摘要：目的 分析胎盤病因不明絨毛炎（Villitis of Unknown Etiology， VUE）可能的發(fā)病機制， 篩選出在疾病中起關鍵作用的靶基因． 方法 從基因表達綜合數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus， GEO）中下載VUE及正常對照組織的基因表達譜數(shù)據(jù)． 通過加權基因共表達網絡分析（Weighted Correlation Network Analysis， WGCNA）和基因差異表達分析識別關鍵的VUE基因． 使用基因本體論（Gene Ontology， GO）以及京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， KEGG）分析VUE可能的發(fā)病機制． 通過蛋白質蛋白質相互作用（Protein-protein Interaction， PPI）對關鍵VUE基因進一步篩選發(fā)現(xiàn)VUE核心靶基因； 最后通過受試者工作特征（Receiver Operating Characteristic， ROC）曲線和單因素邏輯回歸對核心靶基因進行分析． 結果 通過加權基因共表達網絡（WGCNA）分析和基因差異表達分析， 發(fā)現(xiàn)了206個VUE核心基因， 對其進行功能分析發(fā)現(xiàn)這些核心VUE基因主要在跨膜受體蛋白絲氨酸/蘇氨酸的負調控、 細胞結構組織和細胞外基質結構成分等功能上富集， 而富集通路主要包括Hippo信號通路、 TGF信號通路和Wnt信號通路等． 利用這206個關鍵基因構建PPI網絡篩選出10個VUE核心靶基因， 對其進行分析發(fā)現(xiàn)它們均可作為識別VUE的獨立因素， 且其中9個基因與VUE發(fā)生風險呈顯著負相關關系． 結論 發(fā)現(xiàn)了幾種VUE發(fā)生發(fā)展的可能作用機制， 且MRPL13，F(xiàn)BN1，CTGF，SLC2A10，SLIRP，CAV1，WNT5A，VAMP7，PPP1CB，VBP1有望成為VUE診斷和治療的生物標志物．

關 鍵 詞：胎盤病因不明絨毛炎； 加權基因共表達網絡分析； 靶基因

中圖分類號：Q987； R711

文獻標志碼：A

文章編號：16739868（2024）08004509

Screening of Key Genes for Villitis of Unknown Etiology

CHEN Yifeng TAN Liping YANG Chunxue

CHEN Xuemei HE Junlin GAO Rufei

1. Department of Reproductive Biology， School of Public Health， Chongqing Medical University， Chongqing 400016， China；

2. Reproductive and Developmental Joint Laboratory of International Cooperation， the Ministry of Education， "Chongqing 400016， China

Abstract： Objective of this study is to analyze the possible development mechanisms of villitis of unknown etiology （VUE） and the screening of target genes that play a key role in the disease． Gene expression profile data of VUE patients and healthy individuals were downloaded from the Gene Expression Omnibus （GEO）． Bioinformatics methods were applied to perform a weighted correlation network analysis （WGCNA） and gene differential expression analysis to identify key VUE genes． The Gene Ontology（GO） and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） analysis were used to discover the possible mechanisms of action． Key VUE genes were further screened by protein-protein interactions （PPI） to identify core VUE target genes． Finally， the core target genes were analyzed by ROC curve and univariate logistic regression． By WGCNA analysis and gene differential expression analysis， 206 VUE core genes were identified． Functional analysis found that these core VUE genes were mainly enriched in the negative regulation of the transmembrane receptor protein serine/threonine， cellular structural organization and extracellular matrix structural components， while the enriched pathways mainly included Hippo signaling pathway， TGF signaling pathway and Wnt signaling pathway． 10 VUE core target genes were selected from 206 key genes． Finally， the analysis of the 10 core target genes found that they all could be used as independent factors to identify VUE， and 9 genes showed a significant negative correlation with the risk of developing VUE． This study found several possible mechanisms of the occurrence and development of VUE， and MRPL13， FBN1， CTGF， SLC2A10， SLIRP， CAV1， WNT5A， VAMP7， PPP1CB and VBP1 are expected to become biomarkers for the diagnosis and treatment of VUE．

