Effects of lncRNA SNHG12 on the proliferation，migration and invasion of prostate cancer cells by targeting miR-495-3p/PI3K/Akt signaling pathway

TIAN Li1，CUI Haijun2，XU Jinheng1，HU Yueming1，ZHAO Jihua3，CAO Bohai1

（1.Department of Pathology，2.Department of Urology，Tangshan Central Hospital，Tangshan 063000；3.Clinical Medicine School of North China University of Technology，Tangshan 063000，China ）

ABSTRACT：Objective To explore the effects of long non-coding RNA （lncRNA） small nucleolar molecule RNA host gene 12 （SNHG12） targeting inhibition of miR-495-3p/ phospholipinositol-3-kinase （PI3K）/protein kinase B （Akt） signaling pathway on the proliferation，migration and invasion of prostate cancer cells.Methods The expressions of SNHG12 and miR-495-3p in prostate cancer tissues and cells （LNCaP，C4-2，DU145） were detected with real-time fluorescence quantitative PCR （qRT-PCR）.After DU145 cells were divided into si-NC，si-SNHG12，si-SNHG12+anti-miR-NC and si-SNHG12+anti-miR-495-3p groups，the expressions of SNHG12 and miR-495-3p were detected with qRT-PCR；the targeting relationship between SNHG12 and miR-495-3p was determined with dual luciferase assay；cell proliferation was assessed with MTT assay；cell migration and invasion were evaluated with Transwell assay；the protein expressions of proliferating cell nuclear antigen （PCNA），N-cadherin，and E-cadherin were detected with Western blot.Results The expressions of SNHG12 were significantly increased，while the expression of miR-495-3P was significantly decreased in prostate cancer tissues and cells （LNCaP，C4-2，DU145） （P＜0.05）.Knockdown of SNHG12 decreased DU145 cell activity，lowered the protein expressions of PCNA and N-cadherin，reduced the number of migrating and invading cells，but increased the protein expression of E-cadherin （Plt;0.05）.SNHG12 targeted and negatively regulated miR-495-3p，and down-regulation of miR-495-3p reversed the effects of SNHG12 knockdown on the proliferation，migration and invasion of prostate cancer cells.Compared with the si-NC group，the si-SNHG12 group had significantly decreased expressions of p-PI3K and p-Akt （Plt;0.05）.Compared with the si-SNHG12+anti-miR-NC group，the si-SNHG12+anti-miR-495-3p group had significantly increased protein expressions of p-PI3K and p-Akt （Plt;0.05）.Conclusion lncRNA SNHG12 can promote the proliferation，migration and invasion of prostate cancer cells through targeted inhibition of miR-495-3p/PI3K/Akt signaling pathway.

KEY WORDS：lncRNA；SNHG12；miR-495-3p；PI3K/Akt signaling pathway；prostate cancer；proliferation；migration；invasion

摘要：目的 探究長鏈非編碼RNA（lncRNA）核仁小分子RNA宿主基因12（SNHG12）靶向抑制miR-495-3p/磷脂肌醇-3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路對前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。方法 實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測前列腺癌組織和細(xì)胞（LNCaP、C4-2、DU145）中SNHG12、miR-495-3p相對表達(dá)水平（將其中的DU145細(xì)胞分為si-NC組、si-SNHG12組、si-SNHG12+anti-miR-NC組、si-SNHG12+anti-miR-495-3p組，4組檢測）；雙熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)檢測SNHG12與miR-495-3p靶向關(guān)系；MTT法檢測細(xì)胞增殖；Transwell檢測細(xì)胞遷移和侵襲；蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）蛋白相對表達(dá)水平。結(jié)果 在前列腺癌組織和細(xì)胞（LNCaP、C4-2、DU145）中SNHG12相對表達(dá)水平明顯升高，miR-495-3p相對表達(dá)水平明顯降低（Plt;0.05）；敲低SNHG12可降低DU145細(xì)胞活性、PCNA、N-cadherin蛋白相對表達(dá)水平，減少遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)，增加E-cadherin蛋白相對表達(dá)水平（P＜0.05）；SNHG12可靶向負(fù)調(diào)控miR-495-3p，下調(diào)miR-495-3p可逆轉(zhuǎn)敲低SNHG12對前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響。與si-NC組相比，si-SNHG12組p-PI3K、p-Akt蛋白相對表達(dá)水平明顯降低（Plt;0.05）；與si-SNHG12+anti-miR-NC組相比，si-SNHG12+anti-miR-495-3p組p-PI3K、p-Akt蛋白相對表達(dá)水平明顯增加（Plt;0.05）。結(jié)論 lncRNA SNHG12可能通過靶向抑制miR-495-3p/PI3K/Akt信號通路促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

