劉旭陽 孫玉芳 湯舒潔 項(xiàng)濤

【摘要】目的 研究血清hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297與心源性腦卒中的關(guān)聯(lián)性，及其作為診斷標(biāo)志物的可行性。方法 GEO數(shù)據(jù)庫整合分析篩選出可能的心源性腦卒中特異性miRNA（hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297），通過孟德爾隨機(jī)化與共定位分析驗(yàn)證兩個(gè)miRNA對心源性腦卒中發(fā)病的危險(xiǎn)作用，并對它們在miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的靶基因進(jìn)行富集分析來尋找相關(guān)通路。納入2022年3月—2023年1月于成都市第三人民醫(yī)院急診科診斷新發(fā)缺血性腦卒中的患者共103例，其中心源性腦卒中22例（病例組），非心源性腦卒中81例（對照組）。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測血清hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297的表達(dá)水平，多因素邏輯回歸分析其與心源性腦卒中的相關(guān)性，采用ROC曲線評估預(yù)測價(jià)值。結(jié)果 孟德爾隨機(jī)化分析提示遺傳預(yù)測的循環(huán)血液中hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297表達(dá)增高分別使心源性腦卒中的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加46%和70%。共定位分析提示循環(huán)血液中hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297的表達(dá)與心源性腦卒中存在共享遺傳變異的概率分別為95%和86%。病例組血清hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297表達(dá)水平顯著高于對照組（P＜0.05），hsa-miR3173-5p（OR=6.30，95%CI 1.79～22.14，P=0.004）和hsa-miR-4297（OR=12.38，95%CI 1.97～77.72，P=0.007）與心源性腦卒中有顯著關(guān)聯(lián)。hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297的ROC曲線下面積（AUC）分別為0.705和0.624，將hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297聯(lián)合心房顫動(dòng)共同進(jìn)行分析，其AUC為0.842。結(jié)論 hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297的表達(dá)水平與心源性腦卒中具有密切關(guān)聯(lián)，有望作為心源性腦卒中的診斷標(biāo)志物。

【關(guān)鍵詞】心源性腦卒中；miRNA；診斷標(biāo)志物

【DOI】10.16806/j.cnki.issn.1004-3934.2024.05.019

Serum hsa-miR3173-5p and hsa-miR-4297 as Diagnostic Markers of Cardiogenic Stroke

【Abstract】Objective To explore the levels of serum hsa-miR3173-5p and hsa-miR-4297 and their feasibility as the diagnostic markers in cardiogenic stroke.Methods GEO database integration analysis screened out possible cardiogenic stroke-specific miRNAs （hsa-miR3173-5p and hsa-miR-4297），verified the risk role of the two miRNAs in the development of cardiogenic stroke by Mendelian randomization and colocalization analysis，and their target genes in the miRNA-mRNA regulatory network were enriched to search for related pathways.A total of 103 patients newly diagnosed with ischemic stroke in the emergency department from March 2022 to January 2023 were included，among which 22 cases were cardiogenic stroke （case group） and 81 were non-cardiogenic stroke （control group）.The expression levels of serum hsa-miR3173-5p and hsa-miR-4297 were detected by real-time quantitative polymerase chain reaction，and their correlation with cardiogenic stroke was analyzed by multivariable logistic regression.The predictive value was evaluated using the receiver operating characteristic （ROC） curve.Results Mendelian randomization analysis suggested that genetically predicted increased expression of hsa-miR3173-5p and hsa-miR-4297 in circulating blood increased the risk of cardiogenic stroke by 46% and 70% respectively.Colocalization analysis suggested that the expression of hsa-miR3173-5p and hsa-miR-4297 in circulating blood has a 95% and 86% probability of shared genetic variation with cardiogenic stroke，respectively.The expression levels of serum hsa-miR3173-5p and hsa-miR-4297 in the case group were significantly higher than in the control group （P<0.05），and hsa-miR3173-5p（OR=6.30，95%CI 1.79～22.14，P=0.004） and hsa-miR-4297（OR=12.38，95%CI 1.97～77.72，P=0.007） were significantly associated with cardiogenic stroke.The area under the ROC curve （AUC） for hsa-miR3173-5p and hsa-miR-4297 were 0.705 and 0.624 respectively，and the AUC of the combined analysis of hsa-miR3173-5p and hsa-miR-4297 with atrial fibrillation is 0.842.Conclusion The expression levels of hsa-miR3173-5p and hsa-miR-4297 are closely related to cardiogenic stroke，and are promising as diagnostic markers for cardiogenic stroke.

