孫正光 席高磊 王澤寧 楊鵬飛 王秋領(lǐng) 楊靖 陳芝飛

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2024.10.027

摘要：為揭示加拿大和云南優(yōu)質(zhì)煙葉中性香味成分的差異，使用同時蒸餾萃取（SDE）和液-液萃取法（LLE）獲得2種煙葉的中性香味成分，利用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）分析中性香氣成分的種類和含量，通過正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）明確2種煙葉中性香味成分的差異性。結(jié)果表明，加拿大煙葉共鑒定出59種中性香味成分，總含量為92.02 μg/g，云南煙葉共鑒定出63種中性香味成分，總含量為113.91 μg/g；云南煙葉中類胡蘿卜素降解產(chǎn)物含量高于加拿大煙葉，加拿大煙葉中棕色化反應(yīng)產(chǎn)物類和其他類成分含量高于云南煙葉；基于OPLS-DA法中重要性投影值（VIP>1）共篩選出18種差異中性香味成分，其中云南煙葉香氣貢獻(xiàn)率較突出的有12種中性香味成分，包括苯乙醛、5，6-環(huán)氧-β-紫羅蘭酮、巨豆三烯酮a、（E）-β-大馬酮、香葉基丙酮、二氫大馬酮、巨豆三烯酮c、棕櫚酸甲酯、巨豆三烯酮b、巨豆三烯酮d、金合歡基丙酮和苯乙醇；加拿大煙葉含量較突出的有6種香氣成分，包括氧化石竹烯、（S）-5-羥甲基二氫呋喃-2-酮、α-石竹烯、糠醛、茄酮和α-香附酮。得出OPLS-DA方法能較好地區(qū)分加拿大與云南煙葉中性香味成分的差異，可以為煙葉產(chǎn)地的溯源提供方法支撐。

關(guān)鍵詞：煙葉；萃??；中性香味成分；正交偏最小二乘法判別分析；差異性分析

中圖分類號：S572.01? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）10-0197-06

收稿日期：2023-06-20

基金項目：國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金（編號：81903507）；河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司科技項目（編號：2021410001300094）。

作者簡介：孫正光（1998—），男，云南大理人，碩士研究生，主要從事煙草香精香料研究。E-mail：zgsun914@163.com。

通信作者：王秋領(lǐng)，高級工程師，主要從事香精香料和煙草化學(xué)研究，E-mail：jrwql395139@sina.com；陳芝飛，碩士，研究員，主要從事香精香料和煙草化學(xué)研究，E-mail：chenzhifei@126.com。

加拿大煙葉具有特征性強、香氣優(yōu)雅、勁頭適宜等特點，在卷煙葉組配方中作為主料煙使用時，具有提升卷煙香氣格調(diào)、收斂煙氣和柔和吸味的作用。目前，加拿大煙葉僅在我國一二類卷煙品牌（如利群等）的葉組配方中使用，占比為5%左右，對鞏固和彰顯卷煙醇和淡雅、柔綿細(xì)膩的風(fēng)格特征貢獻(xiàn)較大［1］。因此，明確加拿大與國內(nèi)優(yōu)質(zhì)煙葉的香味成分差異，詮釋其不同風(fēng)格特征的物質(zhì)基礎(chǔ)，能為加拿大煙葉的替代工作提供有效支撐，促進(jìn)國家煙草行業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展。

卷煙抽吸品質(zhì)是多種致香物質(zhì)協(xié)同作用的結(jié)果［2-3］。李炎強等對云南煙葉香味成分進(jìn)行深入的分離鑒定研究，以了解云南煙葉感官特征與物質(zhì)組成的關(guān)系［4］；陳晨等利用國內(nèi)卷煙中性和堿性香味成分的差異性有效區(qū)分了不同風(fēng)格類型的卷煙［5-6］。傳統(tǒng)可視化分析為無監(jiān)督的多元變量統(tǒng)計，且無法獲得特征差異性物質(zhì)［7］，而正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）將正交信號矯正（OSC）與偏最小二乘判別分析（PLS-DA）相結(jié)合，為有監(jiān)督的判別分析，能有效去除不相關(guān)的差異因素來篩選組間的差異變量［8］。貊志杰等運用 OPLS-DA判別分析方法探究了不同烤煙品種石油醚提取物的差異性，有效區(qū)分了其香韻風(fēng)格形成的物質(zhì)基礎(chǔ)［9］；Esteves等利用OPLS-DA法快速高效準(zhǔn)確地對不同蘑菇樣本進(jìn)行了鑒定區(qū)分［10］；Huang等通過OPLS-DA法分析了品種、栽培方法和產(chǎn)地對紅江柑橘揮發(fā)性成分的影響及其差異性［11］。因此，本研究利用OPLS-DA法對比分析加拿大與云南煙葉中性香味成分的差異性，以期為進(jìn)口優(yōu)質(zhì)煙葉的替代和開發(fā)提供數(shù)據(jù)支撐和方法途徑。

