莫雯婧　陳洪森　桂芳澤　洪慈清　蔡鑫鎧　關(guān)雄　潘曉鴻

摘要：菌糠是菌菇生產(chǎn)后殘留的物質(zhì)，含有豐富的無機(jī)鹽和有機(jī)質(zhì)等成分。利用熱水浸提法制備香菇菌糠水提液（water extract from spent mushroom substrate，WESMS），通過紫外分光光度計和Zeta電位及粒徑儀對其紫外吸收情況、表面電荷和水中分散粒徑進(jìn)行表征，采用平板滲透法及十字交叉測量直徑法計算WESMS對致病疫霉的抑制率，利用光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡觀察病原菌細(xì)胞形態(tài)的損傷程度，并采用瓊脂糖凝膠電泳法分析WESMS 對致病疫霉 DNA 的影響。結(jié)果表明，WESMS 在紫外線A（UVA，315～400 nm）、B（UVB，280～315 nm）和C（UVC，100～280 nm）波段均有吸收，在水中的分散粒徑為3 649.27 nm。抑菌試驗(yàn)表明，WESMS對病原菌的生長具有抑制作用，隨著提取液體積百分濃度的增加，抑制效果更明顯，在高體積百分濃度（6.25%WESMS）作用下對病原菌的抑制率近100%。經(jīng)WESMS處理后病原菌的菌絲更加扭曲、扁平，且褶皺明顯增多，表明WESMS可對細(xì)胞造成明顯破壞；WESMS處理組的DNA條帶亮度暗于對照組，損傷程度與WESMS體積百分濃度呈正相關(guān)。研究結(jié)果為菌糠的資源化利用及其對馬鈴薯晚疫病的有效防治提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞：香菇菌糠；馬鈴薯晚疫病；致病疫霉；抗菌機(jī)理

doi：10.13304/j.nykjdb.2023.0159

中圖分類號：S435.32；X712 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：10080864（2024）05012909

隨著馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略的開展，馬鈴薯成為我國四大主糧作物之一，馬鈴薯產(chǎn)業(yè)也在保障我國糧食安全、保護(hù)生態(tài)環(huán)境穩(wěn)定等方面發(fā)揮著重要作用[1]。根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織（Food andAgriculture Organization，F(xiàn)AO，https：//www.fao.org/home/en）2022年的數(shù)據(jù)，全世界種植馬鈴薯的國家和地區(qū)有158個，種植面積1 920.50萬hm2，總產(chǎn)量達(dá)3.85 億t，平均單產(chǎn)20.10 t·hm-2。我國馬鈴薯種植面積和總產(chǎn)量均居世界第1位，但單產(chǎn)水平與發(fā)達(dá)國家仍存在差距[2]。由致病疫霉（Phytophthora infestans）引起的馬鈴薯晚疫病是馬鈴薯生產(chǎn)中最具毀滅性的病害之一，具有發(fā)生范圍廣、流行速度快、危害損失重、防治難度大的特點(diǎn)[3]。該病常發(fā)生于10～25 ℃的溫度范圍內(nèi)，故在秋冬季發(fā)生率較高，被感染的葉緣及葉尖表面可見顏色為綠褐色、類似于水漬的斑點(diǎn)，斑點(diǎn)周邊可見淺綠色暈圈，如果環(huán)境濕度過高，斑點(diǎn)顏色為褐色，表面覆蓋有白色霉層[4]。目前，該病害大部分通過化學(xué)試劑來防治，如烯酰嗎啉和嘧菌酯等化學(xué)農(nóng)藥[56]，而化學(xué)試劑會引發(fā)一系列的環(huán)境以及人體安全健康等問題，所以尋找綠色環(huán)保的新型抗菌材料成為安全、有效地降低該病害發(fā)生的關(guān)鍵手段。