關(guān)鍵詞：長鏈非編碼RNA；核仁小分子RNA宿主基因12；miR-495-3p；PI3K/Akt信號通路；前列腺癌；增殖；遷移；侵襲

中圖分類號：R737"" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1009-8291.2024.07.016

前列腺癌的發(fā)病率在全球范圍男性腫瘤中位居第2，死亡率位居第5，且其發(fā)病率逐年升高，嚴(yán)重威脅患者的生命健康[1]。研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌惡性進(jìn)展與分子靶向密切相關(guān)[2]。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是長度超過200個核苷酸的轉(zhuǎn)錄因子，其在腫瘤中異常表達(dá)，可在轉(zhuǎn)錄水平直接或間接參與腫瘤靶基因表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞惡性進(jìn)展[3]。CHENG等[4]通過人類癌癥轉(zhuǎn)移數(shù)據(jù)庫和基因組圖譜發(fā)現(xiàn)，核仁小分子RNA宿主基因12（small nucleolar molecule RNA host gene 12，SNHG12）在前列腺癌中異常表達(dá)，通過實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng) （reverse transcription real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測發(fā)現(xiàn)SNHG12在前列腺癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，可通過靶向調(diào)控miR-133b促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。筆者通過在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測發(fā)現(xiàn)，SNHG12與miR-495-3p存在結(jié)合位點(diǎn)，而miR-495-3p在前列腺癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)，過表達(dá)miR-495-3p可抑制前列腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，并加速細(xì)胞凋亡[5]。磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/絲氨酸-蘇氨酸激酶（protein kinase B，Akt/PKB）信號通路是前列腺癌中研究較為廣泛的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，有研究證實(shí)，該信號通路與前列腺癌惡性進(jìn)展密切相關(guān)[6]。但關(guān)于SNHG12靶向抑制miR-495-3p/PI3K/Akt信號通路、miR-495-3p與PI3K/Akt信號通路調(diào)控前列腺癌的研究尚不清楚。故本研究嘗試探究lncRNA SNHG12靶向抑制miR-495-3p/PI3K/Akt信號通路對前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 主要細(xì)胞與試劑 正常前列腺上皮RWPE-1細(xì)胞、人前列腺癌LNCaP、C4-2、DU145細(xì)胞購于ATCC公司；胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基購于美國Gibco公司；Lipofectamine 2000試劑盒、Trizol試劑盒購于美國Invitrogen公司；si-NC、pcDNA、pcDNA-SNHG12、si-SNHG12、anti-miR-NC、anti-miR-495-3p及引物購于上海吉瑪公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix試劑盒購于日本TaKaRa公司；噻唑藍(lán)（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）試劑盒、雙熒光素酶檢測試劑盒購于北京索萊寶；Transwell、基質(zhì)膠購于美國Corning公司；E-鈣黏蛋白（E-cadherin）抗體、增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nu-clear antigen，PCNA）抗體、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體、p-PI3K抗體（磷酸Y607）、p-Akt抗體（磷酸T308）、PI3K抗體、Akt抗體購于英國Abcam公司。

1.2 組織樣本收集 選取2021年5月—2022年5月唐山中心醫(yī)院收治的44例前列腺癌患者，年齡＞55歲者20例，≤55歲者24例；高分化12例；低、中分化32例；TMN分期Ⅰ～Ⅱ期27例，Ⅲ～Ⅳ期17例；19例轉(zhuǎn)移。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)臨床病理證實(shí)確診為前列腺癌；入院前未接受任何放化療；預(yù)計生存期＞6個月。排除標(biāo)準(zhǔn)：其他惡性腫瘤；復(fù)發(fā)性前列腺癌患者；血液或自身免疫疾??；傳染性疾病。將患者手術(shù)切除的癌組織、癌旁組織（＜3 cm）置于液氮保存。

