紀(jì)蕾 劉天紅 王穎 李曉 李紅艷 孫元芹 姜曉東

摘要：為制備一種高效抑菌劑，以殼聚糖（chitosan，CS）為原料，采用漆酶/2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧自由基（2，2，6，6-tetramethylpiperidine-1-oxyl，TEMPO）體系制備6-羧基殼聚糖（6-carboxyl chitosan，C-COS），然后與硝酸銀反應(yīng)制備載銀氧化殼聚糖（silver-carried oxidized chitosan，C-COS-Ag），對(duì)其抑菌性能進(jìn)行研究。結(jié)果表明，與CS相比，C-COS-Ag的抑菌效果明顯提高，其對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為（22.75±1.50）和（13.75±2.50） mm，最小抑菌質(zhì)量濃度均為6.10 μg·mL-1。細(xì)菌生長曲線試驗(yàn)證實(shí)，C-COS-Ag能明顯降低大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長速率；細(xì)胞內(nèi)容物滲透試驗(yàn)表明，C-COS-Ag能夠破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁形態(tài)，導(dǎo)致核酸、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)滲出，堿性磷酸酶活性上升，β-半乳糖苷酶活性下降，半乳糖合成途徑受阻，細(xì)菌正常代謝受到影響。以上研究結(jié)果為C-COS-Ag的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：殼聚糖；硝酸銀；抑菌性；大腸桿菌；金黃色葡萄球菌

doi：10.13304/j.nykjdb.2022.0769

中圖分類號(hào)：TS201.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1008‐0864（2024）03‐0214‐09

殼聚糖（chitosan， CS）是甲殼素脫乙?；漠a(chǎn)物，具有優(yōu)異的生物和物理化學(xué)性質(zhì)，如凝膠性、生物降解性、抑菌性等[1-4]，在醫(yī)療保健、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。殼聚糖通過破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜及干擾細(xì)胞新陳代謝等途徑達(dá)到抑菌作用[5-9]。盡管殼聚糖擁有廣譜抗菌活性，但其抗菌效果仍低于已有的化學(xué)合成抗菌劑。由殼聚糖分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可知，其伯羥基、仲羥基以及氨基等基團(tuán)具有較強(qiáng)的反應(yīng)活性，是結(jié)構(gòu)修飾的理想位點(diǎn)，可通過化學(xué)改性或與抗菌材料復(fù)配提高其抗菌活性[10-12]。吳慧清等[13]合成了殼聚糖鋅，與殼聚糖相比其抑菌性能明顯提高。牛梅等[14]制備了載銀殼聚糖復(fù)合抗菌劑，發(fā)現(xiàn)其對(duì)大腸桿菌（Escherichia coil）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）有明顯的抑制作用。

