摘 要：野生動(dòng)物食性研究是掌握動(dòng)物生境需求的核心內(nèi)容，對(duì)野生動(dòng)物的保護(hù)和管理具有重要意義。在我國(guó)遼東灣斑海豹（Phoca largha）傳統(tǒng)繁殖地和盤錦棲息地海域采集其糞便，選用12S rRNA作為分子標(biāo)記進(jìn)行糞便DNA擴(kuò)增，利用高通量測(cè)序鑒定其食物組成。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在斑海豹糞便中共鑒定出魚(yú)類16種，隸屬5目8科13屬。食物組成的相對(duì)豐度顯示：梭魚(yú)（Liza haematocheilus）為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的餌料食物（40. 72%），其次為鰕虎科（Gobiidae）種類（23. 18%）。屬水平不同采樣群體的相對(duì)豐度顯示：2021年、2023年遼東灣北部冰區(qū)和2023年盤錦遼河口棲息地排在前3位的種類分別是梭屬（Liza）31. 91%、矛尾鰕虎屬（Chaeturichthys）14. 06%和縞鰕虎屬（Tri?dentiger）8. 39%，梭屬42. 37%、復(fù)鰕虎屬（Acanthogobius）14. 06% 和矛尾鰕虎屬11. 17%，及梭屬47. 93%、矛尾鰕虎屬13. 93%和綿鳚屬（Zoarces）12. 18%，分別合計(jì)占斑海豹3個(gè)群體食物組成相對(duì)豐度的54. 36%、67. 60%和74. 04%。研究結(jié)果與遼東灣北部的漁業(yè)資源優(yōu)勢(shì)物種一致，表明斑海豹為廣食性物種，其食物組成主要取決于棲息海域、季節(jié)及主要獵物種類的豐度。

關(guān)鍵詞：斑海豹；DNA宏條形碼；12S rRNA；食性分析；繁育期

中圖分類號(hào)：Q958.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：2310 - 1490（2024）- 03 - 0498 - 06

DOI：10.12375/ysdwxb.20240305

野生動(dòng)物食性研究是掌握動(dòng)物生境需求的核心內(nèi)容，這對(duì)加強(qiáng)野生動(dòng)物的保護(hù)和管理有非常重要的意義［1］。傳統(tǒng)的食性分析方法如直接觀察法、利用法、胃容物分析法和糞便顯微鑒定法等，以及現(xiàn)代的食性分析方法如穩(wěn)定同位素技術(shù)法、脂肪酸法等均各有利弊，一些涉及解剖或?qū)?dòng)物造成傷害的操作可能會(huì)對(duì)動(dòng)物個(gè)體造成損傷，破壞野生動(dòng)物資源，不利于野生動(dòng)物保護(hù)［2?3］。隨著現(xiàn)代高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，DNA宏條形碼技術(shù)成為現(xiàn)代食性研究的一種重要方法，該技術(shù)基于二代測(cè)序技術(shù)獲得生物特異性基因識(shí)別DNA 條形碼序列，通過(guò)對(duì)糞便［4?5］、胃容物［6］等樣本測(cè)序，借助已有數(shù)據(jù)庫(kù)序列比對(duì)，實(shí)現(xiàn)食物種類的分類鑒定；該技術(shù)還可通過(guò)比較所得物種糞便序列的相對(duì)豐度來(lái)定量描述該物種的食物組成，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)食性研究的定性及定量分析，尤其適用于野生保護(hù)動(dòng)物的食性研究［7?8］。