1.3 培養(yǎng)細(xì)胞與分組 將正常前列腺上皮RWPE-1細(xì)胞、人前列腺癌LNCaP、C4-2、DU145細(xì)胞從超低溫冰箱中取出，常規(guī)復(fù)蘇后加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱。取對數(shù)期DU145細(xì)胞，以1×104個/孔接種于6孔板中，細(xì)胞融合至70%進(jìn)行轉(zhuǎn)染，用不含血清培養(yǎng)基稀釋si-NC、pcDNA、pcDNA-SNHG12、

si-SNHG12、si-SNHG12與anti-miR-NC、si-SNHG12與anti-miR-495-3p，移液器輕輕吹打，孵育5 min，用不含血清培養(yǎng)基稀釋Lipofectamine 2000，與轉(zhuǎn)染稀釋液充分混勻，以脂質(zhì)體法將si-NC、pcDNA、pcDNA-SNHG12、si-SNHG12、si-SNHG12與anti-miR-NC、si-SNHG12與anti-miR-495-3p轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6 h更換培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，記作si-NC組、pcDNA組、pcDNA-SNHG12組、si-SNHG12組、si-SNHG12+anti-miR-NC組及si-SNHG12+anti-miR-495-3p組。

1.4 qRT-PCR檢測SNHG12、miR-495-3p的相對表達(dá)水平 取癌旁組織、前列腺癌組織、正常前列腺上皮RWPE-1細(xì)胞、人前列腺癌LNCaP、C4-2、DU145細(xì)胞及各組DU145細(xì)胞，以Trizol法提取組織和細(xì)胞總RNA，取2 μL RNA用于檢測濃度和純度，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，配置PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（10 μL SYBR Green Master Mix，正、反向引物各0.8 μL，2 μL cDNA，dd H2O補(bǔ)足至20 μL）后，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。2-ΔΔCt法計算SNHG12、miR-495-3p的相對表達(dá)水平。

1.5 雙熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)檢測SNHG12與miR-495-3p靶向關(guān)系 將含有SNHG12與miR-495-3p結(jié)合位點(diǎn)、突變位點(diǎn)序列分別插入熒光素酶載體上，構(gòu)建野生型、突變型載體，即WT SNHG12、MUT SNHG12，脂質(zhì)體法與miR-NC或miR-495-3p共轉(zhuǎn)染至DU145細(xì)胞，培養(yǎng)48 h，按照雙熒光素酶報告試劑盒檢測細(xì)胞熒光素酶活性。

脂質(zhì)體法將si-NC、pcDNA、pcDNA-SNHG12及si-SNHG12轉(zhuǎn)染DU145細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后qRT-PCR法檢測細(xì)胞miR-495-3p相對表達(dá)水平。

1.6 MTT法檢測細(xì)胞增殖 收集si-NC組、si-SNHG12組、si-SNHG12+anti-miR-NC組及si-SNHG12+anti-miR-495-3p組細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)48 h向孔內(nèi)添加20 μL MTT試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h添加150 μL二甲基亞砜，酶標(biāo)儀490 nm測定各孔細(xì)胞吸光度值，用于計算細(xì)胞活性（%），細(xì)胞活性=實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對照組吸光度值×100%。

1.7 Transwell檢測細(xì)胞遷移和侵襲 遷移實(shí)驗(yàn)：收集si-NC組、si-SNHG12組、si-SNHG12+anti-miR-NC組及si-SNHG12+anti-miR-495-3p組細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基饑餓處理24 h，加磷酸鹽緩沖液調(diào)整密度至5×104個/mL，取100 μL加Transwell上室，下室加含血清培養(yǎng)基500 μL，培養(yǎng)24 h，采取未遷移細(xì)胞，加甲醇固定、結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)：用基質(zhì)膠包被Transwell上室，在室溫下凝固，其余實(shí)驗(yàn)步驟與遷移實(shí)驗(yàn)一致。