【Keywords】Cardiogenic stroke;miRNA;Diagnostic marker

腦卒中是全世界重大公共衛(wèi)生問題，是第二位常見的死亡原因和第三位致殘的主要疾?。?］，給社會(huì)和家庭造成極大負(fù)擔(dān)。缺血性腦卒中（ischemic stroke，IS）占所有腦卒中的80%以上［2］，目前國際廣泛使用的TOAST病因?qū)W分型將IS分為5個(gè)亞型［3］：大動(dòng)脈粥樣硬化（large-artery atherosclerosis，LAA）型、心源性栓塞（cardioembolic，CE）型、小動(dòng)脈閉塞（small-artery occlusion lacunar，SAO）型、其他明確病因（stroke of other determined etiology，SOE）型和不明原因（stroke of other undertermined etiology，SUE）型，準(zhǔn)確分型對臨床決策和預(yù)后評估至關(guān)重要。其中CE型病情最重、死亡率最高、預(yù)后最差，約占IS總數(shù)的20%［4］，早期診斷CE型腦卒中是IS救治的重點(diǎn)和難點(diǎn)之一。

miRNA在不同疾病中起調(diào)控作用，穩(wěn)定性好，易檢測，具有作為疾病診斷標(biāo)志物的廣泛前景［5］。本課題組前期基于生物信息學(xué)方法，篩選出可能與CE型腦卒中相關(guān)的特異性miRNA（hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297），現(xiàn)擬研究hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297在急性IS患者中的表達(dá)水平，以期提高CE型腦卒中患者早期診斷率，為后續(xù)治療方案的選擇提供參考。

1 資料與方法

1.1 生物信息學(xué)方法

本課題組前期已經(jīng)通過生物信息學(xué)方法對已發(fā)表與腦卒中相關(guān)的miRNA和mRNA高通量數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析，運(yùn)用多種工具、算法分析預(yù)測靶向miRNA-mRNA關(guān)系，然后用Cytoscape軟件構(gòu)建由miRNA和mRNA組成的生物信息調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。進(jìn)一步通過孟德爾隨機(jī)化與共定位分析驗(yàn)證了兩個(gè)miRNA對CE型腦卒中發(fā)病的危險(xiǎn)作用，通過預(yù)測miRNA的靶標(biāo)mRNA，并分析其功能通路來預(yù)測循環(huán)miRNA參與腦栓塞的分子機(jī)制。

1.2 研究對象

前瞻性納入2022年3月—2023年1月于成都市第三人民醫(yī)院急診科就診并入院治療的急性IS患者共103例，所有研究對象均在急診科完成血液標(biāo)本采集、病史記錄和生命體征測量，并根據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表（National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS）進(jìn)行評分［6］，在住院期間完成血常規(guī)、血生化（包括心肌酶、腦鈉肽）、動(dòng)態(tài)心電圖、心臟彩超、血管神經(jīng)影像學(xué)/腦血管造影等檢查。參考《心源性卒中診斷中國專家共識（2020）》［7］，由兩名神經(jīng)內(nèi)科主任醫(yī)師共同對入組患者進(jìn)行診斷和TOAST病因?qū)W分型，根據(jù)結(jié)果分為病例組（CE型腦卒中）和對照組（非CE型腦卒中）。

納入標(biāo)準(zhǔn)： （1）發(fā)病72 h以內(nèi)，診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》［8］；（2）首次發(fā)病患者；（3）既往診斷腦卒中，無明顯神經(jīng)功能缺失，再發(fā)IS的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）出血性腦卒中，包括腦梗死后出血的患者；（2）有神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)疾病，近期使用免疫抑制劑、激素等藥物的患者；（3）接受放化療治療的惡性腫瘤患者；（4）關(guān)鍵指標(biāo)缺失的病例。