Key words： villitis of unknown etiology； WGCNA； target genes

胎盤是女性懷孕的關鍵器官， 其發(fā)育異?；蚬δ苷系K將增加流產、 早產和死產等不良妊娠結局的發(fā)生風險［1］． 在女性妊娠過程中胎盤常發(fā)生炎癥性改變， 即胎盤絨毛炎［2］． 研究發(fā)現(xiàn)， 胎盤絨毛炎的發(fā)生會導致產婦在圍產期感染風險增加， 也會對胎兒和新生兒健康產生嚴重影響［3］． 關于導致胎盤絨毛炎發(fā)生的病因， 已有研究表明部分絨毛炎的發(fā)生是由細菌感染引起［4］． 然而， 大多數(shù)的絨毛炎病例到目前為止還沒有明確的病因， 這些病例被定義為病因不明絨毛炎（Villitis of Unknown Etiology， VUE）［5］． 據(jù)調查， 在發(fā)達國家中VUE占所有胎盤絨毛炎病例的95%左右［6］． 而VUE的發(fā)生可能會導致母體與胎兒間產生排斥反應， 增加流產風險［3］． 因此， VUE的早期發(fā)現(xiàn)和診斷對于女性妊娠安全和胎兒健康均具有重要意義． 但VUE發(fā)生發(fā)展的具體作用機制尚未明確， 且缺乏在VUE發(fā)病過程中起關鍵作用的基因識別．

由于疾病的發(fā)生通常受一些異常表達基因的調控， 這些基因直接或間接地負責疾病的發(fā)生與發(fā)展［7-8］． 因此， 識別出VUE的特異性核心靶基因有助于發(fā)現(xiàn)VUE發(fā)病的作用機制， 進而為治療VUE提供理論基礎和科學依據(jù)． 隨著測序技術的發(fā)展， 生物信息學分析已被廣泛應用于識別基因表達特征與疾病之間的相互作用． 然而， 尚未有研究者使用生物信息學分析發(fā)現(xiàn)VUE發(fā)生發(fā)展相關的疾病特異性生物標志物． 近年來， 大規(guī)模的基因組圖譜提供了基因表達數(shù)據(jù)， 為識別VUE的特異性核心靶基因提供了極好的機會． 因此， 本研究旨在從生物信息學分析的角度找出VUE的特異性核心靶基因， 為VUE的進一步研究提供參考．

1 材料與方法

1.1 材料搜集

本研究所用數(shù)據(jù)下載自美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information， NCBI）的基因表達綜合數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus， GEO） （https： //www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）． 下載VUE基因表達數(shù)據(jù)集GSE130856［3］， 其中病例組包括20個患有VUE的胎盤組織樣本， 正常對照組包括與病例組胎齡完全匹配的9個正常胎盤組織樣本． GSE130856基因表達譜陣列基于GPL570［HG-U133_Plus_2］ Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array軟件進行分析．

1.2 方法

1.2.1 基因表達數(shù)據(jù)預處理及標準化

從GEO數(shù)據(jù)庫中下載原始數(shù)據(jù)， 然后用R統(tǒng)計軟件（版本4.2.3， https： //www.r-project.org/）和生物導體分析工具（http： //www.bioconductor.org/）進行預處理和歸一化． 應用“affy”R語言包進行RMA背景校正、 完全log2變換、 分位數(shù)歸一化和中值優(yōu)化， 并排除沒有匹配基因符號的探針． 對映射到同一基因的多個探針， 取平均值作為最終的表達值．

1.2.2 加權基因共表達網絡（WGCNA）的構建

使用“WGCNA” R語言包對標準化處理后的基因表達數(shù)據(jù)集進行基因共表達模塊分析， 篩選出關鍵基因． ① 通過對基因相關系數(shù)取n次冪的方式計算任意兩個基因之間的相關系數(shù)， 并以合適的軟閾值構建無標度鄰接網絡． ② 將鄰接網絡轉化為拓撲重疊矩陣（Topological Overlap Matrix， TOM）來計算基因之間的關系． ③ 再基于TOM值的相異度對基因構建層次聚類樹， 篩選出連接度高的基因并定義為模塊． ④ 通過模塊與疾病狀態(tài)的相關系數(shù)及p值繪制模塊與疾病的相關性熱圖， 并計算基因與模塊之間的相關性（Module Membership， MM）和基因的重要性（Gene Signicance， GS）［9］．