1.8 Western blot檢測PCNA、N-cadherin及E-cadherin蛋白相對表達(dá)水平 收集si-NC組、si-SNHG12組、si-SNHG12+anti-miR-NC組及si-SNHG12+anti-miR-495-3p組細(xì)胞加RIPA裂解液水浴30 min，

以BCA法測定獲得的總蛋白濃度，將40 μg蛋白樣品與上樣緩沖液充分混勻，凝膠分離蛋白后轉(zhuǎn)膜、脫脂奶粉封閉培養(yǎng)2 h，加入PCNA、N-cadherin、E-cadherin、GAPDH抗體在4 ℃的溫度下過夜孵育，室溫下加二抗稀釋液孵育2 h。最后滴加發(fā)光試劑顯影，采用Image J分析條帶灰度值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS 25.0軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料用±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SNHG12在前列腺癌組織和細(xì)胞中的相對表達(dá)水平 與癌旁組織相比，前列腺癌組織中SNHG12相對表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05，圖1A）；與RWPE-1細(xì)胞相比，前列腺癌細(xì)胞LNCaP、C4-2、DU145中SNHG12相對表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05，圖1B）。

2.2 敲低SNHG12對前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及蛋白表達(dá)的影響 與si-NC組相比，si-SNHG12組SNHG12相對表達(dá)水平、細(xì)胞活性、遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少，PCNA、N-cadherin蛋白相對表達(dá)水平顯著降低，E-cadherin蛋白相對表達(dá)水平顯著增高（P＜0.05，表1、圖2）。

2.3 SNHG12靶向調(diào)控miR-495-3p以及miR-495-3p在前列腺癌組織和細(xì)胞的相對表達(dá)水平 在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測顯示，WT SNHG12與miR-495-3p存在互補(bǔ)核苷酸序列（圖3）。

與miR-NC組比較，miR-495-3p組可降低WT SNHG12熒光素酶活性（P＜0.05），兩組MUT SNHG12熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，表2）。

與癌旁組織相比，前列腺癌組織miR-495-3p相對表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與RWPE-1細(xì)胞相比，前列腺癌細(xì)胞LNCaP、C4-2、DU145中miR-495-3p相對表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05，圖4）。

2.4 SNHG12靶向調(diào)控miR-495-3p 與si-NC組相比，si-SNHG12組miR-495-3p相對表達(dá)水平顯著增加［（1.00±0.11）vs.（3.45±0.43），t=16.560，P＜0.05］，與pcDNA組相比，pcDNA-SNHG12組miR-495-3p相對表達(dá)水平顯著降低［（0.99±0.08）vs.（0.33±0.05），t=20.988，P＜0.05］，上述4組間比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=330.351，P＜0.001）。

2.5 下調(diào)miR-495-3p可逆轉(zhuǎn)敲低SNHG12對前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響 與si-SNHG12+anti-miR-NC組相比，si-SNHG12+anti-miR-495-3p組miR-495-3p相對表達(dá)水平、E-cadherin蛋白相對表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞活性、PCNA、N-cadherin蛋白相對表達(dá)水平顯著增加，遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)明顯增多（P＜0.05，表3、圖5）。

2.6 SNHG12靶向抑制miR-495-3p

進(jìn)而調(diào)控PI3K/Akt信號通路 與si-NC組相比，si-SNHG12組p-PI3K、p-Akt蛋白相對表達(dá)水平顯著降低（t=18.385、18.053，P＜0.05）；與si-SNHG12+anti-miR-NC組相比，si-SNHG12+anti-miR-495-3p組p-PI3K、p-Akt蛋白相對表達(dá)水平顯著增加（t=12.206、13.787，P＜0.05，表4、圖6）。

