蘇賀楠，秦六月，楊雙娟，魏小春，趙艷艷，王志勇，張文靜，張曉偉，原玉香

摘? ? 要：根腫病是由蕓薹根腫菌專性侵染十字花科蔬菜作物引起的一種世界性土傳病害，對大白菜等蔬菜造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。以抗根腫病大白菜DH系（DH40R）和感病大白菜DH系（DH199S）為試驗材料，通過觀察根腫菌侵染的差異、防御酶活性、MDA和可溶性蛋白含量的測定研究大白菜根腫病抗性機(jī)制。結(jié)果表明，DH40R和DH199S的根毛侵染發(fā)生在接種后第2天，隨著侵染時間的延長，出現(xiàn)皮層侵染，但DH40R的皮層侵染在接菌第8天后被阻斷，對根腫病具有完全的抗性，而DH199S在接菌8 d后，根部有腫瘤產(chǎn)生。在接菌后2、8和13 d，分別對抗、感材料接菌和未接菌根部的防御酶活性、MDA和可溶性蛋白含量進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)DH40R在這3個時間點接菌后SOD的活性均顯著高于未接菌對照組，在第8天達(dá)到最高峰值，顯著高于DH199S；DH40R接菌后的CAT活性在第8 天達(dá)到最高峰值1 572.68 μmol·mL-1·min-1，顯著高于DH40R未接菌對照組和接菌及未接菌處理的DH199S；在接菌后8和13 d，抗根腫病大白菜DH系DH40R的MDA含量顯著低于接菌后的感病DH系DH199S；接菌后DH40R的可溶性蛋白含量在接菌后8 和13 d均顯著高于DH199S。研究結(jié)果可為后期解析大白菜根腫病抗性相關(guān)機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：大白菜；根腫病；侵染過程；生理生化指標(biāo)

中圖分類號：S634.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-2871（2024）06-045-07

Infection process and physiological and biochemical difference between clubroot-resistant and-susceptible Chinese cabbage lines

SU Henan， QIN Liuyue， YANG Shuangjuan， WEI Xiaochun， ZHAO Yanyan， WANG Zhiyong， ZHANG Wenjing， ZHANG Xiaowei， YUAN Yuxiang

（Institute of Vegetables， Henan Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450002， Henan， China）

Abstract： Clubroot is a worldwide soil-borne disease of the cruciferous plants caused by Plasmodiophora brassicae， leading to serious economic losses to cabbage and other Brassica crops. In order to clarify the clubroot resistance mechanism of Brassica rapa， this study was conducted to detect the differences of infection process， defense enzyme activity and the content of MDA and soluble protein between clubroot-resistant （DH40R） and clubroot-susceptible（DH199S）Chinese cabbage lines. The results showed that the primary （root hair infection） stage was at 2 day after inoculation（dai）in both clubroot-resistant （DH40R） and clubroot-susceptible （DH199S） Chinese cabbage lines. With the extension of the infection time， cortical infection was blocked and showed complete P. brassicae resistance in DH40R， while in DH199S， swollen root occurred in the root after 8 dai. The defense enzyme activity and the content of MDA and soluble protein were measured at 2， 8 and 13 dai. The activity of SOD in DH40R after inoculation is significantly higher than the mock at the whole experimental stage， the highest peak was reached at 8 dai， which was significantly higher than that of DH199S. The CAT activity of DH40R after inoculation reached the highest peak 1 572.68 μmol·mL-1·min-1 at 8 dai， which was significantly higher than the mock of DH40R and the inoculated and uninoculated DH199S. The MDA content of DH40R was significantly lower than that of DH199S at 8 and 13 dai. The soluble protein content in DH40R was higher than that of DH199S at 8 and 13 dai. Overall， these results can lay foundation for further exploration of resistance mechanism of B. rapa against P. brassicae infection.