1.2.3 差異表達基因分析

使用“l(fā)imma”R語言包［10］對標準化后的數(shù)據(jù)集進行差異表達基因分析． 將p＜0.05和｜log2FC｜≥1設為識別VUE差異表達基因（Differentially expressed genes， DEGs）的閾值， 然后通過“ggplot2”R語言包（https： //ggplot2.tidyverse.org）繪制熱圖和火山圖進行可視化．

1.2.4 功能和途徑富集分析

使用“org.Hs.eg.db”R語言包（https： //www.bioconductor.org/packages/release/data/annotation/html/org.Hs.eg.db.html）對數(shù)據(jù)集進行基因本體論（Gene Ontology， GO）以及京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， KEGG）分析， p＜0.05視為有統(tǒng)計學意義， 并使用“enrichplot”R語言包（https： //yulab-smu.top/biomedical-knowledge-mining-book/）進行GO和KEGG的可視化．

1.2.5 蛋白質蛋白質相互作用（Protein-Protein Interaction， PPI）網絡構建

將篩選出的關鍵VUE基因導入基因/蛋白相互作用檢索搜查工具（Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins， STRING）數(shù)據(jù)庫（http： // www.string-db.org/）， 獲得PPI網絡， 然后將PPI網絡導入Cytoscape軟件（版本3.9.1）進行可視化． 使用CytoNCA插件計算平均中介中心度值． 中介中心度是一個結點擔任其他兩個結點之間最短橋梁的次數(shù)， 其值越大， 說明基因所處位置越接近核心［7］． 通過此方法， 篩選出前10個最為核心的VUE基因．

1.2.6 核心VUE靶基因的分析

通過構建受試者工作特征（Receiver Operating Characteristic， ROC）曲線探討核心靶基因作為診斷VUE可能性大小的依據(jù)． 利用IBM SPSS Statistics 27.0軟件， 采用單因素邏輯回歸分析方法計算10個核心VUE靶基因表達與VUE風險之間的比值比（Odds Ratio， OR）和95%置信區(qū)間（Confidence Interval， CI）．

1.3 統(tǒng)計學處理

研究中的所有統(tǒng)計分析均由R軟件和IBM SPSS Statistics 27.0軟件執(zhí)行， 其中單因素邏輯回歸分析方法選擇“輸入”． 基因表達水平的組間比較采用t檢驗， 檢驗水準α=0.05， p＜0.05為具有統(tǒng)計學意義的閾值．

2 結果與分析

2.1 WGCNA篩選關鍵VUE基因

首先， 在構建無標度網絡和基因連接的過程中， 既要保證網絡接近無尺度分布， 又要保證網絡平均連通性不會太小， 本研究設置無標度區(qū)域值大于0.7， 最佳軟閾值為9（圖1a）． 隨后， 將相似基因進行合并， 共得到4種顏色模塊（圖1b）． 然后， 分析模塊與臨床性狀的相關性， 發(fā)現(xiàn)藍色模塊的相關性最強， 與VUE呈負相關（r=-0.72， p=2e-05）（圖1c）． 最后， 將藍色模塊按基因重要性（＞0.5）和基因與模塊相關性（＞0.8）篩選出關鍵模塊內的關鍵基因共1 685個（圖1d、 圖1e）．

2.2 差異分析篩選關鍵VUE基因

通過R對VUE數(shù)據(jù)集進行基因差異表達分析， 以p＜0.05和｜log2FC｜≥1為閾值獲得了257個DEGs， 在VUE數(shù)據(jù)集中的表達情況如熱圖和火山圖所示（圖2）， 其中有53個基因表達上調， 204個基因表達下調．

2.3 核心VUE基因篩選和分析

為了鑒定可能對VUE的發(fā)生發(fā)展產生關鍵作用的核心基因， 將WGCNA分析篩選出的1 685個VUE關鍵基因與差異表達分析篩選出的257個VUE關鍵基因繪制維恩圖， 發(fā)現(xiàn)206個交集基因（圖3a）， 本研究將其定義為核心VUE基因． 對其進行GO和KEGG分析， 發(fā)現(xiàn)這些核心VUE基因主要在跨膜受體蛋白絲氨酸/蘇氨酸的負調控、 細胞結構組織和細胞外基質結構成分等功能上富集（圖3b）， 而富集通路主要包括Hippo信號通路、 TGF-信號通路和Wnt信號通路等（圖3c）．

