摘 要 鹿科（Cervidae）動物是反芻動物的一大類群，中國擁有世界上最豐富的鹿科動物種質資源。與其他反芻動物相比，鹿科動物最獨特的特點是擁有能夠定期再生的器官性骨質角。不同品種的鹿角形態(tài)具有較大差異，大部分復雜的大型鹿角主要用于求偶期的爭斗，開展鹿角功能與演化的研究對動物遺傳學、行為學和生態(tài)學有極高價值。鹿角生長發(fā)育受多種因素調控，因每年定期再生與快速生長機制，使鹿角成為研究哺乳動物器官再生的理想模型，同時鹿角快速增殖卻極少產生癌變的特性也為癌癥治療研究提供了新的視野。有關鹿角生長發(fā)育和再生機制的研究近年來取得諸多重要成果，本文對鹿角的生物學特征和初生發(fā)育、成熟脫落與再生過程的研究進展進行綜述，以期為鹿科動物種質資源保護利用和深入解析鹿角獨特性質遺傳機制提供理論依據。

關鍵詞：鹿角發(fā)育；鹿角再生；骨骼再生機制；鹿科動物

中圖分類號：Q958 文獻標識碼：A 文章編號：2310 - 1490（2024）- 02 - 0421 - 09

DOI：10.12375/ysdwxb.20240223

鹿科（Cervidae）動物歸屬于鯨偶蹄目（Cetartio?dactyla），共有3個亞科，19個屬，51種［1］，分布于除南極洲、澳大利亞、非洲中部和南部、馬達加斯加以及新西蘭外的所有地區(qū)［2］。中國是鹿類資源最豐富的國家之一，鹿種占全球的41. 7%［3］。具有再生能力、能夠穩(wěn)定更換的鹿角是鹿科動物特有的標志［4］。大多數(shù)哺乳動物的器官或器官附屬不具備完整的再生能力，而多數(shù)雄性鹿科動物的角作為一個能夠穩(wěn)定再生的骨骼結構器官［5］，是研究哺乳動物長骨發(fā)育及器官修復、再生的理想模型。鹿角每年會經歷一次生長與脫落的完整過程，在鹿角周期性更替的過程中有兩個明顯階段，一個是有茸皮覆蓋的鹿角生長階段（醫(yī)藥學和養(yǎng)鹿業(yè)將此階段的鹿角稱為“鹿茸”），另一個是在茸皮脫落后鹿角成為完全的骨角，標志著鹿角成熟的階段。有茸皮覆蓋的鹿角作為傳統(tǒng)中藥材具有較高的藥用價值，其代謝產物中的多種物質被認為與抗衰老和再生機制相關［6?7］。成為完全骨角的成熟鹿角在交配季節(jié)中對雄鹿爭奪交配權具有決定性作用。但鹿角的發(fā)育再生這一動態(tài)過程機制尚不明確，本文通過對鹿角生長發(fā)育及再生過程研究進展進行綜述，旨在討論鹿角這一獨特器官的再生機制。

1 鹿角的特點

鹿是唯一能夠長有再生骨質角的動物，除馴鹿（Rangifer tarandus）外，通常僅有雄鹿擁有鹿角。鹿角由角柄處長出，每年脫落與再生，這也是區(qū)別于鯨偶蹄目其他動物角最顯著的特點［8］。牛角是由永久性的骨質角芯和角質鞘組成，不會發(fā)生周期性更換［9］；羚羊（Taurotragus oryx）角骨質部分是被皮膚所覆蓋的額骨突起，表皮產生的角質能夠每年更換［10］；長頸鹿（Giraffa camelopardalis）角則不包括角質部分，僅包括表皮所覆蓋的額骨突起骨質［11］。鹿角只有在生長過程中被皮膚覆蓋，鹿角上生長的皮膚才被稱為茸皮。茸皮與頭部其他區(qū)域的皮膚有所不同，茸皮較體表皮膚更厚，且毛囊缺乏立毛肌并擁有豐富的皮脂腺［12?13］。茸皮生長速度與皮下的鹿骨角生長速度保存一致［14］。Wang等［8］對反芻動物頭帶的比較基因組學的研究發(fā)現(xiàn)，鹿角與牛角的基因表達譜相似，角的發(fā)育源于相同的神經嵴。此外，有研究發(fā)現(xiàn)RXFP2 基因在反芻動物角的發(fā)育中有重要作用［15?16］，在不同的反芻動物類群中產生了趨同進化。鹿角是完整的動物器官，在完全骨化前含有皮膚、神經、血管、軟骨和骨組織，是“活”的角，區(qū)別于由間充質干細胞（mesenchymal stemcell，MSC）分泌的角質所組成“死”的角質角。