斑海豹（Phoca largha）屬國(guó)家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物，在我國(guó)主要分布于渤海和黃海海域，偶見(jiàn)于東海和南海，是渤海和黃海海洋生態(tài)系統(tǒng)的旗艦物種。斑海豹是唯一能在中國(guó)海域進(jìn)行繁殖的鰭足類海洋哺乳動(dòng)物，渤海遼東灣結(jié)冰區(qū)是世界上斑海豹8個(gè)繁殖區(qū)中最南端的一個(gè)［9］。每年11月以后，斑海豹陸續(xù)進(jìn)入渤海的遼東灣繁育后代，翌年5月上中旬后陸續(xù)離開(kāi)渤海。目前分布于我國(guó)海域的斑海豹群體數(shù)量?jī)H約2 000頭，因而受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的普遍重視［9?10］。在寒冷的冬春季節(jié)，渤海漁業(yè)資源較匱乏，在此繁育和棲息的斑海豹攝取食物的種類是科研工作者關(guān)注的重點(diǎn)之一。然而目前關(guān)于野外斑海豹的食物來(lái)源報(bào)道僅見(jiàn)胃容物法和同位素法的研究結(jié)果，且研究時(shí)間和海域并未完全覆蓋斑海豹在我國(guó)海域分布的冬春季節(jié)［11?13］。利用DNA宏條形碼技術(shù)分析野外斑海豹食性的研究尚無(wú)報(bào)道。本研究首次利用DNA宏條形碼技術(shù)對(duì)遼東灣北部冰區(qū)和盤錦遼河口棲息海域的繁育期斑海豹的糞便樣本進(jìn)行采集與分析，提取DNA后選用12S rRNA為分子標(biāo)記分析斑海豹的食物組成及攝食選擇性，解析DNA宏條形碼技術(shù)在其食性研究中的應(yīng)用潛能，為斑海豹保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)，也為其他野生瀕危保護(hù)物種的攝食研究提供借鑒。

1 材料與方法

1. 1 樣品采集

2021年1月13日和2023年2月6日在遼東灣北部冰區(qū)采集斑海豹糞便各20份。2023年3月26日和4月6日在斑海豹重要棲息地——盤錦遼河口海域分別采集斑海豹糞便7份和20份。用一次性PE手套拾取單個(gè)糞便樣品分別裝入5 mL的無(wú)菌凍存管中，在低溫保溫箱中保存運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，超低溫冰箱中-80 ℃保存?zhèn)溆谩＞唧w采樣信息見(jiàn)表1。

1. 2 DNA 提取、PCR 擴(kuò)增及測(cè)序

采用常規(guī)酚氯仿法提取新鮮糞便的總DNA，溶于TE緩沖液中，-40 ℃保存?zhèn)溆谩NA濃度和質(zhì)量使用NanoDrop 2000核酸蛋白分析儀測(cè)量，經(jīng)檢驗(yàn)合格后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用線粒體12S rRNA（魚(yú)類）通用引物對(duì)總DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。引物序列為：MiFish-U-F： 5′-GTCGGTAAAACTCGTGCCAGC-3′，MiFish-U-R： 5′-CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG-3′［14］。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為50. 0 μL，包括總DNA2. 0 μL（200 ng），rTaq DNA聚合酶1. 0 μL（5 U/μL），dNTPs 4. 0 μL（各2. 5 mmol/L），上、下游引物各2. 0 μL，10×PCR buffer 5. 0 μL，雙蒸水34. 0 μL。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?8 ℃預(yù)變性1 min；98 ℃變性10 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1. 5% 瓊脂糖凝膠電泳純化后選擇主帶大小約200 bp的序列，割膠回收目的條帶。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物建庫(kù)檢測(cè)，合格的文庫(kù)送上海派森諾生物科技股份有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。

1. 3 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Illumina PE250 測(cè)序平臺(tái)，采用雙端測(cè)序法，得到下機(jī)數(shù)據(jù)，去除引物接頭序列，根據(jù)PEreads之間的重疊關(guān)系，將成對(duì)的讀長(zhǎng)拼接成一條序列，然后按照標(biāo)簽序列識(shí)別并區(qū)分樣品得到各樣本數(shù)據(jù)，最后經(jīng)質(zhì)控、過(guò)濾和拼接得到有效數(shù)據(jù)。

通過(guò)Excel統(tǒng)計(jì)分析OTUs在種、屬分類水平下的相對(duì)豐度；選取OTUs相對(duì)豐度值最高的種類與美國(guó)NCBI NT（https：//www. ncbi. nlm. nih. gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，進(jìn)行物種注釋并人工校對(duì)，篩選出序列的最佳比對(duì)結(jié)果。序列的物種鑒定原則：12S rDNA序列在相同的基因序列區(qū)域內(nèi)，當(dāng)覆蓋度（coverage）不低于95. 0%且一致度達(dá)到99. 5%及以上時(shí)，判定樣品來(lái)自匹配序列對(duì)應(yīng)的物種；最高一致度lt;99. 5% 且≥95. 0%，一致度最高序列僅有1條，且與得分次之的序列一致度差距≥2%時(shí)，記為一致度最高序列的上一級(jí)分類單元，最高一致度對(duì)應(yīng)有多個(gè)物種時(shí)，則記為能夠涵蓋所有一致度最高的當(dāng)?shù)匚锓N的最低分類單元［4，15］。通過(guò)OTU分析鑒定糞便中主要獵物物種的分類和不同物種的相對(duì)豐度。