本研究已通過成都市第三人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號2021-S-30），所有研究對象及家屬均已簽署同意書。

1.3 標(biāo)本采集和miRNA檢測

符合標(biāo)準(zhǔn)的患者，均在到達(dá)急診科1 h內(nèi)完成血液標(biāo)本采集，采取梯度離心方法，放置于-80 ℃冰箱中冷凍保存，24 h內(nèi)行總RNA提取、純化。miRNA檢測步驟如下：（1）血漿miRNA的提??；（2）血漿miRNA濃度及純度的鑒定；（3）RNA Poly（A）加尾；（4）逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；（5）實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)檢測目標(biāo)miRNA相對表達(dá)；（6）PCR數(shù)據(jù)的采集和處理；（7）血清miRNA表達(dá)量的數(shù)據(jù)處理方法為2-ΔΔCT法。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用R 4.2.2軟件和SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。滿足正態(tài)分布和方差齊性的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較選擇獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。本研究多組比較中，各組數(shù)據(jù)均通過正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，采用單因素方差分析。將單因素分析有意義的指標(biāo)納入多因素邏輯回歸分析。用ROC曲線評估hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297對CE型腦卒中的預(yù)測價(jià)值，并計(jì)算曲線下面積（area under the curve，AUC），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 孟德爾隨機(jī)化分析和共定位分析

基于miRNA eQTL數(shù)據(jù)的孟德爾隨機(jī)化分析提示，遺傳預(yù)測循環(huán)血液中的hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297表達(dá)增高，可使CE型腦卒中的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)分別增加46%和70%（圖1A和1C）。共定位分析提示循環(huán)血液中hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297的表達(dá)與CE型腦卒中存在共享遺傳變異的概率分別為95%和86%（圖1B和1D）。

2.2 兩組患者的一般情況

病例組的性別、年齡、血壓、吸煙、飲酒、高血壓、糖尿病、血常規(guī)、凝血、肝腎功能、血脂和對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。病例組中合并心房顫動(dòng)（房顫）10例、合并冠心病10例，比例明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05） 。病例組NIHSS 評分高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.3 兩組患者h(yuǎn)sa-miR3173-5p和hsa-miR-4297的表達(dá)水平

hsa-miR3173-5p在病例組和對照組表達(dá)量分別為1.44±0.67和0.98±0.56，hsa-miR-4297在病例組和對照組表達(dá)量分別為0.94±0.46和0.72±0.39。hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297在病例組的表達(dá)水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

2.4 對照組中不同TOAST分型患者的hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297表達(dá)水平

將對照組中患者根據(jù)TOAST病因?qū)W分型進(jìn)行分組，由于本研究中SOE型無入組患者，故對照組患者分為LAA組、SAO組、SUE組。將3組患者h(yuǎn)sa-miR3173-5p和hsa-miR-4297 表達(dá)水平進(jìn)行對比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

2.5 多因素邏輯回歸分析

結(jié)合既往文獻(xiàn)報(bào)告CE型腦卒中的危險(xiǎn)因素［7］，以是否發(fā)生IS為因變量，將單因素分析中P＜0.05的變量進(jìn)行邏輯回歸分析，結(jié)果顯示房顫、hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297 是CE型腦卒中發(fā)生的危險(xiǎn)因素，見表4。

2.6 hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297作為CE型腦卒中診斷標(biāo)志物可行性分析

采用ROC曲線的方法分別分析hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297作為CE型腦卒中分子標(biāo)志物的可行性（圖2）。結(jié)果顯示，hsa-miR3173-5p的AUC為0.705（P＜0.05）；hsa-miR-4297的AUC為0.624（P＞0.05）；將hsa-miR3173-5p、hsa-miR-4297和房顫進(jìn)行聯(lián)合分析，AUC為0.842（P＜0.05），見表5。