香菇菌糠（spent mushroom substrate，SMS）是香菇生產(chǎn)過程中殘留下來的基質(zhì)，研究表明，每生產(chǎn)1 kg菌菇將產(chǎn)生5 kg菌糠[7]。我國是世界上最大的菌類農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)國和消費(fèi)國，每年平均產(chǎn)生約1 320萬t的菌糠[8]。由于菌糠含有豐富的氮和磷等營養(yǎng)成分，未經(jīng)處理直接丟棄于環(huán)境中會造成嚴(yán)重的地下水體污染[9]，因此尋找廉價可靠的方法對菌糠進(jìn)行資源化利用具有重要的研究意義。當(dāng)前，菌糠主要應(yīng)用于飼料添加劑、植物肥料、能源供應(yīng)、污染物處理、二次培養(yǎng)與發(fā)酵以及植物病害防控等方面[10-15]。研究發(fā)現(xiàn)，香菇菌糠作為堆肥基質(zhì)能有效降低黃瓜炭疽病的發(fā)病程度[16]，其水提液對辣椒疫霉菌（Phytophthora）也具有抑制作用[17]；杏鮑菇菌糠提取液對靈芝、真姬菇、秀珍菇和平菇菌絲具有抗菌活性，且其對4種食用菌菌絲的生長具有不同程度的抑制作用[18]。以上研究表明，菌糠具有作為新型抗菌材料的潛力，但當(dāng)前對菌糠提取物的抗菌機(jī)理還有待進(jìn)一步全面深入地分析。

本研究通過干燥、粉碎、過篩等方式將香菇菌糠原料進(jìn)行預(yù)處理，得到菌糠粉末，將用熱水浸提獲取的菌糠水提液（water extract from spentmushroom substrate，WESMS）作為抗菌材料，利用平板滲透試驗(yàn)來觀察抑菌效果，通過十字交叉測量直徑法計算平均抑菌率。采用光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡觀察WESMS 對病原菌細(xì)胞的損傷程度、通過瓊脂糖凝膠電泳法比較對照組與處理組DNA條帶損傷情況，以期為菌糠作為農(nóng)業(yè)病原菌抗菌劑提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集

香菇菌糠原料取自福建農(nóng)林大學(xué)國家菌草工程技術(shù)研究中心，致病疫霉菌由福建農(nóng)林大學(xué)病原菌群體遺傳與進(jìn)化研究國際團(tuán)隊(duì)饋贈。

1.1.2 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基為黑麥（rye）固體培養(yǎng)基：60 g黑麥用單蒸水沖洗2～3遍，然后用單蒸水浸泡放于4 ℃冰箱過夜，次日倒掉浸泡用水，再用單蒸水清洗1～2遍，用破壁機(jī)勻漿3～4 min，研磨到肉眼不見大顆粒?；旌弦?5 ℃水浴2 h，蓋上戳洞的保鮮膜。水浴后用4 層紗布過濾，定容至1 L，然后用250 mL錐形瓶分裝，加入WESMS，配成體積百分濃度分別為0.00%、0.33%、0.66%、1.64%、3.23%和6.25%的培養(yǎng)基，每100 mL液體培養(yǎng)基中加入2 g瓊脂條，高壓蒸汽滅菌，制備成固體培養(yǎng)基平板后備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 香菇菌糠的前處理

將香菇菌糠外包裝上的污泥清理干凈，脫去外包裝，將其揉碎至無較大塊狀物，放于干燥箱（DH-9070A，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）60 ℃干燥4～6 d，取出粉碎，過60目篩，得到菌糠粉末，用自封袋密封包裝備用。將菌糠粉末與水以1 g∶3 mL的比例混合均勻，高壓蒸汽鍋（HVE-50，日本三洋公司）121 ℃滅菌20 min，待冷至室溫，9 500 r·min-1離心10 min，取出上清液，先用2層濾紙和0.45 μm針式過濾器過濾，再用0.22 μm針式過濾器過濾，裝到滅菌的藍(lán)蓋瓶中[19]。

1.2.2 WESMS的表征

對香菇菌糠母液進(jìn)行稀釋，超聲15 min 后，使用紫外可見吸收光譜儀（UV1800，上海奧析科學(xué)儀器有限公司）測定WESMS 在紫外線A（ultraviolet A，UVA）、B（UVB）以及C （UVC）波段的紫外吸收情況，并利用粒度分析儀（Zetasizer Nano ZS90，美國賽默飛公司）測定其在水中的分散粒徑大小。

1.2.3 抑菌試驗(yàn)