3 討 論

隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷進(jìn)步，前列腺癌患者的生存率不斷提高，但其仍是男性惡性腫瘤死亡率較高的腫瘤之一[7]。目前臨床治療前列腺癌的方法主要有外科手術(shù)、放化療、靶向治療等，雖然可有效延長患者的生存期，但多數(shù)患者在確診時已處于晚期，錯失最佳治療時期[8]。因此，開展前列腺癌分子機(jī)制研究有助于提高前列腺癌早期診斷，改善預(yù)后。

lncRNA是一種可調(diào)控多種疾病、參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的因子。已有研究顯示，lncRNA異常表達(dá)可參與前列腺癌細(xì)胞的增殖、凋亡、鐵死亡、遷移和侵襲等生物學(xué)進(jìn)程，進(jìn)而促進(jìn)前列腺癌惡性發(fā)展[8-9]。如FERRI等[10]的研究顯示，在前列腺癌患者組織中MALAT1高表達(dá)，且與患者Gleason分級、轉(zhuǎn)移、生存率低等有關(guān)，MALAT1可通過靶向調(diào)控miR-423-5p促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。SNHGs家族成員眾多，目前

有8個成員

相繼被報道與前列腺癌有關(guān)，而SNHG12是其中一種，SNHG12主要位于1p35.3區(qū)域，可參與前列腺癌惡性進(jìn)展[11]。楊菲等[12]研究顯示，前列腺癌細(xì)胞和組織中SNHG12高表達(dá)，敲低SNHG12可抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。而SONG等[13]的研究也證實(shí)了SNHG12可促進(jìn)前列腺癌惡性進(jìn)展，SNHG12可作為前列腺癌新的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。本研究顯示，在前列腺癌組織和LNCaP、C4-2、DU145細(xì)胞中SNHG12相對表達(dá)水平

異常升高，敲低SNHG12可降低細(xì)胞增殖活性，并減少細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)，降低PCNA、N-cadherin蛋白相對表達(dá)水平，增加E-cadherin蛋白相對表達(dá)水平，表明敲低SNHG12可抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，這與上述研究結(jié)論一致。

miRNA也是近年表觀遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)，有研究證實(shí)，lncRNA對miRNA具有海綿吸附作用，通過競爭性結(jié)合miRNA參與前列腺癌惡性進(jìn)展[14]。本研究通過在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測，發(fā)現(xiàn)SNHG12與miR-495-3p存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，也證實(shí)SNHG12靶向調(diào)控miR-495-3p。miR-495-3p是miRNA成員之一，在多種腫瘤中異常低表達(dá)，如宮頸癌、食管癌、結(jié)直腸癌等，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移和凋亡等參與腫瘤細(xì)胞惡性進(jìn)展[15-17]。已有研究證明miR-495-3p可介導(dǎo)參與前列腺癌進(jìn)展[5]，本研究也發(fā)現(xiàn)，miR-495-3p在前列腺癌細(xì)胞和組織中低表達(dá)，且進(jìn)一步證實(shí)，SNHG12可靶向負(fù)調(diào)控miR-495-3p，下調(diào)miR-495-3p可逆轉(zhuǎn)敲低SNHG12對前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響，表明SNHG12可能通過靶向負(fù)調(diào)控miR-495-3p參與前列腺癌惡性進(jìn)展。

PI3K是一種具有特異性活化的磷脂酰肌醇物質(zhì)，被激活后轉(zhuǎn)化為PIP3，并與Akt結(jié)合參與疾病進(jìn)展[18]。研究表明，PI3K/Akt信號通路可介導(dǎo)參與多種腫瘤惡性進(jìn)展[19]。激活PI3K/Akt信號通路受到抑制后，可促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，敲低SNHG12可下調(diào)前列腺癌細(xì)胞中p-PI3K、p-Akt蛋白相對表達(dá)水平，下調(diào)miR-495-3p可逆轉(zhuǎn)敲低SNHG12對前列腺癌細(xì)胞p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)，表明SNHG12可能通過靶向調(diào)控miR-495-3p/PI3K/Akt信號通路影響前列腺癌惡性進(jìn)展。

綜上所述，SNHG12在前列腺癌細(xì)胞和組織中異常高表達(dá)，且敲低SNHG12可抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，其作用機(jī)制可能與miR-495-3p/PI3K/Akt信號通路有關(guān)。

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（編輯 閆玉梅）