1? 材料與方法

1.1? 主要儀器與試劑

（1）儀器：高速多功能粉碎機（2500Y，永康市鉑歐五金制品有限公司）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（8890-5977B，美國安捷倫科技有限公司）、同時蒸餾萃取裝置（鄭州賽克斯玻璃儀器有限公司）、低溫冷卻液循環(huán)泵（DLSB-5-20，鄭州長城科工貿(mào)有限公司）、數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-S2，江蘇金怡儀器科技有限公司）、調(diào)溫電熱套（ZDHW，北京中興偉業(yè)儀器有限公司）。

（2）試劑材料：二氯甲烷（色譜純，山東禹王和天下新材料有限公司）、鹽酸、無水硫酸鈉、氫氧化鈉（分析純，煙臺市雙雙化工有限公司）、2，6-二氯甲苯（98.6%，北京百靈威科技有限公司）；A1～A5為加拿大煙葉，B1～B5為云南煙葉，均為C3F等級（河南煙草工業(yè)有限責(zé)任公司提供）。

1.2? 試驗方法

1.2.1? 同時蒸餾萃?。⊿DE）和液-液萃取法（LLE）獲得煙葉中性成分

將加拿大和云南煙片分別用多功能粉碎機打碎成煙末，稱取30.0 g煙末于1 000 mL圓底燒瓶中并加入400 mL純凈水，250 mL 茄型瓶中放入100 mL二氯甲烷，同時蒸餾萃取2.5 h得到二氯甲烷萃取液。二氯甲烷經(jīng)5%NaOH堿洗5次，5%HCl酸洗5次后獲得中性成分萃取液（20 mL/次）。中性成分萃取液經(jīng)無水Na2SO4干燥后常壓濃縮至1 mL，加入100 L 2，6-二氯甲苯（0.556 7 mg/mL）內(nèi)標(biāo)溶液后通過GC-MS進(jìn)行化學(xué)成分分析。

1.2.2? 中性成分的GC-MS檢測條件

色譜條件：Agilent DB-5 MS毛細(xì)管柱（60 m×250 μm×0.25 μm）；進(jìn)行口溫度：280 ℃；載氣：99.999%高純度氦氣，流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量為1.0 μL；分流模式為分流進(jìn)樣，分流比為2 ∶1。升溫程序：初始溫度為40 ℃，保持10 min；2.5 ℃/min升至190 ℃，保持25 min；1.5 ℃/min升至270 ℃，保持0 min。

質(zhì)譜條件：采用SCAN模式，傳輸線溫度為 280 ℃；離子源溫度為230 ℃；四極桿溫度為 150 ℃；離子源為XTR-EI源，電子能量為70 eV；溶劑延遲時間為8 min；掃描范圍：35～550 amu。

1.2.3? 數(shù)據(jù)分析

NIST 20譜庫檢索結(jié)合保留指數(shù)對比分析進(jìn)行化合物定性分析；采用內(nèi)標(biāo)-半定量法進(jìn)行定量分析；Origin 2018繪制雷達(dá)圖，結(jié)合中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)繪制中性成分指紋圖譜；SIMCA 14.1進(jìn)行OPLS-DA分析并計算重要性投影值（VIP）；用SPSS 27.0 進(jìn)行獨立樣本t檢驗計算P值；用TBtools繪制聚類熱圖。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 煙葉中性香味成分指紋圖譜