鹿角的形狀和大小在種間存在巨大差異。鹿角按照形狀可分為：無分枝角，如赤麂（Muntiacus vagi?nalis）、小麂（M. reevesi）；掌狀角，如馴鹿、駝鹿（Alcesalces）；枝狀角，如梅花鹿（Cervus nippon）、麋鹿（Elaphurus davidianus）。在現(xiàn)存鹿科動物中，普渡鹿（Pudu puda）的無分枝角長度僅為5～9 cm［17］，成年駝鹿的分叉掌狀角則長達108 cm［18］。已知最大的鹿角是已滅絕的巨大角鹿（Megaloceros giganteus）的鹿角，雄性鹿角橫寬可達3. 6 m，總質量可達40～45 kg［19］。鹿角的骨骼形式類似于哺乳動物的長骨，和四肢的發(fā)育一樣，鹿角也有3個軸：近端-遠端軸、前后軸和背腹軸［20］。鹿角的力學性質從根部到尖端有所不同，這種變化與骨組織微觀結構和礦化的綜合效應相關。鹿角骨骼的生成在很短的生長期內完成（4～5個月）［21］，形成的骨骼被茸皮覆蓋。茸皮脫落后，其中的血管和神經退化，骨骼形成和礦化停止，鹿角骨骼死亡［22］。

鹿角有分叉，這也是鹿角區(qū)別于其他反芻動物角的重要特點。大多數(shù)鹿在夏季完成鹿角的骨化并進入求偶期，雄鹿會產生圈群行為，鹿角具有展示以及武器的作用［23］。帶有分支的鹿角使雄鹿在求偶期爭斗時能夠互相鎖定和推擠，擁有比其他有角反芻動物更復雜的爭斗方式［24］。求偶季節(jié)雄鹿激烈的爭斗使鹿角容易發(fā)生折損，有學者認為，根據缺損的部分進行修補可能比重新按照遺傳物質生長成完整的鹿角更加復雜，定期脫落與再生能夠保證雄鹿每年擁有完整的鹿角參與求偶過程［25?27］。

2 鹿角的生長發(fā)育

鹿角發(fā)育始于角柄上的芽基，鹿角柄是額骨上的一個固定突出，成對存在［27］。角柄發(fā)育源于眼眶上緣向后內側延伸的低骨脊后部區(qū)域的額頂縫。新生鹿在出生后的第1年，其角柄在睪酮水平上升的刺激下［28］，在角柄上長出芽基，因此，通過對雄性鹿進行早期閹割能夠抑制角的生長［29］。新生鹿初始鹿角的形成（通常為無分枝的尖角）是角柄生長的延續(xù)，不是角的再生事件。