漆酶/2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧自由基（2，2，6，6-tetramethylpiperidine-1-oxyl，TEMPO）體系可以選擇性將殼聚糖C-6伯羥基氧化成羧基，生成6-羧基殼聚糖（6-carboxyl chitosan，C-COS），且整個(gè)過程無副反應(yīng)發(fā)生，無有害物產(chǎn)生，減少了環(huán)境污染，是一種殼聚糖綠色改性方法。本研究采用漆酶/TEMPO體系制備C-COS，然后與硝酸銀反應(yīng)制備了載銀氧化殼聚糖（silver-carried oxidizedchitosan，C-COS-Ag），研究其對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌性能及作用機(jī)制，利用細(xì)菌生長曲線表征C-COS-Ag的抑菌效果，通過細(xì)胞內(nèi)容物滲透（小分子、核酸、蛋白質(zhì)）和細(xì)菌胞內(nèi)酶（堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶）活性的變化，分析細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性及完整性，探究其抗菌機(jī)制，為C-COS-Ag在抑菌領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 殼聚糖，脫乙酰度95%，購自上海源葉生物科技有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 大腸桿菌（ 編號(hào)：ATCC25922）、金黃色葡萄球菌（編號(hào)：ATCC 11779），青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；漆酶，諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司；2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧自由基（TEMPO），默克Sigma-Aldrich 公司；總蛋白（total protein，TP）測(cè)定試劑盒、堿性磷酸酶活性檢測(cè)試劑盒， 南京建成生物工程研究所；β-半乳糖苷酶活性檢測(cè)試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.3 試驗(yàn)儀器 VERTEX70傅里葉變換紅外光譜儀，德國布魯克公司；UV-2450 紫外分光光度計(jì)，日本島津儀器有限公司；S-4800N型掃描電子顯微鏡，日本日立公司；Victor-Rivo5s多功能酶標(biāo)儀，美國珀金埃爾默公司；Orion VERSA STAR多參數(shù)測(cè)量儀，美國賽默飛世爾科技公司；SX-500高壓滅菌鍋，日本Kagoshima Seisakusyo Inc公司；CR21N高速冷凍離心機(jī)，日本日立公司；JTM1812/30-1多功能膜小型試驗(yàn)機(jī)，大連屹東有限公司；FD-1-50真空冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康醫(yī)學(xué)設(shè)備有限公司；ZNCL-DLS磁力加熱鍋，上?？粕邢薰?。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 載銀氧化殼聚糖的制備 取2 g CS 和0.08 g TEMPO溶于200 mL pH 4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中，添加200 μL漆酶，40 ℃水浴鍋中通氧反應(yīng)18 h。反應(yīng)后離心去除不溶物，過超濾膜濃縮濾液后加入適量無水乙醇析出產(chǎn)物，過濾、真空干燥，制得C-COS。稱取0.24 g 樣品，溶于30mL 乙酸- 乙酸鈉緩沖溶液中，加入25 mL 0.01mol·L-1的硝酸銀溶液，50 ℃下反應(yīng)1.5 h。經(jīng)丙酮析出沉淀、濾膜抽濾、乙醇多次洗滌、真空干燥得到C-COS-Ag。

1.2.2 培養(yǎng)基的制備 稱取33 g營養(yǎng)肉湯于1 L蒸餾水中，加熱攪拌至溶解，高壓滅菌、冷卻后備用。

1.2.3 菌懸液的制備 挑取平板活化18～24 h的培養(yǎng)菌落，接種于營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用無菌生理鹽水校正菌液濁度，使其含量范圍在106 CFU·mL-1左右備用。

1.2.4 紅外光譜檢測(cè) 將樣品放于紅外光譜儀上進(jìn)行KBr壓片法檢測(cè)。紅外檢測(cè)掃描的波數(shù)范圍設(shè)定為4 000～500 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為16次。

1.2.5 超微結(jié)構(gòu)的測(cè)定 將少量的待測(cè)樣品通過導(dǎo)電膠粘貼在固定臺(tái)上，噴金后放入樣品腔內(nèi)，抽真空，打開燈絲，在控制軟件中設(shè)定參數(shù)，用掃描電子顯微鏡觀察其表觀形貌。

1.2.6 抑菌性能的測(cè)定 參照卞能源等[15]的方法，采用牛津杯疊法測(cè)定抑菌效果。將200 μL活化的大腸桿菌菌懸液均勻涂布于平板，平板放置4個(gè)牛津杯（十字直徑擺放，保證每孔之間的距離不小于2 cm），然后每孔加入200 μL抗菌劑溶液（稱取0.02 g的樣品置于EP管中，分別加入4 mL醋酸-醋酸鈉緩沖溶液），最后正置放入生化培養(yǎng)箱中，37 ℃培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，每孔取不同方向測(cè)量3次， 取平均值。

參照吳增華[16]的方法，采用二倍稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度（minimal inhibit concentration，MIC）。取無菌96孔酶標(biāo)板，每孔加入100 μL滅菌液體培養(yǎng)基；第1孔中加入100 μL C-COS-Ag溶液，充分混勻后取出100 μL混合液加入到第2孔中，如此逐級(jí)稀釋，然后加入100 μL菌懸液；陰性對(duì)照組分別加入100 μL滅菌液體培養(yǎng)基和C-COS-Ag溶液，不加菌懸液；將最后1行設(shè)為陽性對(duì)照組，不加C-COS-Ag溶液，分別加入100 μL 培養(yǎng)基和菌懸液，混勻后置于37 ℃培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)后觀察并判定是否長菌（其中渾濁表示顯著長菌，澄清表示未長菌），確定MIC。

