孟醒 李小杰 周莉 任晗堃 和長征

油體蛋白是植物油體所特有的，且與油體特異性結(jié)合的一種疏水的小分子堿性蛋白質(zhì)。它存在于向日葵、小麥、花生等各類植物中，在植物生長過程中具有維持油體穩(wěn)定、維持種子發(fā)芽等多種生理學(xué)作用。目前市場上對于植物油體蛋白的分離純化已有一定深度的研究，但利用基因編碼生物合成油體蛋白卻鮮少報道。在化妝品領(lǐng)域，油體蛋白是一種具有抗氧化性能的天然乳化劑，此外，油體蛋白的植物生理學(xué)功能預(yù)測具有促進(jìn)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、吸收以及維持皮膚脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)等作用。植物油體蛋白，有望通過合成生物學(xué)技術(shù)實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，以期為油體蛋白在化妝品、保健品及醫(yī)藥行業(yè)發(fā)揮重大作用。

關(guān)鍵詞：油體蛋白；生理功能；分離純化；化妝品

油體是植物的儲油細(xì)胞器，其大小與分布直接影響器官含油量。油體外部包被一層磷脂和蛋白質(zhì)鑲嵌而成的半單位膜，油體膜及膜上附著的蛋白占油體質(zhì)量的1%～4%，脂肪酸以三酰甘油的形式儲存在膜內(nèi)。油體膜蛋白中約90%為油體蛋白（oleosin），也可稱為油質(zhì)蛋白，少量為油體鈣蛋白和油體固醇蛋白（油體結(jié)構(gòu)如圖1所示）。它們共同參與油體的生物學(xué)功能，并在油體的形成、穩(wěn)定與大小、油脂代謝利用、油脂積累及抗凍性等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[1，2]。

油體蛋白是油體所特有的，是與油體特異性結(jié)合的一種疏水小分子堿性蛋白質(zhì)。油體蛋白在植物種子中相對分子量范圍在15～26 kDa之間。不同植物來源的油體蛋白都具有3個基本的結(jié)構(gòu)域：①N端40～60個氨基酸組成的兩親性區(qū)域；②中間68～74個氨基酸組成的高度疏水區(qū)域；③C端的33～40個氨基酸組成α-螺旋結(jié)構(gòu)域（兩親性）[4-6]。

Part 1

植物油體蛋白的基因編碼及應(yīng)用研究

1. 植物油體蛋白的基因編碼研究

現(xiàn)階段，油體蛋白基因編碼研究主要分為2種：

（1）提取分離得到植物種子的油體蛋白的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用PCR模版，設(shè)計特異引物克隆油體蛋白基因，測序之后，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。酶切鑒定陽性的克隆進(jìn)行測序，獲得測序結(jié)果后檢索NCBI數(shù)據(jù)庫已公開資料，以BLAST檢索比對Oleosin基因在不同物種間的全長編碼序列。不同植物的油體蛋白基因序列報道見表1。

（2）研究者用生物信息學(xué)方法在Ensemble Plant數(shù)據(jù)庫下載油體蛋白的全基因組信息，鑒定油體蛋白基因家族成員后對各家族成員蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析及一級、二級、三級結(jié)構(gòu)分析，系統(tǒng)進(jìn)化、染色體定位分析，跨膜結(jié)構(gòu)域、Motif預(yù)測，以及不同組織中油體蛋白表達(dá)模式的分析。如李志遠(yuǎn)等人[12]以油體膜蛋白為對象，克隆了鳳丹的油體膜蛋白基因（OLE）。表達(dá)模式顯示，該基因在鳳丹種子發(fā)育過程中的表達(dá)水平逐漸上升，在種子接近成熟時表達(dá)水平最高，而后略有下降。這一結(jié)果有利于今后通過基因工程手段調(diào)控鳳丹油體發(fā)育。

目前，油體蛋白的研究目的主要為改良植物種子、植物油體蛋白家族間的遺傳規(guī)律以及表達(dá)模式的分析，而利用基因工程、酶工程及合成生物學(xué)等技術(shù)合成油體蛋白的文獻(xiàn)鮮見報道。以上對油體蛋白基因的研究為改良油體蛋白奠定理論基礎(chǔ)，為揭示和深度利用Oleosin基因的功能和調(diào)控Oleosin基因表達(dá)提供理論依據(jù)，這些研究將對功能基因組學(xué)具有重大意義[13]。