2. 1 鹿角的新生

鹿角的最初發(fā)育依賴于鹿角生長位置上方的額骨附屬骨膜，即生茸骨膜（antlerogenic periosteum，AP），將其切除后會阻止鹿角的生長［30］，而將AP自體移植到身體其他部位會導致異位帶有茸皮的鹿角生長［31?32］。這些異位鹿角都被特殊的茸皮覆蓋，并經歷脫落和再生過程。AP不僅在移植部位誘導了鹿角骨生長，還形成了特定的茸皮［30］。同時，試驗也表明鹿皮轉換為茸皮的能力在鹿的不同部位皮膚中廣泛存在［30］。移植試驗結果表明，AP細胞在角柄和鹿角形成中起決定性作用［32?33］。哺乳動物額骨是由頭部神經嵴細胞分化而來，AP分化過程可能在神經嵴細胞還未遷移或正在遷移時就已完成，或在顱骨生長過程中稍后完成［34］。AP與其他顱蓋區(qū)域的骨膜相比要厚得多，AP細胞中富含的糖原被認為是快速增殖的能量來源，研究表明其具有胚胎干細胞的特點［35］。此外，AP還攜帶了鹿角軸向定向形態(tài)發(fā)生的信息，當AP在原位旋轉180°時，隨后形成的鹿角顯示其前后軸的反轉，鹿角形態(tài)發(fā)生的決定性調控主要存在于AP前內側部分［30］。通過對鹿和多種反芻動物頭帶區(qū)域轉錄組及基因組的分析發(fā)現(xiàn)，鹿角生長的骨膜早期發(fā)育自神經嵴，篩選到的OTOP3 和OLIG1 基因變化可能在反芻動物頭帶的演化和發(fā)育中起關鍵作用［8］。鑒定到的SNAI2、TWIST1、SOX9 和HOXD 基因，以及其調控元件可能在重編程神經嵴細胞發(fā)育成頭飾方面發(fā)揮作用，而RXFP2 基因在無角的鹿科動物中發(fā)生了趨同假基因化［16，36］，因此RXFP2 可能是決定鹿角生長的關鍵基因［8］。鹿角在早期發(fā)育過程中依賴神經、骨骼和皮膚組織的基因募集，對AP來源細胞進行基因編輯發(fā)現(xiàn)TGF-β1是鹿角快速生長的調控因子，并且BMP信號通路可能發(fā)揮關鍵作用［37?38］。另外一項對比小鼠和鹿軟骨細胞的研究發(fā)現(xiàn)，鹿TGF-β1和小鼠TGF-β1蛋白存在結構差異，且鹿TGF-β1可能比小鼠TGF-β1具有更強的功能［39］。

在外觀上，在第1對鹿角形成過程中，角柄處皮膚變成鹿茸皮是可見的轉化過程［22］。鹿角再生的初始時期，脫落的角柄殘留部分皮膚傷口會產生無疤痕的再生性愈合［40］，研究認為這個過程中機械壓力的變化是誘導這一過程產生的原因［14］。在鹿皮變化為茸皮的過程中，毛囊立毛肌和汗腺會退化，大型雙葉或多葉皮脂腺會增加，這種變化是皮膚對周期性激素水平誘導信號的特定反應。茸皮下層的MSC來源于鹿角柄處的骨膜［41］，茸皮進入快速生長階段后面積不斷擴大，當茸皮與鹿皮的邊界移動到角柄基部時，標志著鹿角柄的成熟和角生長的正式開始，茸皮被激活與鹿茸芽基的再生是一個同步的過程［42?43］。

2. 2 鹿角的發(fā)育成熟

鹿角生長速度極快，馬鹿（Cervus elaphus）角平均生長速度為1. 7 cm/d［28］，加拿大馬鹿（C. canaden?sis）角最快生長速度可達2. 75 cm/d，而已滅絕的巨大角鹿可能擁有更快的鹿角生長速度［44］。每年重新生成鹿角需要補充大量的鈣磷，而在鹿角快速生長期僅通過食物攝入礦物質無法滿足角生長的鈣磷需求［45］。研究顯示，在鹿角快速生長時期會發(fā)生類似于雌性哺乳期動物的骨質動員現(xiàn)象，會在肋骨等部位發(fā)生骨吸收，使鹿產生周期性的骨質疏松。這種全身鈣磷的動員可能是影響鹿角大小的主要因素［26］。