1.2.7 生長曲線的測(cè)定 參考梅佳林等[17]的方法略作修改。將C-COS-Ag加入營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，使其終水平分別為1×MIC、2×MIC，空白對(duì)照組不添加C-COS-Ag。每管中9 mL溶液，再向每個(gè)試管加入1 mL 1×106 CFU·mL-1的菌液，在37 ℃下培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)0、2、4、6、8、12、24 h時(shí)測(cè)定吸光度OD600值，并繪制微生物的生長曲線，重復(fù)3次。

1.2.8 細(xì)菌胞內(nèi)小分子物質(zhì)泄漏（電導(dǎo)率）的測(cè)定 參考梅佳林等[17]的方法測(cè)電導(dǎo)率。取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的菌液，8 000 r·min-1離心10 min，棄上清收集菌體，用PBS洗滌3次形成重懸液。向重懸液中分別加入1×MIC和2×MIC的C-COS-Ag，于搖床中100 r·min-1 培養(yǎng)6 h，每小時(shí)取樣測(cè)電導(dǎo)率。

1.2.9 細(xì)菌胞內(nèi)核酸類物質(zhì)泄漏的測(cè)定 按1.2.8中的方法制備重懸液并分別加入1×MIC和2×MIC 的C-COS-Ag，然后在37 ℃、100 r·min-1 搖床中培養(yǎng)6 h，取菌懸液于6 000 r·min-1 離心10 min，濾膜過濾。使用酶標(biāo)儀測(cè)定其OD260值。

1.2.10 細(xì)菌胞內(nèi)蛋白質(zhì)泄漏的測(cè)定 按1.2.8中的方法制備重懸液并分別加入1×MIC 和2×MIC的C-COS-Ag，然后搖床中100 r·min-1培養(yǎng)6 h，每2 h取菌懸液離心，上清液用蛋白測(cè)定試劑盒（考馬斯亮藍(lán)法[18]）測(cè)蛋白質(zhì)含量。

1.2.11 細(xì)菌胞內(nèi)酶活性的測(cè)定 按1.2.8 中的方法制備重懸液并分別加入1×MIC 和2×MIC 的C-COS-Ag，然后在37 ℃、100 r·min-1 搖床中培養(yǎng)4 h，參照測(cè)試盒說明書方法，分別測(cè)定堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）活性和β-半乳糖苷酶（β-galactosidase， β-GAL）活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅外光譜檢測(cè)分析

C-COS的紅外光譜圖特征吸收峰與CS基本一致，但有以下不同：波數(shù)為3 600 cm-1到3 200 cm-1處，C-COS比CS的吸收峰譜帶明顯變寬，且向低頻方向遷移，推測(cè)C-COS形成了更多的氫鍵，導(dǎo)致吸收峰發(fā)生了上述變化；在1 643 cm-1處出現(xiàn)強(qiáng)度明顯高于酰胺Ⅱ譜帶的羧酸根C=O伸縮振動(dòng)峰，另外在1 410 和1 070 cm-1處吸收峰強(qiáng)度增強(qiáng)，表明存在羧酸根、C-O的伸縮振動(dòng)效應(yīng)。以上結(jié)果表明，CS在漆酶/TEMPO體系中經(jīng)氧化反應(yīng)引入了羧基。

由圖1 可知，C-COS 中N-H 和O-H 伸縮振動(dòng)偶合形成一寬峰，吸收峰在3 400 cm-1處。與Ag+結(jié)合后，在C-COS-Ag 的譜圖中向低頻方向移動(dòng)到3 300 cm-1 處，且峰形略有變化，說明C-COS 上的-NH2 或-OH 可能參與了配位。C-COS-Ag 在1 643 cm-1處羧酸根C=O的伸縮振動(dòng)峰面積變小，說明羧基與Ag+發(fā)生了反應(yīng)。

2.2 超微結(jié)構(gòu)的測(cè)定分析

通過掃描電子顯微鏡觀察CS、C-COS 和C-COS-Ag的表面形貌（圖2）發(fā)現(xiàn)，其表面結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化。CS表面粗糙，顆粒尺寸不均勻，材料彼此緊密重疊（圖2A、B）。C-COS具有相對(duì)松散的分子結(jié)構(gòu)，其表面主要由堆積的球形顆粒組成（圖2C、D）。以上結(jié)果表明，CS分子中引入的羧基增強(qiáng)了分子內(nèi)的相互作用力，有利于其自身雙螺旋結(jié)構(gòu)的大空間卷曲。C-COS-Ag表面粗糙，大量粒狀材料分散在表面上（圖2E、F），因此可以推斷Ag已配位到C-COS上。