2 結(jié)果與分析

2. 1 分類地位鑒定

糞便樣本共獲得原始序列9 055 417條，剔除斑海豹的自身序列以及豐度較低的序列后，共獲得有效序列692 167 條。按照97% 相似性聚類后得到390條OTU代表序列，注釋得到16種餌料生物，分屬于5目8科13屬（表2）。

2. 2 食物組成

斑海豹糞便中食物組成的相對(duì)豐度顯示，梭魚(yú)（Liza haematocheilus）為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的餌料食物，相對(duì)豐度為40. 72%；其次為鰕虎科（Gobiidae）的種類，包含5個(gè)屬（表2），占相對(duì)豐度的23. 18%。從屬水平不同群體的平均相對(duì)讀長(zhǎng)豐度看，2021年遼東灣北部冰區(qū)群體（BQ_21）、2023年遼東灣北部冰區(qū)群體（BQ_23）和2023年盤錦遼河口棲息地群體（LH_23）排在前3位的食物種類分別是梭屬31. 91%、矛尾鰕虎屬（Chaeturichthys）14. 06% 和縞鰕虎屬（Triden?tiger）8. 39%，梭屬42. 37%、復(fù)鰕虎屬（Acan?thogobius）14. 06% 和矛尾鰕虎屬11. 17%，及梭屬47. 93%、矛尾鰕虎屬13. 93% 和綿鳚屬（Zoarces）12. 18%；分別合計(jì)占斑海豹3個(gè)群體食物組成相對(duì)豐度的54. 36%、67. 60%和74. 04%（圖1）。研究結(jié)果表明，DNA宏條形碼技術(shù)在獲取食物種類信息和食物豐度分析上應(yīng)用的可行性，證明了DNA宏條形碼技術(shù)在動(dòng)物食性研究中具有較高的應(yīng)用潛能。

3 討論

近年來(lái)，DNA宏條形碼技術(shù)憑借明顯的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，在野生動(dòng)物的食性研究中得到較廣泛應(yīng)用［2，16］。邵昕寧等［4］利用宏條形碼技術(shù)從不同糞便樣本中分析出我國(guó)西南山地四川甘孜藏族自治州的7種食肉動(dòng)物的食性組成，包括棕熊（Ursus arctos）、豹（Pan?thera pardus）、雪豹（P. uncia）、豹貓（Prionailurus ben?galensis）、狼（Canis lupus）、狗以及赤狐（Vulpesvulpes）。金森龍等［5］基于DNA宏條形碼技術(shù)在臥龍國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)食肉動(dòng)物的食性分析中發(fā)現(xiàn)赤狐的食物主要來(lái)自3個(gè)目，豹貓的食物來(lái)自5個(gè)目，初步弄清了臥龍保護(hù)區(qū)內(nèi)野生食肉動(dòng)物的食物組成。宮爽等［7］利用DNA宏條形碼技術(shù)獲得我國(guó)東北地區(qū)野豬（Sus scrofa）食物組成，包含60屬植物，比例大于4%的主要食物有6個(gè)屬。滕揚(yáng)等［8］通過(guò)DNA宏條形碼技術(shù)在豹貓食物構(gòu)成分析中，鑒別出來(lái)自10目22科的36種獵物，表明北京市4個(gè)保護(hù)區(qū)的豹貓食性具有顯著差異，發(fā)現(xiàn)基于DNA宏條形碼技術(shù)鑒定出動(dòng)物性獵物種類較為齊全。本研究從不同糞便樣本中分析出我國(guó)遼東灣斑海豹的食物主要來(lái)自13個(gè)屬；同時(shí)，在斑海豹糞便中鑒定出兩個(gè)相對(duì)低豐度的淡水種類：鯉（Cyprinus carpio）和北鰍（Lefua costata），分別占相對(duì)豐度的0. 13%和0. 05%，但查找其取樣群體發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)淡水種類僅出現(xiàn)在盤錦遼河口棲息地的群體中，分析這可能是斑海豹到遼河口附近取食的原因。