鹿角成熟是軟骨內骨化的結果［46］。對不同鹿科物種未成熟初生鹿角和再生鹿角的組織學結構以及正在發(fā)育的鹿角骨化過程進行研究，結果表明鹿角生長是持續(xù)性的［47?48］，而哺乳動物長骨生長的特征，如生長板和次生骨化中心在生長的鹿角中并不存在［49］。鹿角屬于頂端生長，在不同區(qū)段之間有逐漸過渡的不明確邊界［40］。遠心端的鹿角部分比近心端的年輕，成熟鹿角縱向軸上的組織結構［50］可以證明這一特點。另外，對不同區(qū)段鹿角蛋白質組學的分析發(fā)現(xiàn)，鹿角尖端表達的蛋白質主要與抗氧化代謝機制、蛋白質形成和Wnt信號通路有關，鹿角中段表達的蛋白質與血液有關［51］。位于茸皮真皮層下面的是軟骨膜，由大量低分化程度細胞組成，也被稱為增生軟骨膜，其與鹿角周圍的鹿角骨膜細胞（antlerperiosteal cells，AnPC）相連，鹿角軟骨細胞在AnPC膜內實現(xiàn)骨化［32］。細胞體外培養(yǎng)試驗證明，鹿角尖端MSC增殖受Ras/Raf、MEK/ERK通路調節(jié)，并通過Gab1/Grb2和PI3K/AKT通路調節(jié)細胞的遷移［52］。軟骨膜下方致密細胞層被稱為增殖帶，即增生區(qū)，其從遠端到近端依次細分為3個亞區(qū)，即儲備間充質、前軟骨層和軟骨層［15］，后2個亞區(qū)也被稱為軟骨前區(qū)。儲備間充質的特點是有絲分裂活性高，細胞凋亡水平高，存在豐富神經血管網絡［53］。緊隨其后的是軟骨細胞或軟骨區(qū)，由透明軟骨組成，在該區(qū)域內，軟骨細胞經歷成熟和肥大，且軟骨基質開始礦化［54］。

在軟骨前區(qū)，細胞經歷了軟骨分化的第1個步驟［48］，在軟骨前區(qū)中特異性高表達的基因主要與Wnt通路相關［38］，該信號通路可能參與干細胞向軟骨形成的早期分化，OPN 基因受啟動子DNA甲基化水平的調控，主要通過調控軟骨前組織和軟骨組織的生長來促進鹿角早期生長發(fā)育［55］。比較前軟骨層和軟骨層細胞DNA 甲基化水平的研究也顯示，軟骨細胞的DNA甲基化水平明顯更高，這表明DNA去甲基化可能參與了鹿角快速軟骨分化［56］。軟骨區(qū)也含有許多血管。在軟骨層中高表達的基因與軟骨發(fā)育（如SOX6 和SOX9）以及細胞外基質組織生長發(fā)育（如COL2A1）有關［57］。肥大軟骨層中高表達的基因，如MMP16 與軟骨細胞礦化有關［58］。該區(qū)域內軟骨細胞排列成相互連接的垂直小梁，形成一個圍繞富含血管化梁間組織的空間網絡［53］。軟骨的骨化從小梁中央向外圍擴散。在接近軟骨區(qū)的位置，存在一個具有軟骨吸收、骨吸收和成骨活性共存的廣泛區(qū)域，呈現(xiàn)出海綿狀特征。在這個區(qū)域內，軟骨被大量軟骨吸收細胞侵蝕，骨組織沉積在變薄的軟骨小梁表面［59］。隨著軟骨吸收和成骨化，軟骨網絡被完全礦化，骨小梁系統(tǒng)逐漸被替代。在某些部位，新形成的骨組織也被骨吸收細胞侵蝕［60］，尤其是在鹿角遠端位置，軟骨在被替代過程中并未完全被吸收，這些組織殘留物可以在堅硬的鹿角骨小梁中央被找到［61］。在鹿角四周，骨化結構逐漸沉積并壓實，形成一個緊密的表面，環(huán)繞內部松質部分。鹿角骨化過程還包括軟骨周圍的鈣化。因此，沿著鹿角外緣，通過直接從軟骨周圍或骨膜（鹿角頂端）骨化而形成了一個光滑骨套［62］。這一過程可能也是形成某些鹿種鹿角表面特征突起的原因［63］。鹿角生長隨睪酮水平的升高而終止，在茸皮脫落時血液流動停止，骨骼形成和礦化停止，形成成熟的骨質角［21］。

