摘" " 要：黃瓜具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，為明確引起甘肅省黃瓜細(xì)菌性流膠病病原菌的種類，對(duì)采集自甘肅省白銀市具有典型流膠癥狀的樣本利用組織分離法進(jìn)行病原物的分離，并通過(guò)柯赫氏法則驗(yàn)證其致病性，再利用形態(tài)特征和分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，從發(fā)病的黃瓜莖稈中共得到4株分離物，分別命名為hxb 1，hxb 2，hxb 3和hxb 4。經(jīng)柯赫氏法則驗(yàn)證，hxb 1是引起黃瓜流膠病的病原菌，在NA培養(yǎng)基上菌落呈乳白色或半透明狀，圓形或近圓形，邊緣光滑，菌體大小為（0.253～0.511）μm×（0.783～2.290）μm，為短直桿狀，革蘭氏染色陰性。再利用16S rRNA和gyrB進(jìn)行基因序列分析，發(fā)現(xiàn)hxb 1均與熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）聚在一支，同源性均為100%，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征將菌株hxb 1鑒定為熒光假單胞菌。研究結(jié)果為黃瓜細(xì)菌性流膠病的診斷和綜合防治提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：黃瓜細(xì)菌性流膠??；病原菌；分離鑒定；熒光假單胞菌

中圖分類號(hào)：S642.2" " " " " " " " " " " " " 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A" " " " " " " " " " 文章編號(hào)：1673-2871（2024）07-036-06

Identification of cucumber bacterial gummosis pathogens in Baiyin city， Gansu province

CHEN Fei1， WANG Yidan2， MA Ting2， CAI Fengfeng2， JIN Mengjun2， ZHANG Cuiwen2， YANG Chengde2

（1. Seed Management Station of Xigu District， Lanzhou City， Lanzhou 730060， Gansu， China; 2. College of Plant Protection， Gansu Agricultural University/Bio-control Engineering Laboratory of Crop Diseases and Pests of Gansu Province， Lanzhou 730070， Gansu， China）

Abstract： In order to clarify the pathogen of cucumber bacterial gummosis in Gansu province， the samples collected from Baiyin city with typical gummosis symptoms were isolated by tissue separation method， and the pathogenicity was verified by Koch 's postulate. Then morphological characteristics and molecular biology methods were used for identification. The results showed that four isolates were obtained from the diseased cucumber stems， named hxb 1， hxb 2， hxb 3 and hxb 4， respectively. It was verified by Koch 's postulate that hxb 1 was the pathogen causing cucumber gummosis， and its colonies on NA medium were milky white or translucent， round or nearly round， with smooth edges. The cell size was（0.253-0.511）μm×（0.783-2.290）μm， which was short straight rod and gram-negative. Using 16S rRNA and gyrB genes sequence analysis， it was found that hxb 1 was clustered with Pseudomonas fluorescens， and the homology was 100%. Combined with morphological characteristics， the strain hxb1 was identified as Pseudomonas fluorescens. The research results provide a theoretical basis for the diagnosis and comprehensive prevention of cucumber bacterial gummosis.

Key words： Cucumber bacterial gummosis; Pathogenic bacteria; Identification; Pseudomonas fluorescens

黃瓜（Cucumis sativus）是葫蘆科黃瓜屬一年生草本植物，富含蛋白質(zhì)、胡蘿卜素、維生素、葡萄糖等營(yíng)養(yǎng)成分，具有抗衰老、利水消腫和清熱止咳的作用[1]，是我國(guó)主要的經(jīng)濟(jì)作物之一，在全國(guó)各地均有栽培。隨著我國(guó)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整以及現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技的迅速發(fā)展，冬季設(shè)施黃瓜生產(chǎn)面積逐年增加，以塑料大棚和日光溫室為主的設(shè)施栽培已逐步成為黃瓜的主要生產(chǎn)方式。然而，隨著黃瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，連作現(xiàn)象普遍發(fā)生，導(dǎo)致大棚土壤酸化嚴(yán)重和微生物結(jié)構(gòu)被破壞[2]，且設(shè)施生產(chǎn)中的高溫、高濕特點(diǎn)為病原菌的侵染和傳播提供了適宜的條件，病蟲害的發(fā)生頻率有所升高[3]。