根據(jù)色譜組分保留時間及豐度繪制煙葉中性成分指紋圖譜，具體如圖1所示，不同地區(qū)煙葉中性成分種類基本相似，但含量存在明顯差異性。

2.2? 煙葉中性香味成分總體情況

經(jīng)譜庫檢索和保留指數(shù)定性分析，加拿大煙葉共鑒定出83種化合物，而云南煙葉共鑒定出89種。其中，中性香味物質(zhì)共69種，加拿大煙葉59種（總含量92.02 μg/g），云南煙葉63種（總含量 113.91 μg/g）（表1）。加拿大煙葉中類胡蘿卜素降解形成的香味成分共18種，西柏烷類降解形成的香味成分1種，棕色化反應(yīng)形成的香味成分10種，苯丙氨酸轉(zhuǎn)化產(chǎn)物4種，其他類26種；與之對應(yīng)，云南煙葉中不同種類的香味成分分別為19、1、11、4、28種。由圖2可知，加拿大煙葉各成分占比表現(xiàn)為類胡蘿卜素類降解產(chǎn)物＞其他類＞西柏烯類降解產(chǎn)物＞棕色化反應(yīng)產(chǎn)物類＞苯丙氨酸類降解產(chǎn)物，云南煙葉表現(xiàn)為中類胡蘿卜素類降解產(chǎn)物＞西柏烯類降解產(chǎn)物＞苯丙氨酸類降解產(chǎn)物＞其他類＞棕色化反應(yīng)產(chǎn)物類。

云南煙葉風(fēng)格特征主要表現(xiàn)為清甜香韻，香氣飄逸；加拿大煙葉則表現(xiàn)為焦甜香韻，香氣濃郁豐滿，透發(fā)性強。云南煙葉中類胡蘿卜降解產(chǎn)物含量占比最高且遠(yuǎn)高于加拿大煙葉，這類成分是云南煙葉清香風(fēng)格的主要內(nèi)在因素［12］。加拿大煙葉的棕色化反應(yīng)產(chǎn)物類含量明顯高于云南煙葉，這是加拿大煙葉呈現(xiàn)焦甜感，形成濃香風(fēng)格的成因之一。

2.3? 煙葉中性香味成分差異性

為明確加拿大和云南煙葉中性香味成分的差異性，以69種中性香味成分和不同地區(qū)作為因自變量，通過OPLS-DA法區(qū)分2種不同地區(qū)煙葉中性香味成分的差異，如圖3-a所示。該模型判別分析中R2x為0.787，R2y為0.994，Q2為0.959，因自變量R2和預(yù)測指數(shù)Q2均大于0.5，表明模型穩(wěn)定可接受［13］。經(jīng)過200次置換響應(yīng)檢驗，模型的預(yù)測指數(shù)Q2與Y軸相交于負(fù)半軸（圖3-b），說明該模型擬合有效，不存在模型過擬合［14］，因此該模型結(jié)果可鑒別加拿大煙葉與云南煙葉的中性香味成分差異性。

通常認(rèn)為VIP大于1可作為解釋區(qū)分2個不同樣本物質(zhì)的差異性成分，因此以顯著性差異且重要性投影值大于1的中性香味成分（P<0.05且 VIP>1）為篩選標(biāo)椎［13］（表1、圖3-c），進(jìn)一步篩選加拿大與云南煙葉中關(guān)鍵差異性中性香味成分。由圖4可知，共篩選出18種關(guān)鍵差異性中性香味成分，其中類胡蘿卜素降解產(chǎn)物9種，西柏烯類降解產(chǎn)物1種，棕色化反應(yīng)產(chǎn)物類2種，苯丙氨酸類降解產(chǎn)物2種，其他類4種。聚類熱圖分析表明，區(qū)域A為加拿大煙葉含量較突出的有6種香氣成分，包括氧化石竹烯、（S）-5-羥甲基二氫呋喃-2-酮、α-石竹烯、糠醛、茄酮和α-香附酮；區(qū)域B為云南煙葉中含量較突出的有12種中性香味成分，包括苯乙醛、5，6-環(huán)氧-β-紫羅蘭酮、巨豆三烯酮a、（E）-β-大馬酮、香葉基丙酮、二氫大馬酮、巨豆三烯酮c、棕櫚酸甲酯、巨豆三烯酮b、巨豆三烯酮d、金合歡基丙酮和苯乙醇。

