰性對(duì)照、清水對(duì)照以及所有梯度稀釋樣品中擴(kuò)增到目的條帶，因此不適宜用本研究的柑橘黃龍病菌巢式PCR檢測(cè)體系。2）引物組P535CORf/r→P400CORf/r以及P535f/r→P400f/r不宜使用Es?Taq?MasterMix（Dye）進(jìn)行擴(kuò)增（陰性對(duì)照、清水對(duì)照以及所有梯度

2.4?絕對(duì)定量PCR體系在田間樣品黃龍病菌含量分析中的比較

利用實(shí)驗(yàn)室前期鑒定到的19個(gè)黃龍病陽(yáng)性柑橘DNA樣品對(duì)5個(gè)質(zhì)粒的絕對(duì)定量分析效果進(jìn)行比較，根據(jù)2次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果，如表5所示，以pnrdB81質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品拷貝數(shù)，2次重復(fù)試驗(yàn)之間樣品拷貝數(shù)最大差值為4.14，最小差值為2.93；以pnrdB83質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，樣品拷貝數(shù)最大差值為0.88，最小差值為0.83；以pnrdB113質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，樣品拷貝數(shù)最大差值為4.32，最小差值為2.61；以p16SrDNA76質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，樣品拷貝數(shù)最大差值為4.38，最小差值為4.05；以p16SrDNA1160質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，樣品拷貝數(shù)最大差值為1.37，最小差值為1.22；上述結(jié)果表明用pnrdB83質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)待測(cè)樣品中黃龍病菌含量進(jìn)行定量分析的穩(wěn)定性最強(qiáng)，因此pnrdB83為本研究篩選的最佳質(zhì)粒。

3?結(jié)論與討論

柑橘黃龍病是對(duì)柑橘產(chǎn)業(yè)最具毀滅性的病害，目前沒有可用的有效藥劑和抗病品種，通過分子檢測(cè)進(jìn)行黃龍病診斷對(duì)黃龍病有效防控至關(guān)重要。本研究利用同一黃龍病陽(yáng)性柑橘樣品DNA，在高效便捷且價(jià)格低廉的Es?Taq?MasterMix體系中，對(duì)16對(duì)常規(guī)PCR檢測(cè)引物進(jìn)行了評(píng)價(jià)。Las606/LSS和HLBF468/R877是研究人員設(shè)計(jì)的用于常規(guī)PCR的高靈敏度新引物［1617］。梁亮等［17］研究表明感染黃龍病菌的柑橘葉片DNA稀釋103倍，引物HLBF468/R877仍然可以擴(kuò)增出特異性條帶，在本研究中該引物不僅可對(duì)103倍稀釋感染CLas柑橘總DNA樣品（2×10-1?ng/μL）擴(kuò)增出明亮條帶，還可對(duì)104倍稀釋樣品（2×10-2?ng/μL）擴(kuò)增出微弱條帶，說(shuō)明該引物的靈敏度確實(shí)高，同時(shí)利用本研究的擴(kuò)增體系可將該引物的靈敏度提高10倍。Fujikawa?等［16］研究表明對(duì)田間樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，Las606/LSS檢出的黃龍病陽(yáng)性率高于使用OI1/OI2c檢測(cè)，且對(duì)某些樣品Las606/LSS僅用微量DNA模板即可檢出黃龍病菌，OI1/OI2c則不能檢出。在本研究中，OI1/OI2c、Las606/LSS和HLBF468/R877雖然均可檢出104倍稀釋樣品（2×10-2?ng/μL），但OI1/OI2c對(duì)103倍稀釋樣品（2×10-1?ng/μL）擴(kuò)增條帶微弱，而Las606/LSS和HLBF468/R877對(duì)103倍稀釋樣品（2×10-1?ng/μL）進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，條帶仍然非常明亮；以此來(lái)看，針對(duì)病原菌含量低的樣品，使用Las606/LSS和HLBF468/R877的檢出可能性可能比使用OI1/OI2c高，因此針對(duì)田間病原菌含量低的樣品，利用常規(guī)PCR進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，為了避免漏檢，建議同時(shí)使用OI1/OI2c、Las606/LSS和HLBF468/R877進(jìn)行檢測(cè)。相比16S?rDNA基因在黃龍病菌亞洲種和非洲種之間高達(dá)97.5%的同源性，外膜蛋白OMP基因和β操縱子rplAJ位點(diǎn)在亞洲種和非洲種之間的同源性只有78.4%和70%，因此這2個(gè)基因除了可用于常規(guī)PCR檢測(cè)外，還可用于黃龍病菌的分子分型檢測(cè)［18］?；贠MP基因的Omp1218f/2026r引物在本研究中的檢測(cè)靈敏度僅次于前3對(duì)引物，Deng等［18］還根據(jù)其在不同菌系之間的SNPs，對(duì)源自柚子上的黃龍病菌菌系進(jìn)行了分型分析?；趓plAJ位點(diǎn)的A2/J5引物可根據(jù)擴(kuò)增片段大小不同區(qū)分亞洲種（703?bp）和非洲種（669?bp），且該引物可檢測(cè)稀釋103倍的黃龍病感病柑橘樣品DNA［27］，但在本研究中該引物僅可在稀釋101～102倍的感病柑橘樣品DNA中擴(kuò)增到微弱的703?bp條帶，且伴隨一條500?bp左右的非特異擴(kuò)增條帶，結(jié)果不一致的原因可能是本研究所用擴(kuò)增體系與Hocquellet等［27］的體系不同。CalsppsecF/R、HLBF/R、Hlbsf/Hlbsr等引物也因其非特異性擴(kuò)增，不適宜使用本研究的常規(guī)PCR擴(kuò)增體系。