Key words： Chinese cabbage; Clubroot; Infection; Physiological and biochemical index

根腫病是由蕓薹根腫菌（Plasmodiophora brassicae Woron.）侵染引起的全球范圍內(nèi)專性寄生于十字花科蔬菜作物的一種重要土傳病害，在全世界多個國家均有分布，我國最早在西南部和中部地區(qū)發(fā)病且尤為嚴(yán)重[1]。十字花科感病植株被根腫菌侵染后，寄主植物的地上和地下部分在侵染早期均與正常植株無明顯的差異，然而到侵染后期，寄主植株地上部分的葉片逐漸黃化、萎蔫，地下的根部組織逐漸形成肉眼可見的巨大根瘤，嚴(yán)重影響十字花科蔬菜作物的產(chǎn)量[2]。

蕓薹根腫菌的生活史主要分成兩個階段，即初級（根毛）侵染和次級（皮層）侵染。在初級侵染時期，土壤中的休眠孢子在適宜條件下萌發(fā)成為初級游動孢子，游動到根毛后刺入細(xì)胞壁進(jìn)入根毛，以初級原生質(zhì)團(tuán)的形式存在，寄主的表型此時沒有變化。根毛中的游動孢子不斷地分裂繁殖，形成游動孢子囊（內(nèi)含有4～16個次生游動孢子），簇生在根毛中，次生游動孢子再次穿透細(xì)胞壁侵入皮層細(xì)胞，這個階段稱為次級侵染。次級游動孢子進(jìn)入皮層細(xì)胞后擾亂根部的正常發(fā)育，導(dǎo)致皮層細(xì)胞不斷分裂膨大并產(chǎn)生大量次級游動孢子囊，造成寄主的根部異常膨大[3-4]。劉亞奇[5]通過觀察不同抗性油菜接種根腫菌后的根毛侵染變化，發(fā)現(xiàn)第5天時感病材料N109-7和抗病材料MC0411均出現(xiàn)根毛侵染，且第15天時感病材料出現(xiàn)大量的皮層侵染，而抗病材料未觀察到皮層侵染。

當(dāng)寄主植株被病原菌侵染后會產(chǎn)生一系列的防御反應(yīng)，其中寄主抗性在生理生化方面主要與防御酶的代謝活性密切相關(guān)，常見的防御酶主要包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），過氧化氫酶（catalase，CAT）等，可能通過參與清除細(xì)胞內(nèi)的活性氧，從而起重要的調(diào)控作用，因而防御酶的活性變化與植物的抗病性緊密相關(guān)[6]。當(dāng)寄主植株體內(nèi)遭受高活性氧水平的毒害時，SOD在清除自由基方面發(fā)揮作用，因此在植物的防御反應(yīng)中SOD首先表現(xiàn)出重要作用[7]。況寧寧等[8]發(fā)現(xiàn)，大白菜侵染根腫菌后，根部的SOD活性明顯高于未侵染對照組；孫勝男等[4]的研究結(jié)果表明，對兩個抗性不同的蘿卜品種接種根腫菌后，抗病型POD和SOD活性明顯高于感病型。CAT主要是通過抗氧化作用來保護(hù)植物的細(xì)胞膜，清除植物組織中過多的H2O2，參與多種植物防御機(jī)制，增強(qiáng)植物的抗逆能力[9]。不同抗性的甘藍(lán)品種接種根腫菌后，抗病甘藍(lán)品種的SOD和CAT活性都高于耐病品種，后者高于感病品種，且在第10天時差異最為顯著，即SOD和CAT活性越大則甘藍(lán)的抗性越強(qiáng)[10]。另外，植物在遭受病原菌侵害以后，還伴隨著其他非酶類生理指標(biāo)的變化，比如丙二醛（malondialdehyde，MDA）和可溶性蛋白含量等，MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，高含量的MDA表明植物膜脂受到嚴(yán)重?fù)p傷。朱紅芳等[11]的研究表明，可溶性蛋白和MDA含量可以作為抗根腫病品種早期篩選的輔助生理指標(biāo)。