2.4 核心VUE靶基因篩選

為了探討206個核心VUE基因中發(fā)揮主要作用的靶基因， 利用PPI網絡構建方法進行VUE核心靶基因篩選． 首先根據(jù)STRING數(shù)據(jù)庫構建206個核心VUE基因的PPI網絡， 其中99個基因互相連接， 選擇其中有61個基因參與連接的網絡進行分析（圖4a）． 根據(jù)Cytoscape軟件中計算出的平均中介中心度值大小將基因排序， 可以看出MRPL13的平均中介中心度值最大， 說明其處于這些基因最核心的位置， 與其他基因間的關系最為緊密， 其次是FBN1，CCN2（又名CTGF），SLC2A10，SLIRP，CAV1等（圖4b）． 本研究選擇平均中介中心度值最大的前10個基因（MRPL13，F(xiàn)BN1，CTGF，SLC2A10，SLIRP，CAV1，WNT5A，VAMP7，PPP1CB，VBP1）， 將其定義為VUE核心靶基因．

圖中基因代碼由軟件生成， 無法顯示斜體．

2.5 VUE核心靶基因分析

在對核心VUE靶基因的表達情況進行分析時， 發(fā)現(xiàn)在GSE130856數(shù)據(jù)集中VUE患者相較于正常者這10個核心靶基因全部顯著下調（圖5a）． 通過受試者工作特征曲線（ROC）檢測這10個靶基因能否正確判斷VUE樣本和正常樣本， 計算結果顯示10個核心靶基因的曲線下面積（Area Under Curve， AUC）值均大于0.5（圖5b）， 說明篩選出的這10個核心靶基因均可作為區(qū)分VUE組和正常組的獨立因素． 為了探討這10個核心靶基因的表達情況與VUE風險之間的關系， 我們進行了單因素邏輯回歸分析（圖5c）， 共有9個基因（MRPL13，F(xiàn)BN1，CTGF，SLC2A10，CAV1，WNT5A，VAMP7，PPP1CB，VBP1）與VUE發(fā)生風險呈顯著的負相關關系， 即均可能為VUE的保護因素．

3 結論與討論

VUE是一種胎盤慢性炎癥性病變， 其發(fā)病特征是母體T細胞浸潤到絨毛膜組織中［11］． 已有研究報道確定了胎盤中VUE病變的存在與母胎耐受性下降、 胎兒宮內生長受限和流產等存在顯著關聯(lián)［3］． 關于VUE的發(fā)病原因， 有研究發(fā)現(xiàn)種族、 吸煙、 肥胖、 動脈高血壓和糖尿病等已被評估為VUE的可能誘發(fā)因素［12］． 此外， 根據(jù)目前的研究， VUE的發(fā)病機制可能主要通過影響T細胞趨化因子（CXCL9，CXCL10和CXCL11）及其受體（CXCR3）在 Hofbauer 細胞（胎兒來源的胎盤巨噬細胞）、 基質細胞和內皮細胞中的表達實現(xiàn)［13］； 也有研究者發(fā)現(xiàn)患有VUE的胎盤富含參與抗原呈遞的基因， 如II類主要組織相容性抗原（HLA-DM，-DO，-DP，-DQ，-DR）以及I類分子（HLA-B，-C，-G）的過表達［11］． 然而， 已有的研究證據(jù)對于確定VUE具體的發(fā)病機制還嚴重不足， 在VUE發(fā)生發(fā)展過程中起關鍵作用的基因仍未得到充分明確． 基于此， 本研究通過生物信息學方法， 對VUE發(fā)生發(fā)展可能的作用機制進行分析， 更重要的是對VUE特異性核心靶基因進行識別和篩選．