通常巢式PCR的靈敏度較常規(guī)PCR高，因此針對(duì)田間病原菌含量低的樣品，使用巢式PCR可以提高檢出率。本研究利用同一黃龍病陽(yáng)性柑橘樣品DNA，對(duì)6組巢式PCR檢測(cè)引物進(jìn)行了評(píng)價(jià)。本研究常規(guī)PCR大部分引物僅可檢出102倍以內(nèi)稀釋樣品，但巢式PCR引物，除A2/J5→A2/J5n外，其他引物至少在一種適用體系中可穩(wěn)定特異檢出104倍以內(nèi)稀釋樣品，少數(shù)引物組還可檢出105倍稀釋樣品，說(shuō)明巢式PCR比常規(guī)PCR靈敏度高102～103倍。本研究常規(guī)PCR中引物靈敏度最高的OI1/OI2c雖然可檢出稀釋104倍的樣品，但稀釋103～104倍以后的樣品擴(kuò)增條帶微弱；S3/S4引物經(jīng)常規(guī)PCR僅可檢出102倍以內(nèi)稀釋樣品，且擴(kuò)增條帶微弱；但以O(shè)I1/OI2c作為第1輪PCR引物，以S3/S4作為第2輪PCR引物的巢式PCR，在Es?Taq?MasterMix和TaKaRa?Ex?Taq?DNA聚合酶體系中均可穩(wěn)定特異檢出104倍稀釋樣品，且擴(kuò)增條帶明亮；說(shuō)明此巢式PCR體系比常規(guī)PCR靈敏度至少高100倍。根據(jù)本研究巢式PCR的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同巢式PCR引物組適用的擴(kuò)增體系不同，需要根據(jù)引物組選擇合適的擴(kuò)增體系。本研究利用A2/J5引物進(jìn)行常規(guī)PCR時(shí)有非特異性擴(kuò)增，利用A2/J5→A2/J5n進(jìn)行半巢式PCR擴(kuò)增時(shí)，不論Es?Taq?MasterMix還是Ex?Taq?DNA聚合酶體系，均出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，該引物不適宜使用本研究的擴(kuò)增體系。此外，我們對(duì)丁芳等［24］設(shè)計(jì)的P535f/r→P400f/r引物組與黃龍病菌基因組進(jìn)行比對(duì)時(shí)，發(fā)現(xiàn)引物序列有多處堿基錯(cuò)誤，因此對(duì)其進(jìn)行了修正，設(shè)計(jì)了修正引物組，但結(jié)果表明2組引物均不適宜用Es?Taq?MasterMix體系，在Ex?Taq?DNA聚合酶體系中兩者靈敏度相當(dāng)。