2.7 腦卒中患者發(fā)病相關(guān)hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297及靶基因的生物學(xué)功能

利用miRDB和TargetScan Human等數(shù)據(jù)庫預(yù)測了兩個(gè)未被研究的miRNA（hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297）的靶基因（564和833個(gè)），見圖3。對靶基因的富集分析提示，hsa-miR3173-5p的靶基因主要富集在“嗜同性細(xì)胞通過細(xì)胞膜黏附分子黏附、運(yùn)動(dòng)的行為、細(xì)胞通過細(xì)胞膜黏附分子進(jìn)行細(xì)胞黏附、對細(xì)胞因子的反應(yīng)”等細(xì)胞黏附和細(xì)胞因子相關(guān)通路（圖4A）。而hsa-miR-4297的靶基因主要富集在“通過質(zhì)膜黏附分子實(shí)現(xiàn)同親細(xì)胞黏附、運(yùn)動(dòng)的行為、單核細(xì)胞遷徙、細(xì)胞對細(xì)胞因子刺激的反應(yīng)”等細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移和細(xì)胞因子相關(guān)通路（圖4B）。

3 討論

由心臟和主動(dòng)脈弓的栓子引起的腦栓塞稱為CE型腦卒中，相較于其他類型，CE型腦卒中病因復(fù)雜、病情嚴(yán)重［8-10］，且發(fā)病率在急性IS患者中不斷升高［11］。對其確診分型主要依賴于病史及心電圖、心臟超聲、磁共振成像、腦血管造影等輔助檢查尋找病因?qū)W證據(jù)［11］，但在實(shí)際工作中，部分檢查需提前預(yù)約，且存在費(fèi)用偏高的情況，完成度不盡人意，導(dǎo)致了患者早期TOAST分型準(zhǔn)確度較差［11-12］。國內(nèi)外研究者嘗試尋找CE型腦卒中的預(yù)測指標(biāo)，其中腦鈉肽和N末端腦鈉肽前體被證實(shí)有一定預(yù)測價(jià)值［13］，但其主要適用于心力衰竭患者的評估，對CE型腦卒中診斷特異性低。尋找合適的CE型腦卒中診斷標(biāo)志物，有利于更高效、準(zhǔn)確地篩選出CE型腦卒中患者，從而實(shí)現(xiàn)制定系統(tǒng)化、個(gè)體化的診療策略和選擇最佳的二級預(yù)防措施［11］。

miRNA具備調(diào)控作用，有著穩(wěn)定性好、容易檢測的優(yōu)點(diǎn)，是良好的疾病診斷標(biāo)志物［14］。已有相關(guān)研究［15-16］證實(shí)，miRNA在大腦不同種類細(xì)胞中具有很高的表達(dá)水平，可作為生物標(biāo)志物來區(qū)分腦卒中亞型。有研究［17-18］發(fā)現(xiàn)，在出血性腦卒中患者血漿中，miR-124-3p水平高于IS患者，而miR-16水平低于IS患者；Li等［19］發(fā)現(xiàn)115個(gè)miRNA在IS中差異表達(dá)；Modak等［20］發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，在CE型腦卒中患者中觀察到14個(gè)miRNA的顯著差異表達(dá)。因此，本研究選擇miRNA作為研究對象來預(yù)測CE型腦卒中。目前，微陣列和轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（RNA-seq）已被廣泛用于測量轉(zhuǎn)錄物、發(fā)現(xiàn)異常表達(dá)基因和識別新的生物標(biāo)志物，并采用生物信息學(xué)方法處理這些數(shù)據(jù)。GEO數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）為全球研究者提供了微陣列和RNA-seq數(shù)據(jù)。本研究前期利用GEO數(shù)據(jù)庫，通過生物信息學(xué)方法對已發(fā)表腦栓塞相關(guān)的miRNA和mRNA高通量數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析并進(jìn)一步全面檢索中英文文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)7個(gè)miRNA有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道（hsa-let-7b-5p、hsa-miR-3148、hsa-miR-185-5p、hsa-miR-32-3p、hsa-miR-133b、hsa-miR-940和hsa-miR-1237-3p），涉及腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病等多種疾病，但是hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297兩個(gè)miRNA截至目前（2022.02.03）沒有任何文獻(xiàn)報(bào)道。本研究基于miRNA eQTL數(shù)據(jù)的孟德爾隨機(jī)化分析提示遺傳預(yù)測的循環(huán)血液中hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297表達(dá)增高分別使CE型腦卒中的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加46%和70%，共定位分析提示循環(huán)血液中hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297的表達(dá)與CE型腦卒中存在共享遺傳變異的概率分別為95%和86%。因此推測它們可能與CE型腦卒中有關(guān)，而在miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的靶基因富集分析提示，其很有可能通過“嗜同性細(xì)胞通過細(xì)胞膜黏附分子黏附、運(yùn)動(dòng)的行為、細(xì)胞通過細(xì)胞膜黏附分子進(jìn)行細(xì)胞黏附、對細(xì)胞因子的反應(yīng)”等細(xì)胞黏附和細(xì)胞因子相關(guān)通路導(dǎo)致CE型腦卒中。