大白菜（Brassica rapa L. ssp. pekinensis）屬于蕓薹屬蕓薹種（AA基因組，2n=20），是起源于我國的一種重要的十字花科蔬菜，在我國蔬菜供應(yīng)中占有重要地位。而根腫病對大白菜危害嚴(yán)重，造成極大經(jīng)濟(jì)損失。筆者以兩個抗病和感病大白菜DH系（DH40R和DH199S）為試材，從根腫菌侵染后的形態(tài)細(xì)胞學(xué)、生理生化指標(biāo)等方面進(jìn)行研究，以期從不同角度解析根腫病抗性機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

抗根腫病大白菜DH系DH40R（病情指數(shù)為0）和感根腫病大白菜DH系DH199S（病情指數(shù)為100）均是經(jīng)過游離小孢子培養(yǎng)獲得，由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院葉類蔬菜研究室提供，其根腫病抗性來源于歐洲蕪菁ECD01。

供試菌株來自河南省南陽市新野縣的大白菜腫根，經(jīng)Williams系統(tǒng)鑒定為致病性更強(qiáng)的4號生理小種，經(jīng)ECD鑒別系統(tǒng)鑒定為ECD21/31/31[12]。

接種、侵染過程觀察和生理指標(biāo)試驗均于2019年7－9月在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院葉類蔬菜研究室的人工氣候室、細(xì)胞及分子生物學(xué)實驗室進(jìn)行。

1.2 菌液的制備及接種

大白菜腫根經(jīng)打碎、過濾、離心等抽提得到休眠孢子懸浮液，接種前用血球計數(shù)板調(diào)整懸浮液孢子濃度為（1～10）×107個·mL-1，將2個材料分別播種到無菌基質(zhì)的50孔穴盤，在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，控制條件為：溫度20～25 ℃，光周期16 h光照和8 h黑暗，播種后20 d采用注射法接種根腫菌，每個穴孔接種4 mL，對照采用等量蒸餾水處理[13]。

1.3 侵染過程觀察

分別對根腫菌接種0、2、5、8、13、22 d的根部進(jìn)行取樣觀察，用清水沖洗干凈后，每個處理每個時期取3株幼苗根放置于0.5%熒光桃紅染液中染色3 h，染色完成后，用膠頭滴管吸取滅菌水滴加在載玻片中央，將染色后切下的側(cè)根或主根放在液滴上，蓋上蓋玻片，小心按壓蓋玻片，用濾紙吸去多余水分，用顯微鏡（Leica Microsystems CMS GmbH Ernst-Leitz-Str.）觀察根毛和皮層中根腫菌的侵染情況。

取接種后13和22 d清洗干凈的3～5 mm大白菜主根部位，每個處理每個時期取3株置于FAA固定液中，切片和組織染色過程參照蘇賀楠等[14]結(jié)球甘藍(lán)花蕾石蠟切片的制作方法進(jìn)行，制備好的切片用顯微鏡進(jìn)行皮層侵染過程的觀察。

1.4 酶粗液的提取

過氧化氫酶、超氧化物歧化酶活性及丙二醛、可溶性蛋白含量這幾個指標(biāo)的測定第一步均是酶粗液的提取，將根部組織加液氮充分研磨后，稱取約0.1 g粉末，轉(zhuǎn)入2 mL離心管中，加入1 mL提取液（酶提取緩沖液），在12 000 r·min-1、4 ℃離心10 min，取上清液，即得到待測液，置于冰上備用。

1.5 過氧化氫酶、超氧化物歧化酶活性以及丙二醛、可溶性蛋白含量的測定

以下測定均采用全波長讀數(shù)儀進(jìn)行測量，且試驗前30分鐘打開分光光度計進(jìn)行預(yù)熱。采用蘇州格銳思生物科技有限公司的過氧化氫酶試劑盒測定CAT活性，采用超氧化物歧化酶（SOD）-WST法試劑盒測定SOD活性，采用丙二醛試劑盒（G0109F）測定丙二醛含量，采用考馬斯亮藍(lán)法測蛋白含量試劑盒（G0417F）測定可溶性蛋白含量，具體試驗操作方法按照試劑盒的說明書步驟進(jìn)行。測量每個指標(biāo)時，每個時期（接種根腫菌后和未接菌對照組的2、8、13 d）各測量3株苗，設(shè)置3次重復(fù)。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗、感大白菜DH系接種根腫菌后的表型觀察