常規(guī)PCR和巢式PCR僅能對(duì)黃龍病菌的有無(wú)進(jìn)行定性判斷，定量PCR不僅靈敏度高，可以對(duì)早期病原菌含量低的樣品進(jìn)行檢測(cè)，而且可對(duì)黃龍病菌的含量進(jìn)行定量分析。為了進(jìn)一步提高檢測(cè)靈敏度，研究人員基于多拷貝基因位點(diǎn)開發(fā)了高靈敏度定量PCR引物RNRf/RNRr［13］和4CPf/4CPr［32］，并進(jìn)一步研發(fā)了基于雙引物的雙重定量PCR檢測(cè)方法［33］，但這些研究均僅通過Ct值分析進(jìn)行黃龍病診斷，沒有進(jìn)一步開發(fā)基于高靈敏度引物的絕對(duì)定量PCR體系。由于不同批次的qPCR反應(yīng)，即便同一樣品，其Ct值也經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)系統(tǒng)性的波動(dòng)，同一批次內(nèi)的qPCR反應(yīng)也會(huì)因樣品初始模板量不同而導(dǎo)致Ct值不可比較，因此通過Ct值分析做不到精準(zhǔn)定量分析，而基于標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的絕對(duì)定量PCR，可在不同批次上利用同一標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為內(nèi)標(biāo)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而通過線性回歸方程計(jì)算待測(cè)樣品病原菌含量，從而剔除qPCR反應(yīng)在不同批次之間的系統(tǒng)誤差而做到精準(zhǔn)定量分析，因此標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒在不同批次之間的擴(kuò)增穩(wěn)定性直接影響絕對(duì)定量PCR分析的準(zhǔn)確度。本研究針對(duì)具有5個(gè)拷貝的nrdB基因，分別構(gòu)建了標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pnrdB81、pnrdB83和pnrdB113，同時(shí)針對(duì)具有3個(gè)拷貝的16S?rDNA基因，分別構(gòu)建了標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒p16SrDNA76和p16SrDNA1160，并對(duì)上述5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒在不同批次之間的穩(wěn)定性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。根據(jù)本研究的結(jié)果，影響質(zhì)粒和引物穩(wěn)定性的核心因素為質(zhì)粒和引物的擴(kuò)增效率，2次重復(fù)試驗(yàn)中，pnrdB83質(zhì)粒擴(kuò)增效率最接近100%，且波動(dòng)最小，穩(wěn)定性最強(qiáng)，因此用于田間樣品含量分析時(shí)，樣品拷貝數(shù)差值也最??；而pnrdB81、pnrdB113、p16SrDNA76質(zhì)粒的擴(kuò)增效率波動(dòng)相對(duì)大，穩(wěn)定性相對(duì)弱，因此用于田間樣品含量分析時(shí)，樣品拷貝數(shù)差值也相對(duì)大；p16SrDNA1160質(zhì)粒的擴(kuò)增效率雖然波動(dòng)較小，用于田間樣品含量分析時(shí)樣品拷貝數(shù)差值也相對(duì)小，但是該質(zhì)粒擴(kuò)增效率極低（66.19%、62.97%），未達(dá)到qPCR反應(yīng)擴(kuò)增效率范圍（90%～110%），原因可能是該質(zhì)粒為長(zhǎng)片段質(zhì)粒。此外基于同一基因nrdB構(gòu)建的3個(gè)質(zhì)粒（pnrdB83、pnrdB81、pnrdB113）穩(wěn)定性存在差異，其可能的原因是pnrdB81在擴(kuò)增片段上游多出9?bp序列且在另一位點(diǎn)存在1個(gè)SNP，pnrdB113在擴(kuò)增片段上游多出3?bp序列，且該序列包含1個(gè)SNP，而pnrdB83的擴(kuò)增片段與目的基因片段100%匹配。綜上，以pnrdB83質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，以RNRn1f/RNRn1r進(jìn)行定量PCR的體系為本研究中最穩(wěn)定的絕對(duì)定量PCR體系，可應(yīng)用于需要進(jìn)行黃龍病病原菌含量測(cè)定和比較的各項(xiàng)試驗(yàn)。

參考文獻(xiàn)

［1］?奎國(guó)秀，?祁春節(jié).我國(guó)柑橘產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)貿(mào)易的變化及機(jī)遇與挑戰(zhàn)［J］.中國(guó)果樹，?2021（6）：?9397.

［2］?鄧秀新.中國(guó)柑橘育種60年回顧與展望［J］.園藝學(xué)報(bào)，?2022，?49（10）：?20632074.