使用平板滲透的方法來評估WESMS的抑菌效果。將直徑為6 mm的菌餅接種至已配制好的含不同WESMS 體積分?jǐn)?shù)（0.00%、0.33%、0.66%、1.64%、3.23% 和6.25%）的平板中央，其中，含0.00% WESMS的平板是加入最大體積百分比濃度等量無菌水的黑麥培養(yǎng)平板，為空白對照（CK），每組3個重復(fù)。18 ℃恒溫培養(yǎng)，采用十字交叉法分別測量5、7、9 和11 d 的菌絲直徑，計算菌落生長距離和抑制率[20]。

菌落凈生長距離（mm）=菌落直徑-菌餅直徑 （1）

菌落生長抑制率=（對照菌落生長距離-處理菌落生長距離）／對照菌落生長距離×100% （2）

1.2.4 光學(xué)顯微鏡觀察

取20 μL的無菌水于載玻片上，將培養(yǎng)了一定天數(shù)的空白對照組（CK）與處理組的菌絲分別用滅過菌的牙簽沿著邊緣刮取一小塊下來，放于載玻片中攤平，蓋上蓋玻片于光學(xué)顯微鏡（ECLIPSE E100，日本尼康公司）下觀察菌絲形貌。

1.2.5 掃描電鏡觀察

將空白對照組（CK）與處理組菌落從平板上完整撕取下來，用無菌水清洗，置于2.5% 的戊二醛溶液中，放于4 ℃冰箱固定12 h。用1% OsO4后固定樣品1 h；然后，再次使用磷酸鹽緩沖液（pH=7.0）洗滌處理樣品3次，用一系列體積百分乙醇（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%）脫水15 min。將樣品轉(zhuǎn)移到無水乙醇和異戊乙酸（體積比1∶1）的混合物中30 min[21]；然后在空氣中自然干燥，使用掃描電鏡（SU8020，日本日立公司）進(jìn)行觀察。

1.2.6 DNA損傷情況觀察。

采用真菌DNA提取試劑盒（Fungal DNA Kit D3390， Omega）提取空白對照組與處理組菌的DNA，通過微量紫外分光光度計（Nano-100，杭州奧盛譜爾科學(xué)儀器公司）檢測提取DNA 的純度。以15 kD 的Marker 作為參照，進(jìn)行瓊脂凝膠電泳檢測，對比DNA損傷情況。

1.2.7 Zeta 電位測定WESMS 和病原菌表面電荷

將WESMS稀釋100倍，超聲15 min。將正常生長的馬鈴薯致病疫霉菌落從平板上完整撕取下來，放于無菌水中重懸一段時間，采用Zeta電位及粒度分析儀（Zetasizer Nano ZS90，美國賽默飛公司）測定WESMS和病原菌表面電荷，并進(jìn)行比較分析。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

抑菌率數(shù)據(jù)采用Origin 2018[22]和IBM SPSSStatistics 26 軟件進(jìn)行分析，使用單因素ANOVA分析進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，P<0.05 代表具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 香菇菌糠水提液獲取與表征分析

香菇菌糠原料質(zhì)地較厚實(shí)，帶有水分，干燥完成后顏色變淺。粉碎后得到棕褐色粉末，熱水浸提、離心、過濾后得到近黑色菌糠水提液（WESMS）（圖1A）。將母液進(jìn)行稀釋后，超聲15 min，測定其紫外可見光吸收情況，結(jié)果顯示，其在UVA（315～400 nm）、UVB（280～315 nm）以及UVC（190～280 nm）3個波長范圍內(nèi)都具有紫外吸收（圖1B）。將母液稀釋100倍后，其分散在水中的粒徑平均為3 649.27 nm。

2.2 WESMS 對馬鈴薯致病疫霉菌的抑制效果

WESMS中含有草酸、水楊酸及其他酚酸類物質(zhì)，因而可能具有一定的抗菌活性[17 ， 2324]。本研究結(jié)果表明，WESMS 對病原菌具有較強(qiáng)的抑制作用，且隨著WESMS體積百分濃度的增加，菌絲生長范圍更加有限，抑制作用更加明顯（圖2）。表1為不同體積百分濃度的香菇菌糠水提液對馬鈴薯致病疫霉菌的抑制率結(jié)果，在WESMS 體積百分濃度為1.64% 時，抑制率總體上大于50%，當(dāng)WESMS體積百分濃度達(dá)到6.25%時，抑制率接近100%；此外還發(fā)現(xiàn)，抑菌率隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加總體上呈現(xiàn)遞減的趨勢，表明WESMS 對病原菌的生長造成了嚴(yán)重影響。WESMS體積百分濃度越高，向外生長的菌絲數(shù)量越少，且培養(yǎng)前期的抑制作用整體上大于培養(yǎng)后期，可能是WESMS 影響了核酸和蛋白質(zhì)的合成與活性。