本研究通過WGCNA和基因差異表達分析， 識別出了257個關鍵的VUE特異性基因． 通過GO和KEGG分析， 發(fā)現(xiàn)這257個關鍵的VUE基因主要在跨膜受體蛋白絲氨酸/蘇氨酸的負調控、 細胞結構組織和細胞外基質結構成分等功能上富集， 而富集通路主要包括Hippo信號通路、 TGF信號通路和Wnt信號通路等． 根據(jù)其他研究報道， 發(fā)現(xiàn)跨膜受體蛋白絲氨酸/蘇氨酸的負調控、 Hippo信號通路、 TGF信號通路和Wnt信號通路均在多種惡性腫瘤中具有重要作用［14-15］． 本研究也支持了細胞因子細胞因子受體相互作用和細胞粘附分子的組成等功能在VUE發(fā)病過程中發(fā)揮一定作用的結論［16］． 由此可見， 我們篩選出的VUE核心基因在疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用的可能性很大． 然而， 大部分功能和通路尚未引起研究者們的關注． 因此， 本研究提出上述功能和通路調節(jié)異?？赡茉赩UE疾病中扮演著重要角色， 為今后關于VUE的機制研究提供了參考方向．

本研究通過PPI網絡進一步篩選得到10個更為核心的VUE特異性靶基因， 包括MRPL13，F(xiàn)BN1，CTGF，SLC2A10，SLIRP，CAV1，WNT5A，VAMP7，PPP1CB，VBP1． 其中， MRPL13在人類食管癌、 肺腺癌、 胃癌等多種惡性腫瘤中的重要作用已被證實［17-18］． FBN1與馬方綜合征具有緊密關系［19］． CTGF被發(fā)現(xiàn)參與了多囊卵巢綜合征的發(fā)生［20］． 研究發(fā)現(xiàn)SLC2A10，SLIRP，CAV1，WNT5A，VAMP7，PPP1CB，VBP1分別與動脈迂曲綜合征、 線粒體功能、 前列腺癌、 結腸癌、 細胞異常凋亡、 呼吸系統(tǒng)疾病和重度抑郁等疾病相關［21-23］． 根據(jù)以往的研究， FBN1，CTGF，CAV1，WNT5A，VAMP7在女性特異性疾?。ㄈ缛橄侔?子癇等）發(fā)生發(fā)展過程中起著一定的作用［24-25］， 然而還未發(fā)現(xiàn)這些具有重要功能的基因在VUE中起作用的報道． 本研究通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)SLC2A10，SLIRP，CAV1，WNT5A，VAMP7，PPP1CB，VBP1與VUE的發(fā)生發(fā)展密切相關， 提示這10個核心VUE基因可能通過影響Hippo信號通路、 TGF信號通路、 Wnt信號通路、 細胞因子細胞因子受體相互作用和細胞粘附分子的組成等功能對VUE疾病的發(fā)生風險產生影響， 為VUE的診斷及發(fā)病機制提供了新的研究方向．

本研究對10個VUE核心靶基因進行分析發(fā)現(xiàn)， 這10個核心靶基因在VUE組中表達水平均顯著下調． 通過ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)篩選出的這10個核心靶基因均可作為區(qū)分VUE組和正常組的獨立因素． 單因素邏輯回歸分析顯示MRPL13，F(xiàn)BN1，CTGF，SLC2A10，CAV1，WNT5A，VAMP7，PPP1CB，VBP1可能為VUE的保護因素， 提示我們在往后關于VUE的研究中應重點關注這些基因， 因為它們極有可能在VUE發(fā)生發(fā)展中有著不可忽視的作用．

本研究利用生物信息學分析方法發(fā)現(xiàn)了一些與VUE發(fā)生發(fā)展相關的機制及關鍵的靶基因， 為VUE的診斷和治療提供了一定的參考． 然而， 本研究也存在一定的局限性． ① 由于公開數(shù)據(jù)庫中VUE基因表達數(shù)據(jù)集較為稀缺， 本研究未在驗證過程中利用其他數(shù)據(jù)來進行功能驗證分析， 這可能會造成驗證結果的過擬合問題． 因此， 在以后的研究中應利用多個不同的VUE數(shù)據(jù)集對這些基因進行驗證． ② 本研究缺乏相關細胞、 動物和人群等實驗來對發(fā)現(xiàn)的結果進行驗證， 今后還需要更多的研究來深入探索這些關鍵基因與VUE發(fā)生發(fā)展的關系， 以及VUE發(fā)生發(fā)展的具體作用機制．

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責任編輯 夏娟