黃瓜細(xì)菌性流膠病是近年來(lái)在黃瓜上比較常見且危害較重的病害，主要癥狀為在發(fā)病果實(shí)表面、莖稈、葉片背面產(chǎn)生流膠現(xiàn)象，嚴(yán)重時(shí)莖稈縱向開裂并腐爛，導(dǎo)致植株死亡，因此又被稱為“黃瓜細(xì)菌性莖軟腐病”。該病在黃瓜的整個(gè)生育期及各個(gè)器官均可發(fā)生，發(fā)病初期莖稈呈水漬狀，濕度大時(shí)會(huì)溢出大量白色菌膿，隨著病情發(fā)展，莖稈縱向開裂、軟腐，嚴(yán)重時(shí)整株死亡；發(fā)病果實(shí)表面看起來(lái)正常，但內(nèi)部已開裂、腐爛或者褐變；葉片從邊緣或者中心發(fā)病，出現(xiàn)不規(guī)則水漬狀淡黃色病斑，最后會(huì)導(dǎo)致葉片腐爛[4]。該病害近幾年在全國(guó)各地大面積暴發(fā)，尤其在冬季黃瓜設(shè)施栽培中極易發(fā)生和流行，病害嚴(yán)重的棚室會(huì)導(dǎo)致30%以上的減產(chǎn)，甚至絕收，對(duì)黃瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生了巨大影響[5]。據(jù)報(bào)道引起黃瓜細(xì)菌性流膠病的病原菌有胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西變種（Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliense，簡(jiǎn)稱Pcb）[6]、丁香假單胞流淚致病變種（Pseudomonas syringae pv. lachrymans，簡(jiǎn)稱Psl）[7]和熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens，簡(jiǎn)稱P. fluorescens）[8]，也有研究認(rèn)為Pcb和Psl共同侵染導(dǎo)致流膠病發(fā)生[9]。目前甘肅省白銀市黃瓜流膠病的病原菌未見報(bào)道。因此，筆者從白銀市大棚中采集典型癥狀標(biāo)本，并帶回室內(nèi)進(jìn)行病原菌分離、致病性測(cè)定及鑒定，以期為黃瓜流膠病的診斷和綜合防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試樣本

于2020年12月在甘肅省白銀市靖遠(yuǎn)縣東灣鎮(zhèn)種植大棚內(nèi)采集到具有典型細(xì)菌性病害癥狀的黃瓜樣本，拍照并帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行鑒定。

1.2 供試培養(yǎng)基

NA培養(yǎng)基：瓊脂18 g，蛋白胨6 g，牛肉膏3 g，葡萄糖8 g，蒸餾水定容至1000 mL；NA液體培養(yǎng)基：蛋白胨6 g，牛肉膏3 g，葡萄糖8 g，蒸餾水定容至1000 mL；KB培養(yǎng)基：蛋白胨20 g，甘油10 mL，K2HPO4 1.5 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，蒸餾水定容至1000 mL。

1.3 病原分離

通過(guò)組織分離法從發(fā)病黃瓜莖稈中分離病原物[10]。用無(wú)菌水清洗黃瓜病莖，用滅菌的剪刀將病健交界處剪成5 mm×5 mm大小的組織，使用75%乙醇浸泡30 s進(jìn)行消毒。將消毒后的樣品用無(wú)菌水沖洗3次。吸干表面水分后置于滅菌研缽中，加入1 mL無(wú)菌水后進(jìn)行研磨。將研磨后的組織液靜置5 min，吸取上清液1 mL于NA固體培養(yǎng)基上，用滅菌涂布器涂抹均勻。將接種后的平板于28 ℃培養(yǎng)箱中黑暗條件下培養(yǎng)48 h，待其長(zhǎng)出單菌落后，用平板劃線法純化出大小、形態(tài)和顏色一致的單菌落轉(zhuǎn)接到試管中并編號(hào)，儲(chǔ)存在4 ℃的冰箱中備用[11]。