盡管DNA宏條形碼技術(shù)因其明顯的優(yōu)勢(shì)在動(dòng)物食性研究領(lǐng)域得到應(yīng)用，但也存在一些不足，即在PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，效率高的模板很可能會(huì)對(duì)效率低的產(chǎn)生抑制作用，導(dǎo)致在PCR擴(kuò)增中受到抑制的食物類群被低估甚至無(wú)法被鑒別［17］。田甲申等［12］利用同位素方法研究發(fā)現(xiàn)野外斑海豹的食物來(lái)源以魚(yú)類為主，同時(shí)也攝食一些頭足類和蝦類。但本研究使用無(wú)脊椎動(dòng)物COI通用引物（LCO1490/HCO2198）及宏條形碼引物（mlCOIintF/jgHCO2198R）對(duì)糞便樣品進(jìn)行分析后，擴(kuò)增出大量無(wú)效序列、污染序列，未發(fā)現(xiàn)頭足類和蝦類的序列。但隨著DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷完善和更為適宜的分子標(biāo)記的優(yōu)化和被發(fā)現(xiàn)，DNA宏條形碼技術(shù)的檢出準(zhǔn)確度將會(huì)大幅提高［18］。未來(lái)，DNA宏條形碼技術(shù)聯(lián)合其他技術(shù)手段，將為野生動(dòng)物食性分析的應(yīng)用開(kāi)啟更廣闊的空間［17］。

關(guān)于野外斑海豹的食性研究國(guó)內(nèi)外學(xué)者開(kāi)展了一些工作，Bukhtiyarov等［19］利用胃容物方法研究發(fā)現(xiàn)斑海豹食物的多樣性以及食物的地域和季節(jié)差異與其主要獵物種類的季節(jié)分布和豐度有關(guān)，斑海豹的食物存在區(qū)域差異性；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，斑海豹食物以魚(yú)類為主，無(wú)脊椎動(dòng)物獵物在其食物中被發(fā)現(xiàn)的頻率很低。Bukhtiyarov等［19］在春季白令海北部的斑海豹胃中發(fā)現(xiàn)魚(yú)類占比超過(guò)95. 0%，俄羅斯阿納迪厄海灣斑海豹胃中魚(yú)類占比超過(guò)52. 2%；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，斑海豹對(duì)食物的選擇也與年齡有關(guān)，1～4齡主要捕食魚(yú)、體型較大的蝦類，偶爾也捕食頭足類，而4齡以上主要捕食魚(yú)類。Bukhtiyarov等［19］發(fā)現(xiàn)在白令海北部，斑海豹主要捕食北極鱈（Boreogadus saida）；在白令海中部、鄂霍茨克海，主要捕食黃線狹鱈（Theragrachalcogramma）；在白令海東南部，主要捕食毛鱗魚(yú)（Mallotus villosus）；在楚科奇海東南部，主要捕食鯡魚(yú)（Clupea pallasii）；在日本海、阿拉斯加的近海等地，捕食鱈、鮭等魚(yú)類。王者茂等［11］研究發(fā)現(xiàn)在黃、渤海海域斑海豹春季捕食鯡魚(yú)、太平洋玉筋魚(yú)（Am?modytes personatus）和小黃魚(yú)（Larimichthys polyactis）等，秋冬季節(jié)則多以梭魚(yú)為食。劉修澤等［20］在遼東灣北部海域魚(yú)類群落結(jié)構(gòu)及多樣性研究中，指出遼東灣北部冬春季節(jié)魚(yú)類資源以梭魚(yú)、鰕虎魚(yú)為主。因此，本研究結(jié)果與上述研究相似，為在繁育季節(jié)加強(qiáng)對(duì)斑海豹的保護(hù)和漁業(yè)資源養(yǎng)護(hù)提供了科學(xué)管理依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究利用糞便DNA宏條形碼技術(shù)對(duì)繁育季節(jié)遼東灣斑海豹的食性進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，斑海豹糞便中共鑒定出魚(yú)類16種，隸屬5目8科13屬。根據(jù)食物組成的相對(duì)豐度，梭魚(yú)為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的餌料食物，相對(duì)豐度為40. 72%，其次為鰕虎科的種類，相對(duì)豐度為23. 18%。研究結(jié)果與遼東灣北部的漁業(yè)資源優(yōu)勢(shì)物種相一致，表明我國(guó)遼東灣斑海豹為廣食性物種，其食物組成主要取決于棲息海域、季節(jié)及主要獵物種類的豐度。遼東灣斑海豹在冬春繁育季節(jié)以梭魚(yú)、鰕虎魚(yú)等為食，本研究對(duì)掌握野生動(dòng)物生境需求、加強(qiáng)野生動(dòng)物的管理和保護(hù)有著非常重要的意義。

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