3 鹿角的脫落再生

鹿角在茸皮脫落前后，其中的血管神經逐漸退化成硬骨角，在交配季節(jié)過后鹿角自然脫落，第2年開始在角柄上長出新的鹿茸角，即鹿角的再生。關于鹿角的周期性脫落與再生的原因有多種猜測，如發(fā)育期的鹿角神經血管豐富不適于打斗，成熟已死亡的鹿角無法對在發(fā)情期爭斗中出現(xiàn)的骨折進行自我修復，而定期的鹿角再生能確保雄鹿每個發(fā)情季節(jié)都有一套全新的“武器”。再如初生鹿角通常只有簡單的無分叉結構，隨著每年鹿角的脫落和再生，隨后生長的鹿角尺寸和復雜性才有可能增加［23］。也有觀點認為，鹿可能發(fā)源于溫帶，富含神經血管且表面積較大，有永久性皮膚覆蓋的鹿角很容易被凍壞，定期的再生有利于每年保存完整的鹿角［64?65］。

3. 1 鹿角的骨化與脫落

雄性鹿的鹿角再生周期與它們的繁殖周期密切相關，棲息在較高緯度的鹿科物種，其生殖周期受光周期的嚴格控制［66?67］。鹿角的生長啟動發(fā)生在睪酮水平較低的階段［68］。求偶期前睪酮濃度的增加導致鹿角迅速骨化并伴隨茸皮脫落，有研究認為CALR 基因很可能是雄性激素觸發(fā)鹿角再生的下游介質［69］。早期鹿角生長中主要的營養(yǎng)供應來源于鹿角柄處及鹿角根部的血管，隨著鹿角的快速生長，遠端鹿角主要依靠茸皮豐富的血管網絡提供營養(yǎng)［70］。茸皮脫落導致位于茸皮中的血管無法繼續(xù)為鹿角提供營養(yǎng)，鹿角內部的血管也逐漸死亡，最終導致裸露骨質鹿角的死亡［25］。隨后，在求偶期間，裸露的骨質鹿角被用于雄性之間的求偶爭斗。

發(fā)情期過后，循環(huán)睪酮水平下降，引發(fā)角柄骨膜（pedicle periosteum，PP）附近的破骨細胞骨吸收［59］，破骨細胞再吸收也發(fā)生在骨柄的骨膜表面，導致角柄上方環(huán)狀溝的形成［60］。這兩個過程導致角柄和鹿角之間的連接逐漸減弱，最后導致鹿角從角柄上斷裂［71］，形成新的鹿角在鹿角柄上開始以年為周期的脫落和再生過程［72］。有證據表明，在鹿角局部睪酮轉化為雌激素后會影響鹿角的生長發(fā)育，注射雌激素會抑制再生鹿角的生長，而促進鹿角過早骨化和茸皮脫落［73］。睪酮對鹿角的影響在某種程度上是間接的［30］。

3. 2 鹿角的再生

鹿角脫落后，會在角柄殘基頂部發(fā)生短暫的膜內成骨［74］，彌補了之前部分角柄骨的缺失［40，75］。盡管PP會發(fā)生骨質修復，但是隨著鹿年齡的增大，PP會逐漸變薄，由于角柄基部會發(fā)生骨質堆積，因此在鹿的整個生命周期中，骨柄厚度在增加［76］。鹿角脫落時伴隨著角柄附近血管的斷裂，但之后傷口表面迅速被皮膚覆蓋，皮膚下面形成了一團再生組織，即鹿茸芽［76］。鹿茸芽在角柄殘端頂部形成一個再生芽狀物，此過程類似于其他脊椎動物附肢的表皮再生過程。在鹿角再生期間，鹿角最下方的分叉很早就開始發(fā)育，在鹿茸芽中已經可以識別出主梁和眉叉的分別增殖區(qū)域［77］，都位于鹿角中央部位，是鹿角的生長中心［74］。在多叉鹿角再生過程中，主梁尖端的生長中心反復不對稱地分裂為一個較大的生長中心成為主梁，以及一個較小的生長中心用于長出相應的分叉角［78］。