2.3 抑菌性能的分析

由CS、C-COS-Ag 的抑菌效果（表1）可知，C-COS-Ag對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為（22.75±1.50）和（13.75±2.50） mm，與CS相比，C-COS-Ag的抑菌效果明顯增強(qiáng)，這是由于CS經(jīng)氧化及與硝酸銀的配位，進(jìn)一步提高了其抑菌性?；贑-COS-Ag的抑菌效果，通過二倍稀釋法測(cè)定其對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC均為6.10 μg·mL-1，明顯低于CS。

2.4 抑菌機(jī)理分析

2.4.1 C-COS-Ag 對(duì)細(xì)菌生長的影響 由圖3、4可知，隨著時(shí)間的延長，對(duì)照組大腸桿菌、金黃色葡萄球菌生長繁殖逐漸加快，基本符合細(xì)菌的典型生長規(guī)律（S型生長）；而加入C-COS-Ag后，1×MIC、2×MIC組中2種細(xì)菌的OD600均無明顯變化，表明C-COS-Ag能延遲對(duì)數(shù)期的到來，降低菌株的生長速率，有效抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的生長繁殖。C-COS-Ag含量越高，抑制效果越好，這種現(xiàn)象與其他抑菌物質(zhì)對(duì)細(xì)菌的生長抑制效果一致[19]。

2.4.2 C-COS-Ag對(duì)細(xì)菌胞內(nèi)小分子物質(zhì)泄漏（電導(dǎo)率）的影響 圖5、6反映了C-COS-Ag對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌電導(dǎo)率的影響，當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞膜受損時(shí)，通透性增加，會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)鉀鹽、磷酸鹽等小分子滲出，使菌液電導(dǎo)率升高[20]?？梢钥闯?，隨著時(shí)間的延長，對(duì)照組菌液電導(dǎo)率無明顯變化，表明細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性保持較好；加入1×MIC和2×MIC的C-COS-Ag后菌液電導(dǎo)率逐漸上升，表明C-COSAg破壞了大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜，使其通透性增加，導(dǎo)致菌液電導(dǎo)率明顯上升。

2.4.3 C-COS-Ag對(duì)細(xì)菌胞內(nèi)核酸類物質(zhì)泄漏的影響 如圖7、8所示，含C-COS-Ag菌懸液的OD260值隨時(shí)間的延長迅速升高，而對(duì)照組變化不明顯，說明C-COS-Ag會(huì)使細(xì)菌細(xì)胞膜發(fā)生破損，導(dǎo)致核酸類物質(zhì)泄露出來，表明其對(duì)細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生不良影響。這與肉桂醛會(huì)破壞大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜完整性，導(dǎo)致內(nèi)容物釋放的結(jié)論[21-22]類似。

2.4.4 C-COS-Ag對(duì)細(xì)菌胞內(nèi)蛋白質(zhì)泄漏的影響 蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的主要載體，具有運(yùn)送營養(yǎng)物質(zhì)、維持新陳代謝等重要功能，是機(jī)體不可或缺的重要部分， 當(dāng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞，細(xì)胞膜滲透性增加，蛋白等大分子物質(zhì)會(huì)大量滲出[23]。由大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的胞外蛋白含量變化（圖9、10）可知，由于細(xì)菌的正常生長繁殖消耗，導(dǎo)致對(duì)照組培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)含量有所降低，而經(jīng)過C-COS-Ag作用后，細(xì)菌胞外蛋白質(zhì)含量逐漸上升，說明C-COS-Ag使細(xì)胞膜的通透性增大，甚至可以損壞細(xì)胞膜，導(dǎo)致蛋白質(zhì)流出。