［3］?周常勇.對(duì)柑橘黃龍病防控對(duì)策的再思考［J］.植物保護(hù)，?2018，?44（5）：?3033.

［4］?BENDDIX?C，?LEWIS?J?D.?The?enemy?within：?phloemlimited?pathogens?［J］.?Molecular?Plant?Pathology，?2018，?19（1）：?238254.

［5］?BOV?J?M.?Huanglongbing：?A?destructive，?newly?emerging，?centuryold?disease?of?citrus?［J］.?Journal?of?Plant?Pathology，?2006，?88（1）：?737.

［6］?SHOKROLLAH?H，?ABDULLAH?T?L，?SIJAM?K，?et?al.?Identification?of?physical?and?biochemical?characteristic?of?mandarin?（Citrus?reticulata）?fruit?infected?by?Huanglongbing?（HLB）?［J］.?Australian?Journal?of?Crop?Science，?2011，?5（2）：?181186.

［7］?黃世炎，?張藝琴，?楊壹，?等.?感染柑橘黃龍病對(duì)‘沃柑秋梢葉片理化指標(biāo)和果實(shí)品質(zhì)的影響［J］.中國(guó)果樹，?2021（12）：?4246.

［8］?MARCO?P，?KASIE?S，?CHRISTINA?D，?et?al.?Quercus?leaf?extracts?display?curative?effects?against?Candidatus?Liberibacter?asiaticus?that?restore?leaf?physiological?parameters?in?HLBaffected?citrus?trees?［J］.?Plant?Physiology?and?Biochemistry，?2020，?148：?7079.

［9］?程春振，?曾繼吾，?鐘云，?等.?柑橘黃龍病研究進(jìn)展［J］.園藝學(xué)報(bào)，?2013，?40（9）：?16561668.

［10］鄧曉玲，?鄭永欽，?鄭正，?等.?柑橘黃龍病菌基因組學(xué)的研究進(jìn)展［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，?2019，?40（5）：?137148.

［11］LI?Wenbin，?HARTUNG?J?S，?LEVY?L.?Quantitative?realtime?PCR?for?detection?and?identification?of?Candidatus?Liberibacter?species?associated?with?citrus?Huanglongbing?［J］.?Journal?of?Microbiological?Methods，?2006，?66（1）：?104115.

［12］LI?Wenbin，?LI?Dayan，?TWIEG?E，?et?al.?Optimized?quantification?of?unculturable?Candidatus?Liberibacter?spp.?in?host?plants?using?realtime?PCR?［J］.?Plant?Disease，?2008，?92（6）：?854861.

［13］ZHENG?Zeng，?XU?Meirong，?BAO?Minli，?et?al.?Unusual?five?copies?and?dual?forms?of?nrdB?in?“Candidatus?Liberibacter?asiaticus”：?biological?implications?and?PCR?detection?application?［J/OL］.?Scientific?Reports，?2016，?6（1）：?39020.?DOI：?10.1038/srep39020.

［14］肖翠，?廖晶晶，?張滬，?等.?柑桔黃龍病菌在貢柑葉片中的分布分析［J］.中國(guó)南方果樹，?2019，?48（3）：?610.

［15］JAGOUEIX?S，?JOSEPH?M?B，?GARNIER?M.?PCR?detection?of?the?two?‘Candidatus?liberibacter?species?associated?with?greening?disease?of?citrus?［J］.?Molecular?and?Cellular?Probes，?1996，?10：?4350.

［16］FUJIKAWA?T，?IWANAMI?T.?Sensitive?and?robust?detection?of?citrus?greening?（Huanglongbing）?bacterium?“Candidatus?Liberibacter?asiaticus”?by?DNA?amplification?with?new?16S?rDNAspecific?primers?［J］.?Molecular?and?Cellular?Probes，?2012，?26：?194197.

［17］梁亮，?田志清，?胡雪芳，?等.?柑橘黃龍病常規(guī)PCR檢測(cè)技術(shù)研究與初步應(yīng)用［J］.植物保護(hù)，?2018，?44（2）：?149153.

［18］DENG?Xiaoling，?CHEN?Jianchi，?FENG?Z，?et?al.?Identification?and?characterization?of?the?Huanglongbing?bacterium?in?pummelo?from?multiple?locations?in?Guangdong，?P.?R.?China?［J］.?Plant?Disease，?2008，?92（4）：?513518.