鹿角再生是一個基于干細胞再生不依賴于去分化的周期性激活過程［41］。PP是負責啟動鹿角柄和第1個鹿角生長AP的衍生物［76］。有研究表明，AP和PP細胞具有干細胞屬性［69］。來自AP、PP和鹿角生長中心的細胞統(tǒng)稱為鹿角干細胞（antler stem cells，ASCs），ASCs是鹿角再生的基礎，其可在體外被誘導分化為軟骨細胞、骨細胞和脂肪細胞［79］。通過對分離自鹿角不同位置的ASCs、AnPC和PP細胞進行體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的AnPC表達經典的MSC標記物，與PP細胞一致。然而，AnPC上的MSC標記物強度明顯弱于PP。AnPC的增殖率在連續(xù)傳代后逐漸降低，而PP細胞的增殖率保持不變，與PP細胞相比，AnPC的分化程度更高。全基因分析也揭示了兩者基因表達模式的不同。鹿角再生過程中，AnPC主要起促進血管生成、神經生長和骨膜內骨形成的作用，PP 則可能主要參與雄激素信號受體途徑和PI3K/AKT信號通路，起干細胞更新的作用［32］。另一項對鹿角再生的研究利用單細胞測序技術建立了鹿角再生的時空細胞圖譜，從鹿角尖部分離鑒定出了鹿角芽基祖細胞（antler blastema progenitor cells，AB?PCs），這類細胞能夠直接促進鹿角再生，相比人類骨髓干細胞（bone marrow stromal cells，BMSCs），其有更強的自我更新能力，以及更顯著的成軟骨和成骨的能力［57］。鹿角的快速細胞增殖需要刺激細胞快速增殖的因子，以及ABPCs的干細胞特性控制細胞周期。ABPCs 高度表達的標記基因PRRX1、TNC、DLX5、PTN 和SOX4 在小鼠長骨快速發(fā)育中也存在，這些基因可能在哺乳動物骨骼發(fā)育中起到重要作用且具有物種間的保守性［57］。在ABPCs 中檢測到的大量與血管合成相關的基因也符合鹿角軟骨血管高度密集的特征［70，80］，證明ABPCs在鹿角再生過程中起到多種作用。此外，ABPCs樣細胞也存在于處于再生過程中的哺乳動物器官中，但不存在于哺乳動物非再生組織，也不存在于蠑螈（Ambystoma mexicanum）和斑馬魚（Danio rerio）的再生組織中，這提示哺乳動物與其他非哺乳動物存在不同的再生機制，而ABPCs或許在哺乳動物的附肢再生中發(fā)揮重要作用［48］。在ASCs中添加褪黑素（melatonin，MLT）能夠加速干細胞分化，并且MLT通過MT2結合介導YAP1 的轉錄來調節(jié)Col1a 的表達，MLT通過抑制STAT5/IL-6信號通路激活依賴于SOX9 表達的AKT/CREB通路，能夠有效抑制血管內皮生長因子（vascular endothelialderivedgrowth factor，VEGF）誘導的鹿角軟骨細胞變性［81］。目前對于鹿角再生過程中多種ASCs的研究主要集中于尋找啟動再生的細胞類群，而對于不同類群細胞協(xié)同參與，相關分子機制的驗證以及在臨床上的應用還有待進一步探索。

鹿角再生過程中涉及的各類干細胞研究對于臨床上的骨骼修復和恒牙再造領域有極高的應用前景。ABPCs特異表達相關基因的研究也有助于加深對干細胞的認識，ABPCs可能在骨損傷或肢體再生的再生醫(yī)學中被利用。

4 結語及展望

鹿角周期性再生是哺乳動物器官再生的典型案例，是研究骨骼、神經和血管損傷再生的理想模型。鹿角再生過程不同于兩棲類動物的去分化再生過程，它是一種周期性干細胞控制的重生長［80］。茸皮無疤痕修復機制對于疤痕修復、皮膚再生研究也有很重要的研究意義。另外，鹿角在快速增長過程中很少發(fā)生癌變［53］，其具體機制有助于理解癌癥的發(fā)生和研究抑制、治療癌癥的手段。我國擁有豐富的鹿種資源，研究鹿角這種獨特的器官對于保護我國鹿種資源具有重要作用。隨著組學技術的快速發(fā)展，通過宏基因組研究鹿對鈣磷的消化代謝，可為牛羊等反芻動物的飼料營養(yǎng)研究提供新的觀點；基于單細胞測序技術、空間轉錄組測序技術等新手段對鹿角生長發(fā)育機制進行研究，對于理解再生醫(yī)學有重大意義，尤其是可為人類四肢的斷肢修復治療提供重要思路［20］。

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基金項目：北京市財政資金項目（23CB063）