2.4.5 C-COS-Ag對(duì)細(xì)菌胞內(nèi)酶活性的影響 細(xì)胞壁完整性主要是通過AKP和β-GAL活性測(cè)定。AKP是一種位于細(xì)胞壁和細(xì)胞膜之間的細(xì)胞內(nèi)酶，在正常情況下，細(xì)胞外環(huán)境中無法檢測(cè)到其活性，但如果細(xì)胞壁受損，則會(huì)導(dǎo)致其泄漏到細(xì)胞外環(huán)境中，從而提高環(huán)境中的酶活性[24]。β-GAL活性主要是針對(duì)細(xì)胞壁代謝中降解的多糖、糖蛋白以及半乳糖殘基的水解，通過測(cè)定釋放出的半乳糖物質(zhì)進(jìn)行分析，β-GAL活性明顯下降說明菌株細(xì)胞壁受損，半乳糖合成途徑受阻[25]。從表2可以看出，經(jīng)過C-COS-Ag處理后，AKP的活性與對(duì)照組相比有所增加，β-GAL活性有所下降，表明C-COS-Ag使細(xì)胞壁受損，從而抑制細(xì)菌生長。

3 討論

目前，纖維素中C-6羥基選擇性氧化的最常見方法是在堿性條件下通過自由基TEMPO 與NaBr/NaOCl 結(jié)合，該技術(shù)較成熟，且得到一定應(yīng)用，但反應(yīng)過程存在一些缺點(diǎn)，例如反應(yīng)條件較復(fù)雜，反應(yīng)過程中會(huì)產(chǎn)生溴代副產(chǎn)物以及氯代副產(chǎn)物等，且反應(yīng)產(chǎn)生的大量氯氣會(huì)污染環(huán)境[26‐27]。在工業(yè)過程中使用酶技術(shù)可以減少其對(duì)環(huán)境和經(jīng)濟(jì)的負(fù)面影響。漆酶/TEMPO 介導(dǎo)的氧化比TEMPO/NaBr/NaClO 處理在更溫和的條件下進(jìn)行，產(chǎn)生的環(huán)境有害殘留物更少[28‐29]，符合國家工業(yè)綠色低碳轉(zhuǎn)型的發(fā)展理念。

將殼聚糖及其衍生物與無機(jī)抗菌劑復(fù)配，其協(xié)同作用可有效改善抑菌效果，銀是無機(jī)抗菌材料，可通過緩慢釋放作用，改善其抗菌的持久性。王祖華等[30]制備了載銀殼聚糖，發(fā)現(xiàn)其對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC為80 μg·mL-1，明顯高于本研究制備的載銀氧化殼聚糖，表明載銀氧化殼聚糖的抑菌性能優(yōu)于載銀殼聚糖。趙儒男等[31]利用新型殼聚糖乳液對(duì)丁香酚進(jìn)行直接包載，研究其抑菌效果，發(fā)現(xiàn)其能夠顯著抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的生長，MIC為312.5 μg·mL-1，也明顯高于本研究制備的載銀氧化殼聚糖，表明載銀氧化殼聚糖的抑菌性能優(yōu)于丁香酚-殼聚糖乳液。朱麗[32]制備了溶菌酶/TEMPO/漆酶殼聚糖抑菌劑、溶菌酶/殼聚糖酶-TEMPO/漆酶殼聚糖抑菌劑、肉桂醛/TEMPO/漆酶殼聚糖抑菌劑和肉桂醛/殼聚糖酶-TEMPO/漆酶殼聚糖抑菌劑，并對(duì)這4種抑菌劑的抑菌效果進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)溶菌酶-TLCS抑菌劑對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果最好，抑菌圈直徑分別為13.89和13.13 mm，抑菌效果均低于本研究制備的載銀氧化殼聚糖。

本研究通過抑菌活性試驗(yàn)及抗菌機(jī)理的探索，進(jìn)一步驗(yàn)證了載銀氧化殼聚糖對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有顯著抑菌效果，其原理是通過改變細(xì)胞膜的通透性，使菌液電導(dǎo)率升高，核酸、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)滲出，AKP活性上升，細(xì)胞壁受損，β-GAL活性下降，半乳糖合成途徑受阻，細(xì)菌正常代謝受到影響，從而抑制細(xì)菌的生長。研究結(jié)果可為殼聚糖資源的利用提供理論依據(jù)。未來，關(guān)于載銀氧化殼聚糖的穩(wěn)定性以及對(duì)霉菌和真菌的作用有待進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯：胡立霞）