［19］高玉霞，?盧占軍，?鐘八蓮，?等.?柑桔黃龍病常規(guī)PCR檢測(cè)4對(duì)引物的特異性和靈敏度［J］.中國(guó)南方果樹，?2014，?43（1）：?58.

［20］許美容，?陳燕玲，?鄧曉玲.?柑橘黃龍病癥狀與“Candidatus?Liberibacter?asiaticus”?PCR檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性分析［J］.植物病理學(xué)報(bào)，?2016，?46（1）：?367373.

［21］胡浩，?殷幼平，?張利平，?等.柑桔黃龍病的常規(guī)PCR及熒光定量PCR檢測(cè)［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，?2006（12）：?24912497.

［22］婁兵海，?宋雅琴，?鄧崇嶺.一種柑橘黃龍病菌亞洲種聚合酶鏈?zhǔn)街脫Q反應(yīng)檢測(cè)方法：?CN105624312A?［P］.?20160601.

［23］田亞南，?柯穗，?柯沖.?應(yīng)用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)檢測(cè)和定量分析柑桔黃龍病病原［J］.植物病理學(xué)報(bào)，?1996，?26（3）：?243250.

［24］丁芳，?王國(guó)平，?易干軍，?等.?不同引物對(duì)檢測(cè)柑桔黃龍病菌靈敏度比較［J］.植物保護(hù)學(xué)報(bào)，?2007，?34（4）：?364368.

［25］SUBANDIYAH?S，?IWANAMI?T，?TSUYUMU?S，?et?al.?Comparison?of?16S?rDNA?and?16S/23S?intergenic?region?sequences?among?citrus?greening?organisms?in?Asia?［J］.Plant?Disease，?2000，?84（1）：?1518.

［26］HONG?Yanyun，?LUO?Yongyang，?YI?Jianglan，?et?al.?Screening?nestedPCR?primer?for?‘Candidatus?Liberibacter?asiaticus?associated?with?citrus?Huanglongbing?and?application?in?Hunan，?China?［J/OL］.?PLoS?ONE，?2019，?14（2）：?e0212020.?DOI：?10.1371/journal.pone.0212020.

［27］HOCQUELLET?A，?TOORAWA?P，?BOVE?J?M，?et?al.?Detection?and?identification?of?the?two?Candidatus?Liberobacter?species?associated?with?citrus?Huanglongbing?by?PCR?amplification?of?ribosomal?protein?genes?of?the?beta?operon?［J］.Molecular?and?Cellular?Probes，?1999，?13：?373379.

［28］FELIX?M，?SILVIA?B，?BASTIN?S，?et?al.?The?challenge?of?environmental?samples?for?PCR?detection?of?phytopathogenic?bacteria：?a?case?study?of?citrus?Huanglongbing?disease?［J/OL］.Agronomy，?2021，?11（1）：?10.?DOI：?10.3390/agronomy11010010.

［29］楊毅，?姜蕾.一種柑橘黃龍病檢測(cè)用引物組及其檢測(cè)方法：?CN108950034A?［P］.20181207.

［30］趙春江，?董宏圖，?張晗，?等.一種柑橘黃龍病快速檢測(cè)方法：?CN112195223A?［P］.20210108.

［31］BHASKARA?A?S，?AHMED?B?N?J，?ADKARPURUSHOTHAMA?C?R，?et?al.?Evaluation?of?efficiency?of?heminested?PCR?assay?for?the?detection?of?‘Candidatus?Liberibacter?infecting?citrus［J］.?Journal?of?Plant?Diseases?and?Protection，?2013，?120（5/6）：?189193.

［32］BAO?Minli，?ZHENG?Zeng，?SUN?Xiaoan，?et?al.?Enhancing?PCR?capacity?to?detect?‘Candidatus?Liberibacter?asiaticus?utilizing?whole?genome?sequence?information［J］.?Plant?Disease，?2020，?104：?527532.

［33］李鎮(zhèn)希，?潘睿翾，?許美容，?等.?柑橘黃龍病菌雙重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的建立［J］.園藝學(xué)報(bào)，?2023，?50（1）：?188196.

（責(zé)任編輯：田?喆）