1.4 致病性測(cè)定

以黃瓜品種津研1號(hào)為試驗(yàn)材料，進(jìn)行致病性測(cè)定，種子購(gòu)買于當(dāng)?shù)胤N子市場(chǎng)。當(dāng)黃瓜幼苗長(zhǎng)至30 d左右時(shí)，將分離物轉(zhuǎn)移到NA培養(yǎng)基上活化，于28 ℃黑暗培養(yǎng)48 h，用接菌環(huán)挑取10個(gè)單菌落至100 mL NA液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、180 r·min-1搖床中振蕩培養(yǎng)24 h左右，直至OD值約為0.8。

用75%的乙醇擦拭用于接種病原的黃瓜莖稈，然后用滅菌的昆蟲針輕輕針刺，用無(wú)菌棉花蘸取適量菌液均勻涂抹在刺傷的莖稈上，每個(gè)處理6次重復(fù)。將接種后的黃瓜幼苗在室溫下保濕培養(yǎng)24～36 h后，連續(xù)觀察和記錄莖稈上的病害發(fā)生情況，用接種NA培養(yǎng)基的健康植株作為對(duì)照。

1.5 形態(tài)學(xué)鑒定

將病原菌接種到NA培養(yǎng)基上，28 ℃黑暗培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)，記錄并拍照。然后對(duì)菌落進(jìn)行革蘭氏染色，用100×光學(xué)顯微鏡觀察病原菌的形態(tài)，并隨機(jī)選取100個(gè)菌體測(cè)量大小[12]。

1.6 熒光反應(yīng)測(cè)定

將病原菌接種于KB培養(yǎng)基黑暗培養(yǎng)48 h后，在紫外燈下觀察菌落在KB培養(yǎng)基上熒光的發(fā)生情況。

1.7 分子生物學(xué)鑒定

用接菌環(huán)挑取10個(gè)單菌落于100 mL NA液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、180 r·min-1搖床中振蕩培養(yǎng)24～36 h，至OD值為0.6～0.8，然后用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取病原菌的DNA。使用通用引物 16S rRNA（27F： 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'/1492R： 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）[13]和特異性引物gyrB（UP-1： 5'-TGCGGTCAACCAGGTGTTCC-3'/UP-2r： 5'-CGAGATAATCGCGGTCAGG-3'）[14]進(jìn)行PCR擴(kuò)增（引物合成由西安擎科生物有限公司完成）。

16S rRNA的反應(yīng)體系為25 μL： 12.5 μL Mix（2×），1 μL模板DNA，27F和1492R（10 μmol·L-1）各1 μL， 9.5 μL ddH2O。gyrB的反應(yīng)體系為25 μL：12.5 μL Mix（2×）， 1 μL模板DNA，UP-1和UP-2r（10 μmol·L-1）各1 μL，9.5 μL ddH2O。

16S rRNA的擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min；48 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min；40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 1 min；4 ℃保存。gyrB的擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s；60 ℃ 30 s；72 ℃ 1 min；35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 2 min；4 ℃保存。

用0.1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，將帶有明顯條帶的PCR產(chǎn)物送至蘭州天啟基因生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。再利用BLAST將測(cè)得的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的序列進(jìn)行同源性比對(duì)，然后用MEGA7.0采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（bookstrap值為1000），進(jìn)一步明確病原菌的分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間癥狀

發(fā)病癥狀在黃瓜莖稈和葉片上均有表現(xiàn)，其中，在莖稈上的病害最為嚴(yán)重。發(fā)病老莖出現(xiàn)黃褐色斑塊（圖1-A）；新莖稈表面呈水浸狀，濕度大時(shí)有淺黃色的膠狀物溢出；嚴(yán)重時(shí)，部分莖桿縱向開裂軟腐（圖1-B）；發(fā)病葉片出現(xiàn)不規(guī)則形的淡黃色病斑，部分病斑穿孔（圖1-C）；發(fā)病后期整株萎蔫。