2.3 抑菌機(jī)理研究分析

2.3.1 顯微鏡及掃描電鏡觀察分析

正常生長的菌絲表面光滑圓潤，粗細(xì)較均勻[25-27]，空白對照組菌絲形態(tài)（圖3A、B、C）符合正常生長樣貌，飽滿健康，而經(jīng)高體積百分濃度（6.25%）WESMS處理過的菌絲表面不光滑，部分菌體收縮，有較多分支，出現(xiàn)大量的突起，彎曲程度嚴(yán)重（圖3D），內(nèi)容物分布不均勻，可能造成空腔等畸變現(xiàn)象（圖3E），有菌絲“截斷”現(xiàn)象（圖3F）。在掃描電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，空白對照組菌絲較圓潤飽滿，粗細(xì)均勻，筆直（圖4A～D），而6.25%WESMS 處理組菌絲粗細(xì)不均，且似有內(nèi)容物流出現(xiàn)象，扁平，褶皺較多，大多纏繞在一起（圖4E～G），末端扭曲程度嚴(yán)重（圖4H）。以上結(jié)果表明，WESMS對致病疫霉菌的抗菌活性抑制主要是引起其細(xì)胞壁及細(xì)胞膜受損破壞，可能是WESMS 中具有抗菌活性的物質(zhì)在與病原菌細(xì)胞相互作用時結(jié)合在細(xì)胞上，從而進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)起干擾作用。

2.3.2 DNA 損傷情況分析

測定所提取病原菌DNA的OD600/800，發(fā)現(xiàn)OD600/800均在1.8～2.1，表明提取得到的DNA較純。以相對分子質(zhì)量為15 kD的Marker作為參考[21]，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測分析DNA損傷情況，由圖5可知，對照組總DNA條帶亮度高于處理組，隨著WESMS 體積百分濃度的增加，DNA含量越低，受損程度越高，電泳條帶亮度越低，說明DNA損傷程度與WESMS體積百分濃度呈正相關(guān)， 香菇菌糠水提液對病原菌的DNA造成了傷害，可能引發(fā)DNA鏈的斷裂與位點(diǎn)突變、雙鏈畸變、基因突變等多種形式的DNA損傷。與此同時，DNA 損傷又會引發(fā)多種細(xì)胞反應(yīng)，其中包括了氧化應(yīng)激[28]。

2.3.3 Zeta電位測定分析

Zeta電位是評價膠體分散體穩(wěn)定性的重要指標(biāo)[29]。電位正負(fù)表示試樣粒子電荷的正負(fù)性，電位絕對值反映顆粒之間相互作用的強(qiáng)度，絕對值越大分散體系越穩(wěn)定，膠體越不易凝聚。由表2可知，WESMS的平均Zeta電位為-29.25 mV，病原菌的平均Zeta電位為-38.57 mV，根據(jù)WESMS的Zeta電位絕對值可以判斷其在水溶液中會變得比較不穩(wěn)定，吸引力超過了排斥力，容易發(fā)生團(tuán)聚。通過二者的Zeta電位結(jié)果可知，二者表面帶有相同電荷，具有排斥作用，WESMS與病原菌之間的反應(yīng)可能不是由靜電吸附力驅(qū)動的。以上研究表明，WESMS對病原菌的生長造成延滯。