通過對抗病大白菜DH系DH40R和感病大白菜DH系DH199S接種根腫菌后的形態(tài)學(xué)觀察（圖1），發(fā)現(xiàn)未接菌、接菌后2 d和5 d，DH40R和DH199S主根和側(cè)根均未見小腫瘤產(chǎn)生，接菌后第8天，DH199S側(cè)根處有小腫瘤產(chǎn)生，而DH40R主根和側(cè)根均無明顯異常，接菌第13和第22天，DH199S主根明顯異常膨大，而DH40R的主根和側(cè)根始終無明顯異常，表現(xiàn)出完全的抗性。

2.2 抗、感大白菜DH系根毛及皮層侵染的組織學(xué)特征

通過對抗病大白菜DH系DH40R和感病大白菜DH系DH199S中根腫菌根毛侵染的過程進(jìn)行熒光桃紅染色觀察（圖2），發(fā)現(xiàn)未接菌時，DH40R和DH199S的根毛內(nèi)是空蕩的，未觀察到根腫菌；接菌后第2天，DH40R的根毛中出現(xiàn)無固定形狀的根腫菌原生質(zhì)團(tuán)，DH199S的根毛中充滿原生質(zhì)團(tuán)狀的根腫菌；接菌后第5天，DH40R的皮層細(xì)胞中觀察到少量的游動孢子囊和次生游動孢子，DH199S的皮層細(xì)胞中出現(xiàn)大量游動孢子囊和次生游動孢子；接菌后第8天，DH40R的皮層細(xì)胞內(nèi)存在少量的根腫菌次生游動孢子，DH199S的皮層細(xì)胞內(nèi)遍布游動孢子囊和次生游動孢子。

接菌后第13和第22天，DH40R的根部無發(fā)病癥狀，DH199S的根部腫大，分別將DH40R和DH199S的主根部位制作石蠟切片，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接菌后第13天，DH40R的皮層細(xì)胞中存在少數(shù)未成熟的游動孢子，DH199S的皮層細(xì)胞中存在大量成熟的游動孢子；接菌后第22天，DH40R的皮層細(xì)胞內(nèi)存在少量未成熟的游動孢子，皮層細(xì)胞發(fā)育正常，DH199S的皮層細(xì)胞異常腫大，皮層細(xì)胞內(nèi)充滿成熟的游動孢子囊和休眠孢子，大量異常腫大和異常分裂的皮層細(xì)胞擠壓維管束組織。

綜上，接菌后第2天，抗病大白菜DH系DH40R和感病大白菜DH系DH199S的根毛均開始被侵染，第8天，皮層細(xì)胞均被侵染，且DH199S根部出現(xiàn)小腫瘤，第13天及以后，DH40R在皮層侵染中抑制根腫菌進(jìn)一步的生長繁殖，而DH199S無法抵抗根腫菌的生長繁殖，最終皮層細(xì)胞內(nèi)充滿根腫菌，根部腫大。

2.3 抗、感大白菜DH系接種后不同時間根部生理指標(biāo)的變化

筆者推測在抗病大白菜DH系DH40R的皮層細(xì)胞中產(chǎn)生了某種抑制根腫菌分裂繁殖的物質(zhì)，阻止其分裂繁殖和病情進(jìn)一步惡化，這個物質(zhì)可能是酶、次級代謝產(chǎn)物等。因此筆者對接菌和未接菌2、8、13 d的抗病和感病大白菜DH系進(jìn)行相關(guān)生理指標(biāo)的測定。

抗、感病大白菜DH系DH40R和DH199S接菌后2、8、13 d的SOD活性變化情況如圖3-A所示，DH40R接種根腫菌后的SOD活性呈先上升后下降的變化趨勢，且SOD活性均顯著高于未接菌對照組，在接菌后第8天，DH40R中SOD活性達(dá)到峰值650.67 U·mL-1，顯著高于接菌后的DH199S，在接菌后第13天，DH40R中SOD活性顯著低于接菌后的DH199S?？?、感病大白菜DH系DH40R和DH199S接菌后CAT活性的變化趨勢如圖3-B所示，DH40R接種根腫菌后的CAT活性也呈先上升后下降的變化趨勢，且接菌后第8天達(dá)到峰值1 572.68 μmol·mL-1·min-1，顯著高于抗病大白菜DH系未接菌對照組，是接菌后感病大白菜DH系（554.20 μmol·mL-1·min-1）的2.84倍。