類胡蘿卜素類降解形成的香味成分閾值低、刺激性小、香氣質(zhì)好、對煙葉香氣貢獻(xiàn)率大，是影響煙葉香氣質(zhì)和香氣量的重要組分［15］。巨豆三烯酮具

有煙草香和辛香底韻，具有增強煙香、調(diào)和煙氣的作用［16］，巨豆三烯酮的4個同分異構(gòu)體在云南煙葉中顯著存在，但相關(guān)研究表明，含量最高的巨豆三烯酮b對煙葉香氣質(zhì)有負(fù)向作用［17］，也側(cè)面凸顯卷煙抽吸品質(zhì)是多種致香物質(zhì)及其含量協(xié)同作用的結(jié)果［18］。李章海等提出并建立了9種中性香氣成分與煙葉香型指數(shù)之間的回歸模型，其中茄酮對濃香風(fēng)格貢獻(xiàn)較大，大馬酮及棕櫚酸甲酯對清香風(fēng)格貢獻(xiàn)較大［19］，本研究結(jié)果與之相一致。茄酮作為典型的類西柏烷類物質(zhì)，它可以調(diào)和香氣，從而使香氣更加持久。徐秀娟等研究發(fā)現(xiàn)，糠醛與卷煙抽吸透發(fā)性關(guān)系密切［20］，而本研究的加拿大與云南煙葉中糠醛含量呈極顯著性差異（P=0.003<0.01），這或許是加拿大煙葉香氣濃郁，透發(fā)性強的原因之一。苯乙醇帶有甜香、堅果香，苯乙醛具有花香、清甜香，苯丙氨酸類降解產(chǎn)物貢獻(xiàn)云南煙葉的果香、清香風(fēng)格［21-22］。加拿大煙葉其他類差異中性香味成分氧化石竹烯、α-石竹烯、α-香附酮皆為倍半萜類化合物，倍半萜類化合物可以增加香氣的透發(fā)持久性。

3? 結(jié)論

通過SDE和LLE獲得了加拿大和云南煙葉的中性成分，GC-MS分析測定了不同煙葉中性香氣成分的種類和含量。 2 種煙葉共檢測出69種中性香味物質(zhì)，加拿大煙葉共鑒定出59種中性香味成分，云南煙葉共鑒定出63種，成分種類基本相似，但各類物質(zhì)的含量存在差異性；以P<0.05且VIP>1為標(biāo)準(zhǔn)，通過OPLS-DA法鑒別加拿大煙葉與云南煙葉的中性香味成分的差異性，篩選得到18種差異中性香味成分，其中云南煙葉中含量較突出的有12種中性香味成分，包括苯乙醛、5，6-環(huán)氧-β-紫羅蘭酮、巨豆三烯酮a、（E）-β-大馬酮、香葉基丙酮、二氫大馬酮、巨豆三烯酮c、棕櫚酸甲酯、巨豆三烯酮b、巨豆三烯酮d、金合歡基丙酮和苯乙醇；加拿大煙葉含量較突出的有6種香氣成分，包括氧化石竹烯、（S）-5-羥甲基二氫呋喃-2-酮、α-石竹烯、糠醛、茄酮和α-香附酮。

本試驗僅對比分析了加拿大與云南煙葉中性香味成分的差異性，初步明確了2種煙葉不同風(fēng)格特征的中性香味物質(zhì)基礎(chǔ)，為加拿大煙葉的替代工作提供了有效的數(shù)據(jù)支撐。但卷煙品質(zhì)的優(yōu)劣是多種致香成分協(xié)同作用的結(jié)果，后續(xù)研究會進(jìn)一步增加香味成分種類，如酸性、堿性、糖苷、糖酯類化合物等。并結(jié)合活性閾值和分子感官科學(xué)，以特征化學(xué)成分為原料模擬調(diào)香，使優(yōu)質(zhì)進(jìn)口煙葉特征風(fēng)格再現(xiàn)，從而降低國內(nèi)優(yōu)質(zhì)卷煙發(fā)展對進(jìn)口煙葉的依賴性，為凸顯及固化產(chǎn)品風(fēng)格特征提供技術(shù)保障。

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