2.2 病原菌分離及致病性測(cè)定

將具有黃瓜細(xì)菌性流膠病典型癥狀的莖稈帶到實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)分離得到4株分離物，命名為hxb1、hxb 2、hxb 3和hxb 4。通過(guò)柯赫氏法則驗(yàn)證，hxb 1具有致病性。在接種hxb 1的第3 天，黃瓜莖部出現(xiàn)棕色潰瘍（圖2-A2），并沿莖稈縱向擴(kuò)展形成不規(guī)則病斑；潮濕時(shí)莖稈呈水漬狀，并逐漸發(fā)生濕腐（圖2-B2），伴有輕微開裂（圖2-C2）。而在接種的第7天 ，病斑連成片，使得黃瓜莖稈腐爛并變成深褐色（圖2-A3，B3和C3）。與田間癥狀相似，而對(duì)照未表現(xiàn)出癥狀（圖2-A1，B1和C1）。將發(fā)病部位再次分離，得到菌株hxb 1，表明分離物hxb 1為黃瓜細(xì)菌性流膠病的病原菌。

2.3 形態(tài)學(xué)鑒定

采用平板劃線法將病原菌hxb 1接種到NA固體培養(yǎng)基上，28 ℃黑暗培養(yǎng)48 h。菌落較小，圓形或近圓形，呈乳白色或半透明狀，邊緣光滑，中間輕微隆起（圖3-A～B）。挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，發(fā)現(xiàn)為短直桿或微彎桿狀，兩端鈍圓，呈陰性（圖3-C）。菌體大小為（0.253～0.511）μm×（0.783～2.290）μm，平均大小為1.261 μm×0.338 μm。

2.4 熒光反應(yīng)結(jié)果

將菌株hxb1接種于KB培養(yǎng)基黑暗培養(yǎng)48 h后，在培養(yǎng)基上產(chǎn)生黃綠色色素沉著（圖4-A），紫外燈下能明顯觀察到熒光（圖4-B），在空白培養(yǎng)基上觀察不到熒光反應(yīng)（圖4-C）。

2.5 16S rRNA和gyrB基因序列分析

以菌株hxb 1的總DNA為模板，采用16S rRNA和gyrB基因序列引物進(jìn)行擴(kuò)增后，再用0.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，分別得到大小為1435 bp和1199 bp的擴(kuò)增片段。將所得16S rRNA擴(kuò)增序列與Gene Bank中的序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，菌株hxb 1與熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）的同源性較高。為了進(jìn)一步確定該試驗(yàn)結(jié)果，選用gyrB特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將其擴(kuò)增序列提交至Gene Bank基因庫(kù)中進(jìn)行序列比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，菌株hxb 1與P. fluorescens聚為一支（圖5），并且菌株hxb 1的16S rRNA和gyrB序列與P. fluorescens同源性均達(dá)到100%。因此，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征將菌株hxb1鑒定為熒光假單胞菌（P. fluorescens）。

3 討論與結(jié)論

黃瓜在生長(zhǎng)過(guò)程中容易受到多種病原菌侵染，其中細(xì)菌性流膠病是黃瓜病害中比較嚴(yán)重的一種。近幾年在我國(guó)河北、河南、遼寧、陜西、山東和山西等多個(gè)省份均有黃瓜細(xì)菌性流膠病的報(bào)道[15-16]，發(fā)病率為23.88%～71.75%[17]，且在北方溫室黃瓜栽培中的危害性逐年加重。黃瓜植株的果實(shí)、莖稈和葉片都有被侵染的可能，后期果實(shí)腐爛，植株死亡。該病害一旦發(fā)生，就會(huì)導(dǎo)致黃瓜大幅度減產(chǎn)，嚴(yán)重時(shí)甚至絕收。