抗、感病大白菜DH系DH40R和DH199S接菌后2、8、13 d的MDA含量變化情況如圖3-C所示，接菌后DH40R的MDA含量緩慢下降，在接菌后第13天，與未接菌的抗、感病大白菜差異不顯著，但顯著低于接菌后的DH199S?？扇苄缘鞍缀康淖兓厔萑鐖D3-D所示，抗病大白菜DH系DH40R和感病大白菜DH系DH199S接菌和未接菌的可溶性蛋白含量均呈降低的變化趨勢，接種第8和第13天，DH40R的可溶性蛋白含量高于DH40R未接菌對照組；DH199S在接種2、8、13 d，可溶性蛋白含量一直低于未接菌對照組；在接種第8和第13天，接菌后的DH40R的可溶性蛋白含量顯著高于接菌后的DH199S。

3 討論與結(jié)論

根腫菌侵染植株的過程主要包括根毛侵染和皮層侵染，研究表明，根腫菌在接種抗病寄主、感病寄主以及非寄主植株之后均會出現(xiàn)根毛侵染的現(xiàn)象[15-17]。近年來，學(xué)者們對十字花科作物抗根腫病的生理生化指標(biāo)進(jìn)行了測定，但多數(shù)研究僅集中在根腫病侵染早期或者晚期[18-21]。在本研究中，筆者結(jié)合細(xì)胞學(xué)觀察根腫菌的整個侵染進(jìn)程（根毛侵染和皮層侵染），對侵染起始到最終植株發(fā)病的整個周期進(jìn)行生理生化指標(biāo)的測定，依據(jù)這些生理生化指標(biāo)在抗、感大白菜間的變化差異，進(jìn)一步解析大白菜抗根腫病的生理生化防御機(jī)制。

Chen等[22]利用兩個大白菜近等基因系CRBJN3-2（抗根腫病）和BJN3-2（感根腫?。┙臃N根腫菌4號生理小種，接菌量為1 mL，在接菌后12、72、96 h觀察根部侵染情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩份材料在接菌12 h均出現(xiàn)根毛侵染現(xiàn)象，接菌72 h后，感病材料BJN3-2出現(xiàn)皮層侵染，而抗病材料CRBJN3-2在接菌后96 h也沒有發(fā)生皮層侵染，接菌30 d后，BJN3-2根部產(chǎn)生根瘤，而CRBJN3-2根部無異常。本研究中抗病和感病大白菜DH系在接菌后第2 天，根毛中分別出現(xiàn)和充滿了原生質(zhì)團(tuán)狀的根腫菌；接菌后第5天，皮層細(xì)胞中均出現(xiàn)游動孢子；接菌后第8天，感病大白菜DH系DH199S的皮層侵染數(shù)較多，且開始初級發(fā)病，側(cè)根處有小腫瘤，而抗病大白菜DH系DH40R雖皮層受到了侵染，但無發(fā)病癥狀，表明接菌后第8天，DH40R阻隔了根腫菌的侵染，可能是抗病大白菜DH系DH40R侵染后期沒有發(fā)病的直接原因，而伴隨著侵染時間的延長，感病大白菜DH系DH199S病情逐漸加重，皮層細(xì)胞中游動孢子數(shù)量不斷增加，導(dǎo)致皮層細(xì)胞充滿游動孢子，根部異常腫大。本研究的抗病材料中雖然也觀察到了皮層侵染現(xiàn)象，但最終沒有根瘤產(chǎn)生，這與Chen等[22]的研究結(jié)果次級侵染在抗病材料中沒有發(fā)生并不一致。