3 討 論

目前，通過現(xiàn)代殺菌劑來防控植物病蟲害是一種十分重要的手段，但是病原菌極易對現(xiàn)代殺菌劑產(chǎn)生抗性，最終導(dǎo)致化學(xué)防治失敗[30]。食用菌菌糠是一種具有廣泛再利用價值的農(nóng)業(yè)資源[3132]。菌糠作為一種菌菇生產(chǎn)過程中的廢棄物，如果隨意丟棄，會對環(huán)境造成嚴(yán)重的不良影響，特別會對水體環(huán)境造成嚴(yán)重污染，因此對菌糠進(jìn)行資源化利用具有重要意義。研究表明，香菇菌糠水提物可以減輕稻瘟病的發(fā)生，其對稻瘟病孢子有直接抑制作用，起到抑制作用的為3種酚酸化合物，為香菇分解菌糠原料蔗渣所得到的產(chǎn)物[24]。將香菇和杏鮑菇（Pleurotus eryngii）菌糠水提取物噴灑在黃瓜（Cucumis sativus Linn.）葉片表面，或直接將菌糠與營養(yǎng)土混合后用于黃瓜栽培，均能顯著減輕黃瓜白粉病和角斑病的發(fā)生[33]。且相較于化學(xué)殺菌劑，由于其多是生物來源，故不易引發(fā)病原菌產(chǎn)生抗性，并且對植物幾乎沒有毒害作用，成本較低。對比生物源抑菌劑，其抑菌效果優(yōu)于某些生物制劑，如甲殼胺、申嗪霉素、乙蒜素[34]等，也優(yōu)于某些拮抗菌株[35]。以上結(jié)果說明，香菇菌糠水提液具有成為防治植物病害的新型材料的潛力。

本研究將得到的香菇菌糠原材料經(jīng)過去污、揉碎、干燥、粉碎以及過篩處理得到菌糠粉末，再用熱水浸提、離心、過濾得到香菇菌糠水提液（WESMS），并對其粒徑大小以及Zeta電位正負(fù)進(jìn)行測定，結(jié)果表明，其Zeta電位絕對值較小，粒徑在幾千納米級別，具有進(jìn)入卵菌細(xì)胞膜的潛力。用WESMS來拮抗馬鈴薯致病疫霉菌，結(jié)果表明，WESMS對該病原菌具有很強(qiáng)的抑制作用，且隨著體積百分濃度的升高，抑菌效果也更好，在6.25%WESMS下，抑菌率可達(dá)到近100%。菌糠是一種成分復(fù)雜的混合物[36]，有研究推測其抗菌作用主要是由木質(zhì)素被分解后產(chǎn)生的草酸所引起的，而大多數(shù)真菌具有產(chǎn)生木質(zhì)素氧化酶的能力[16]。除了抗卵菌，其對細(xì)菌，如金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌均有抑制活性，原因在于菌糠富含多種活性物質(zhì)，如多糖、多酚和萜類等，不同組成的菌糠具有不同的抗菌譜。然而對于其與菌在作用過程中是何種物質(zhì)起到抗菌作用的研究還有待進(jìn)一步探索。

本研究對WESMS抗菌機(jī)理進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)WESMS 處理組的菌絲形態(tài)較對照組有較大差異，內(nèi)容物分布不均，有外滲現(xiàn)象，且扭曲嚴(yán)重，大部分纏繞在一起，表面上出現(xiàn)較多的小突起，壁面粗糙，還出現(xiàn)頂端部分膨大現(xiàn)象。通過凝膠電泳分析，WESMS處理組的DNA 確實(shí)受到了一定程度的損傷，條帶相較于空白對照組的暗，且隨著WESMS體積百分濃度的升高，DNA 損傷程度越大。通過測定病原菌的Zeta電位發(fā)現(xiàn)，其和WESMS 一樣同為負(fù)電位，在產(chǎn)生排斥作用的同時，可能對于營養(yǎng)物質(zhì)的攝取造成影響。通過抗菌效果以及機(jī)理的研究發(fā)現(xiàn)，WESMS不僅對報道的常見農(nóng)業(yè)病原菌具有抑制作用，對馬鈴薯致病疫霉同樣具有良好效果，故WESMS 具有成為防控植物病害的新型抑菌劑的潛力。合理運(yùn)用菌糠資源，不僅能提高農(nóng)作物的品質(zhì)與產(chǎn)量、保障人們的健康生活，還能降低菌糠過多堆積對環(huán)境造成的影響。

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（責(zé)任編輯：胡立霞）

基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)研發(fā)計劃項(xiàng)目（2022YFD1400700）；福建農(nóng)林大學(xué)茶樹綠色栽培與生態(tài)茶園建設(shè)研究項(xiàng)目 （K1520007A03）；福建農(nóng)林大學(xué)科技發(fā)展資金項(xiàng)目（ KFB23012）。