2. 植物油體蛋白作為外源表達(dá)載體的相關(guān)研究應(yīng)用

利用油體表達(dá)系統(tǒng)是表達(dá)生產(chǎn)表皮生長因子有效的手段，與從人類尿液、唾液、眼淚、牛奶和血漿中直接提取以及用微生物表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)生產(chǎn)相比，具有更高的產(chǎn)量。由凝乳酶剪切因子連接的人類表皮生長因子與油體蛋白的融合蛋白在擬南芥中實現(xiàn)了表達(dá)，表達(dá)量為0.12%[14]。Jingbo Cai等人研究顯示在紅花種子中表達(dá)的油質(zhì)蛋白--rhFGF9融合蛋白可促進(jìn)小鼠毛發(fā)生長和傷口愈合[15]。Li W等人[16]將植物偏置密碼子優(yōu)化后的人胰島素樣生長因子1 （human insulin-like growth factor 1， hIGF-1）基因融合到擬南芥18.5 kDa油質(zhì)蛋白基因的C端，并將油質(zhì)蛋白啟動子驅(qū)動的融合基因轉(zhuǎn)移到擬南芥生態(tài)型Col-0中。轉(zhuǎn)基因種子中油質(zhì)蛋白-hIGF-1融合蛋白的積累量高達(dá)總種子蛋白的0.75%，hIGF-1的表達(dá)量為總種子蛋白的0.17%，比以往報道的基于其他植物的hIGF-1產(chǎn)生系統(tǒng)高8倍。

綜上所述，植物油體蛋白作為外源表達(dá)載體為蛋白質(zhì)類高活性成分提供蛋白二維三維構(gòu)象折疊的空間，不僅能夠提高產(chǎn)量，而且能夠起到穩(wěn)定物質(zhì)活性等作用，未來也可能對化妝品領(lǐng)域內(nèi)的高活性成分提供穩(wěn)定策略。

Part 2

植物油體蛋白分離純化現(xiàn)狀

為深入研究油體蛋白的特性，研究人員采用不同方法將油體蛋白從植物種子中分離純化出來，表2是國內(nèi)、外研究員分離純化油體蛋白的常用方法。

?stbring K等人[17]闡述一種從冷壓油菜籽餅中提取油質(zhì)蛋白的方法，具體步驟如下：冷壓油菜籽餅在刀磨機(jī)中研磨20 s，然后于室溫條件下浸泡在自來水（1：10）中水合2 h?；旌衔镌?3500 rpm下均質(zhì)化10 min，然后用2 M NaOH將pH值調(diào)節(jié)至9-12。重復(fù)一次上述均質(zhì)化步驟，接著在25 ℃，5000 ×g條件下，離心10 min。此步驟中的上清液稱作“液相”，沉淀物稱作“固相”。丟棄固相，將液相的pH調(diào)節(jié)至6.5（對應(yīng)油菜籽中油質(zhì)蛋白的等電點），調(diào)節(jié)pH后的樣品用磁力攪拌器攪拌20 min，然后重復(fù)一次上述離心處理步驟。每個pH值至少重復(fù)提取一次。將最后一次離心獲取的沉淀物進(jìn)行冷凍干燥處理所得。

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)的曹地[19]選取玉米種子作為實驗材料，使用聚偏二氟乙烯膜和兩步離心法分離和純化玉米胚中油體，十二烷基硫酸鈉（SDS）加熱法提取油體相關(guān)蛋白，利用氯仿/苯酚混合試劑去除雜質(zhì)提高雙向膠圖分辨率，通過雙向電泳和質(zhì)譜技術(shù)對玉米胚中油體蛋白進(jìn)行鑒定和生物信息學(xué)分析。研究發(fā)現(xiàn)玉米種子油體相關(guān)蛋白具有疏水性；利用水溶性蛋白提取液和兩步離心法對玉米種子油體進(jìn)行反復(fù)純化，可除去雜蛋白，留下目的蛋白；利用1% SDS全蛋白提取液對純化過的玉米種子油體進(jìn)行油體相關(guān)蛋白的提取，首次使用金屬浴95 ℃加熱15 min促進(jìn)油體相關(guān)蛋白的提取，同時利用氯仿/苯酚（體積比1：3）混合試劑去除脂類等雜質(zhì)，改善油體相關(guān)蛋白雙向電泳的縱向拖尾問題。

綜上，油體蛋白目前均為水相提取法制備，影響因素主要為溶劑種類、溫度及pH值。針對油體蛋白的分離純化工藝，仍集中在種類鑒定、分子量大小、變性溫度、二級結(jié)構(gòu)等蛋白質(zhì)組學(xué)方面，也有研究油體蛋白這種天然的乳化劑與目前市面上使用頻次較多的乳化劑作用差異。整體上，對油體蛋白的分離純化仍集中在實驗室研究階段。

Part 3

油體蛋白在皮膚護(hù)理產(chǎn)品領(lǐng)域的作用

1. 配方應(yīng)用

1.1 起泡

Nikiforidis等人使用界面流變儀，研究從玉米胚芽中提取的純化油體蛋白在空氣-水界面的泡沫穩(wěn)定能力，發(fā)現(xiàn)純化油體蛋白的表面性質(zhì)與β-乳球蛋白和蛋黃載脂蛋白相當(dāng)，這些結(jié)果還表明油體蛋白形成了一種空氣—水界面上的強(qiáng)彈性薄膜[23]，預(yù)期油體蛋白能夠應(yīng)用于皮膚護(hù)理產(chǎn)品中發(fā)揮起泡劑的作用。