李煥玲[18]采用形態(tài)學(xué)、致病性和分子生物學(xué)鑒定相結(jié)合的方法，發(fā)現(xiàn)胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西變種（Pcb）是引起河北和山東黃瓜細(xì)菌性莖軟腐病的病原菌。王瑩瑩等[19]通過(guò)病原鑒定發(fā)現(xiàn)，天津與河北4個(gè)地區(qū)黃瓜細(xì)菌性莖軟腐病在葉片的發(fā)病癥狀有兩種類型，病原菌為丁香假單胞流淚致病變種（Psl）。孟祥龍[15]對(duì)山東、河北、山西、北京、河南和遼寧6個(gè)省市黃瓜細(xì)菌性流膠病進(jìn)行病害調(diào)查，明確病原菌為胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西變種（Pcb）和丁香假單胞流淚致病變種（Psl），其中Psl為主要病原菌。熊凱琳等[8]對(duì)山東濟(jì)南的36份黃瓜細(xì)菌性莖軟腐病典型發(fā)病植株進(jìn)行病原菌分離鑒定，結(jié)果表明，熒光假單胞菌為引起山東黃瓜細(xì)菌性莖軟腐病的病原菌。張勝平[7]從河北邯鄲黃瓜流膠病癥較明顯的莖部流膠中分離出1株細(xì)菌，經(jīng)鑒定其為Psl。曾蓉等[6]在上海設(shè)施栽培黃瓜上發(fā)現(xiàn)，Pcb能引起黃瓜莖部腐爛，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致莖稈流膠。本研究結(jié)果表明，甘肅省白銀市黃瓜流膠病由熒光假單胞菌引起，與熊凱琳等[8]的報(bào)道一致。也有報(bào)道熒光假單胞菌可以引起獼猴桃潰瘍病[20]、三七根腐病[21]、甜瓜莖腐爛病[22]和當(dāng)歸“水爛病”[23]，也是紫甘藍(lán)鮮切菜中主要的腐敗菌[24]。

根據(jù)熒光假單胞菌（P. fluorescens）在KB培養(yǎng)基上產(chǎn)生的熒光色素情況，可將假單胞菌分為熒光假單胞組和非熒光假單胞組，熒光假單胞菌為熒光假單胞菌組中代表性種。在本試驗(yàn)中，hxb 1菌株培養(yǎng)后產(chǎn)生了黃綠色可溶性色素，并在紫外燈下發(fā)出藍(lán)綠色熒光。熒光假單胞菌是植物根際促生菌的重要類群之一，直接促進(jìn)植物生長(zhǎng)[25]，還具有生防效果，可以分泌酚類抗生素，抵抗部分病菌的侵害[26]，在水稻、甘薯、棉花、甜菜、花生、煙草和番茄等作物上都有防病增產(chǎn)的效果[27]。該菌還會(huì)導(dǎo)致人或動(dòng)物發(fā)病，例如在低溫儲(chǔ)存的血液及血制品中繁殖，并且釋放內(nèi)毒素，引起休克[28]；還可以引發(fā)致死率達(dá)100%的錦鯉赤皮病[29]。

綜上所述，筆者通過(guò)對(duì)病原物的分離和鑒定、致病性測(cè)定，確定了引起甘肅省白銀市黃瓜細(xì)菌性流膠病的病原菌為熒光假單胞菌（P. fluorescens），研究結(jié)果為該病害的診斷和綜合防治奠定了基礎(chǔ)。

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收稿日期：2023-12-14；修回日期：2024-03-15

基金項(xiàng)目：甘肅省瓜菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（GARS-GC-2）

作者簡(jiǎn)介：陳" " 斐，女，農(nóng)藝師，主要從事植物新品種引進(jìn)及植物病理學(xué)研究。E-mail：119273976@qq.com

通信作者：楊成德，男，教授，主要從事植物病理學(xué)研究。E-mail：yangcd@gsau.edu.cn