植物被病原菌侵入之后，體內(nèi)將會產(chǎn)生大量活性氧（ROS），如H2O2、O2-等，損壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，植物為了阻止此現(xiàn)象發(fā)生，建立了抗氧化保護(hù)系統(tǒng)，其中就包括POD、SOD和CAT直接參與植物的抗病反應(yīng)[23-26]。朱紅麗[23]對分別接種4、8、12和16 d的白菜品種早熟長江5號和CR-英雄主根組織的一些生理生化指標(biāo)進(jìn)行測定，結(jié)果表明，接種根腫菌之后，抗病品種的CAT活性高于感病品種，抗感品種的SOD活性峰值均在第8天出現(xiàn)，且抗病品種的峰值顯著高于感病品種。本研究中抗病大白菜DH系DH40R在整個侵染階段，接菌后SOD活性均顯著高于未接菌對照組，在接菌后第8天，DH40R中SOD活性達(dá)到峰值，顯著高于接菌后的DH199S。抗病大白菜DH系DH40R的CAT活性第2天最低，但是高于接菌后的DH199S，接菌后第8天，DH40R的CAT活性達(dá)到峰值1 572.68 μmol·mL-1·min-1，顯著高于抗病大白菜DH系未接菌對照組，是接菌后感病大白菜DH199S的2.84倍，說明CAT在接菌后第8天清除大量H2O2以維持DH40R體內(nèi)的膜系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)，在抵抗根腫菌的侵害中發(fā)揮主要作用，與朱紅麗[23]的研究結(jié)果一致。MDA含量能夠作為反映細(xì)胞膜脂過氧化程度和植物受傷害程度的一個重要指標(biāo)，MDA含量越高說明植物體遭受逆境的傷害越大[27]。從接菌后第2天開始，抗病大白菜DH系在接菌后整個過程MDA含量一直呈下降的趨勢，僅在被根腫菌侵染根毛（接菌后第2天）時高于未接菌對照組和接菌后感病大白菜DH199S，接菌后第8和第13天，顯著低于接菌后的DH199S，這說明抗病大白菜DH40R被根腫菌侵染后，根毛侵染階段（接菌后第2天）的SOD和CAT等防御酶活性較低，還不能完全清除根內(nèi)過氧化產(chǎn)物，隨著侵染時間的延長，接菌后第8天，DH40R根中SOD和CAT活性達(dá)到峰值，可以清除根內(nèi)過氧化產(chǎn)物，細(xì)胞膜的損傷較輕，膜脂過氧化程度不高，植株受傷害程度不重?？扇苄缘鞍资侵参镏凶罨钴S的蛋白質(zhì)成分，研究表明，可溶性蛋白含量與植物抗性的產(chǎn)生有一定關(guān)系[28-29]。在本研究中，接菌后第2天，抗病大白菜DH系DH40R中的可溶性蛋白含量低于未接菌對照和感病大白菜DH系DH199S，DH199S的可溶性蛋白含量也低于未接菌對照組，而在第8和第13天，DH40R中的可溶性蛋白含量高于感病大白菜DH系DH199S，且高于DH40R未接菌對照組，而DH199S中的可溶性蛋白含量低于未接菌對照組，而馬丹丹[19]的研究表明，甘藍(lán)感病品種可溶性蛋白含量上升，抗病品種可溶性蛋白含量降低，與筆者的研究結(jié)果不一致，推測可能與不同物種抵抗根腫菌侵染的機(jī)制不同有關(guān)。

綜上所述，筆者通過形態(tài)細(xì)胞學(xué)觀察兩個不同根腫病抗性大白菜DH系在貫穿整個侵染過程的5個時間節(jié)點（接菌后2、5、8、13、22 d）的病情發(fā)展情況和根腫菌的侵染動態(tài)，另外對相關(guān)生理生化指標(biāo)進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)在接菌后第8天，侵染時期和生理生化指標(biāo)在抗、感材料之間存在顯著性差異，推斷在接菌后第8天是抗、感材料抗性差異產(chǎn)生的重要時期。該研究結(jié)果為后期挖掘根腫病抗性相關(guān)基因及解析根腫病抗性分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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