1.2 乳化作用

Yufan Sun等人的研究提到，將提取的油體蛋白在體外模擬消化過程中，油體蛋白的吸水性、吸油性、乳化性和抗氧化性等物理性能得到改善，進(jìn)一步表明植物油體蛋白具有抗氧化、乳化等功效[24]。?stbring K等人的研究提到油菜籽中的一種功能性蛋白質(zhì)——兩親性油體蛋白，可以用來穩(wěn)定乳狀液，且從冷壓油菜籽餅粕中提取物油體蛋白，優(yōu)化提取工藝，并考察其乳化和抗氧化能力，研究表明在pH 9環(huán)境下提取的油體蛋白比在pH 12環(huán)境下提取的油體蛋白穩(wěn)定性更好，且乳狀液滴更小。用亞麻籽油和玉米油配制乳液，植物油體蛋白、牛血清白蛋白、脫油卵磷脂和吐溫20乳化，乳液在加速條件（30℃ ） 下儲存12 天，油體蛋白穩(wěn)定乳液的程度與商業(yè)食品級乳化劑相同；與牛血清蛋白、脫油卵磷脂和吐溫20 相比，用植物油體蛋白乳化的亞麻籽油乳液具有較低的丙二醛濃度，表明植物油體蛋白可以有效抑制乳化體系的氧化速率。同樣，用油體蛋白乳化后的玉米油乳液，比脫油卵磷脂和吐溫20 明顯更有效。綜上可知，植物油體蛋白是一種具有抗氧化性能的天然乳化劑[17]。

綜上所述，在配方應(yīng)用方面，油體蛋白可以作為乳化劑和起泡劑應(yīng)用在皮膚護(hù)理領(lǐng)域，此外，油體蛋白鑲嵌于單層磷脂的油體結(jié)構(gòu)，能夠使得配方更加穩(wěn)定。

2. 護(hù)膚功能

2.1 促進(jìn)活性物質(zhì)的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)

在C- 或N- 末端融合了外源蛋白的油體蛋白仍然可以準(zhǔn)確定位于油體表面，再結(jié)合油體疏水親脂的特性，構(gòu)建人工油體，并用于包埋生物活性物質(zhì)，經(jīng)蛋白酶酶切后，目標(biāo)活性物質(zhì)可以從油體釋放到水相。推測活性物質(zhì)經(jīng)油體蛋白包裹穿透人體皮脂層后釋放，能夠促進(jìn)活性物質(zhì)在皮膚上的滲透，進(jìn)而預(yù)測油體蛋白具有可以促進(jìn)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收的重要作用[25]。

2.2. 維持皮膚的脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)

油體表面第一層是由磷脂和油體蛋白組成的半單位膜，該膜對于油體能夠保持長期穩(wěn)定且不發(fā)生聚集和分離發(fā)揮了關(guān)鍵作用[26]。推測油體蛋白應(yīng)用在皮膚護(hù)理領(lǐng)域中，能夠維持皮膚脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)。

2.3. 抗氧化

Wijesundera 等人的研究結(jié)果顯示，當(dāng)油體蛋白與磷脂結(jié)合使用時，可顯著降低脂質(zhì)氧化速率[27]。如今的化妝品領(lǐng)域愈發(fā)趨于天然、綠色、可持續(xù)，預(yù)期油體蛋白能夠添加到精華油皮膚護(hù)理產(chǎn)品中，起到抗氧化穩(wěn)定產(chǎn)品質(zhì)量的作用。

綜上所述，油體蛋白具有促進(jìn)活性物質(zhì)吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)、維持皮膚脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)及抗氧化的作用，這表明油體蛋白是一種前景優(yōu)良的化妝品活性功效原料。另外，由于油體蛋白目前尚未收錄于《已使用化妝品原料目錄（2021年版）》中，其合規(guī)性暫時存在問題。當(dāng)油體蛋白通過化妝品新原料注冊備案解決合規(guī)性使用問題后，預(yù)期能夠廣泛地應(yīng)用于皮膚護(hù)理領(lǐng)域中。

Part 4

展望

油體蛋白作為一種具有抗氧化性能的天然乳化劑，預(yù)期能夠在多個應(yīng)用領(lǐng)域發(fā)揮關(guān)鍵性作用。然而，目前油體蛋白的分離純化制備仍停留在實驗室規(guī)模，嚴(yán)重限制了其在食品、保健品及化妝品等領(lǐng)域中的應(yīng)用。待進(jìn)一步明晰各類植物中油體蛋白的物理特性、微觀層面的結(jié)構(gòu)特征和空間構(gòu)象后，采用化學(xué)技術(shù)、合成生物學(xué)技術(shù)或者多種技術(shù)聯(lián)合來實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)油體蛋白將具有重大的意義。

作者介紹

孟 醒，李小杰：供職于北京茂思商貿(mào)有限公司

周 莉，任晗堃：供職于太和康美（北京）中醫(yī)研究院有限公司

和長征：供職于植然天成（北京）生物科技有限公司

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