本研究中，CE型腦卒中患者外周血hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297表達(dá)水平明顯高于對照組，將對照組進(jìn)行亞組分析，發(fā)現(xiàn)hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297表達(dá)水平在LAA組、SAO組和SUE組中無明顯差異，因此考慮hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297可能在CE型腦卒中特異性表達(dá)。納入患者的各臨床指標(biāo)，單因素分析顯示冠心病、房顫、NIHSS評分、hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297是CE型腦卒中的危險(xiǎn)因素，進(jìn)一步行多因素邏輯回歸分析，房顫、hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297仍與CE型腦卒中顯著相關(guān)。分別將hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297進(jìn)行ROC曲線分析，結(jié)果顯示hsa-miR3173-5p的AUC為0.705，具有一定的準(zhǔn)確度，而hsa-miR-4297的AUC為0.624（P＞0.05），單獨(dú)作為診斷標(biāo)志物的效能較差。房顫是CE型腦卒中的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［7］，并且由于血液中miRNA具有相關(guān)性，不同miRNA進(jìn)行疾病預(yù)測具有聯(lián)合作用［21］，因此將房顫、hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297進(jìn)行聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)其具有較好的準(zhǔn)確度（AUC為0.842），且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，本研究推測hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297的表達(dá)水平升高可能與CE型腦卒中發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，后續(xù)期待納入更多的樣本量來評估預(yù)測價(jià)值。

研究發(fā)現(xiàn)，在患膠質(zhì)瘤的女性患者中，miR-4297與平均血小板體積呈正相關(guān)［22］，血小板與血管炎癥反應(yīng)、血栓形成、動(dòng)脈硬化密切關(guān)聯(lián)［23］。本研究中hsa-miR-4297表達(dá)水平與血小板數(shù)量呈正相關(guān)，考慮hsa-miR-4297可能在血小板的合成代謝過程中起了一定作用。進(jìn)一步對hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297的靶基因進(jìn)行蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析提示，hsa-miR3173-5p靶基因的hub基因主要是STAT3、HTT、AP2B1，而hsa-miR-4297靶基因的hub基因主要是PRKACB、MED1、AKT2、CAMK2A、PTEN等。本研究是國內(nèi)外首個(gè)關(guān)于特異性血清miRNA作為CE型腦卒中診斷標(biāo)志物的研究，相關(guān)miRNA及其具體調(diào)控方式還缺乏報(bào)告，其靶基因與CE型腦卒中的具體機(jī)制尚需更深入的探索。

綜上所述，hsa-miR3173-5p和hsa-miR-4297與CE型腦卒中密切相關(guān)，聯(lián)合分析時(shí)具有較好的預(yù)測性，有望成為CE型腦卒中的診斷標(biāo)志物。對其具體靶基因調(diào)節(jié)機(jī)制、不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平變化、早期干預(yù)是否有利于患者預(yù)后等問題，有待進(jìn)一步研究。

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