摘 要：以青藏高原特有兩棲動(dòng)物高山倭蛙（Nanorana parkeri）為研究對(duì)象，通過(guò)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)熱馴化處理（26 ℃，以16 ℃為對(duì)照；2周），探究長(zhǎng)期熱馴化對(duì)其體內(nèi)氧化應(yīng)激水平和抗氧化防御系統(tǒng)的影響。結(jié)果顯示：熱馴化導(dǎo)致高山倭蛙骨骼肌中氧化型谷胱甘肽含量顯著升高（t=1. 4，df=10，plt;0. 001），肝臟和骨骼肌中氧化型與還原型谷胱甘肽比值顯著上升，表明其體內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高；組織中超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性發(fā)生了特異性增加；肝臟丙二醛含量明顯下降，骨骼肌丙二醛含量沒(méi)有明顯變化，表明熱馴化并未導(dǎo)致氧化損傷指標(biāo)增加，這得益于體內(nèi)完善的抗氧化防御系統(tǒng)。研究結(jié)果有助于闡明全球氣候變暖對(duì)青藏高原兩棲動(dòng)物的影響。

關(guān)鍵詞：高山倭蛙；氧化應(yīng)激；抗氧化防御系統(tǒng)；熱馴化

中圖分類號(hào)：Q494

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：2310 - 1490（2024）- 03 - 0588 - 08

DOI：10.12375/ysdwxb.20240315

全球氣候變暖已是不爭(zhēng)的事實(shí)，嚴(yán)重威脅全球生物安全和生物多樣性［1］。據(jù)預(yù)測(cè)，到21世紀(jì)末，全球平均氣溫將上升4 ℃，極端天氣事件將加劇，如更強(qiáng)烈、更頻繁的熱浪和干旱［2］。變溫動(dòng)物的體溫隨外界環(huán)境變化而變化，缺乏生理性體溫調(diào)節(jié)能力，因此熱脅迫是未來(lái)變溫脊椎動(dòng)物面臨的巨大挑戰(zhàn)之一［3?4］。近年來(lái)，大量的研究已經(jīng)證實(shí)兩棲動(dòng)物在目前的氣候危機(jī)中會(huì)有很高的生存風(fēng)險(xiǎn)，大規(guī)模的氣候變暖導(dǎo)致兩棲動(dòng)物減少甚至滅絕［5?6］，可能的原因是氣候變暖會(huì)干擾兩棲動(dòng)物的代謝過(guò)程，從而加速其衰老和死亡［7?8］。青藏高原作為地球上一個(gè)獨(dú)特的地理單元，被譽(yù)為“世界屋脊”和“第三極”［9］，是全球氣候變化的敏感區(qū)和關(guān)鍵區(qū)［10］。由于全球氣候變化的影響，導(dǎo)致青藏高原地區(qū)的物種組成和分布發(fā)生了顯著變化，如棲息地退化和生境喪失、物種分布區(qū)減小、物候期提前、種群繁殖速率和生存力下降、生物種間關(guān)系變化等［11］。因此，快速的升溫模式必將對(duì)世居高原的變溫脊椎動(dòng)物的生存和繁殖等產(chǎn)生嚴(yán)重影響，那么這些物種的命運(yùn)將何去何從？這是當(dāng)前動(dòng)物生理生態(tài)學(xué)研究的重要科學(xué)問(wèn)題之一。

對(duì)于變溫脊椎動(dòng)物，其體內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)會(huì)受到各種內(nèi)部或外部因素的顯著影響，如缺氧、冰凍、低溫、高溫、脫水、冬眠以及從休眠中蘇醒等［12?17］。氧化應(yīng)激是與溫度變化有關(guān)的各種生理和生化反應(yīng)中的一個(gè)常見(jiàn)結(jié)果。許多研究報(bào)道稱，熱應(yīng)激可以顯著增加變溫脊椎動(dòng)物的活性氧生成，如棘胸蛙（Quasipaa spinosa）［12］、暗紋東方鲀（Takifugu obscu?rus）［18］、密點(diǎn)麻蜥（Eremias multiocellata）［19］和中亞側(cè)褶蛙（Pelophylax terentievi）［17］。為了減緩或防止活性氧造成的氧化損傷，生物體進(jìn)化出了一套完整的抗氧化防御系統(tǒng)，該系統(tǒng)主要由低分子質(zhì)量的抗氧化劑［還原型谷胱甘肽（GSH）、抗壞血酸（Vc）、維生素E 和尿酸等］和抗氧化酶［超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPX）、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）、谷胱甘肽還原酶（GR）等］兩部分組成。不同抗氧化劑之間形成了互補(bǔ)、協(xié)同的關(guān)系，從而保證了整個(gè)抗氧化系統(tǒng)的穩(wěn)定性和有效性［20］。通過(guò)清除活性氧，抗氧化酶在保護(hù)生物體免受熱應(yīng)激方面發(fā)揮了重要作用，如棘胸蛙肝臟中SOD和GPX的活性明顯提高，以消除熱應(yīng)激（30 ℃）誘發(fā)產(chǎn)生的大量活性氧［12］。目前，這類研究更多地關(guān)注低海拔分布的變溫脊椎動(dòng)物，而關(guān)于熱脅迫對(duì)高海拔兩棲動(dòng)物的氧化應(yīng)激水平和抗氧化防御系統(tǒng)的影響研究鮮有報(bào)道。

高山倭蛙（Nanorana parkeri）隸屬于叉舌蛙科（Dicroglossidae）倭蛙屬（Nanorana），廣泛分布于（海拔2 850～5 100 m）青藏高原南部，被認(rèn)為是世界上迄今所知海拔分布最高的兩棲動(dòng)物［21］。目前，對(duì)該物種的研究主要集中在系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系［22］、生活史［23］、高海拔適應(yīng)［24］、冬眠生理生態(tài)學(xué)［25］等方面。近年來(lái)，Niu等［15］對(duì)高山倭蛙冬眠生理生態(tài)學(xué)進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)冷凍處理導(dǎo)致高山倭蛙的抗氧化防御系統(tǒng)發(fā)生了組織特異性變化，激活抗氧化防御系統(tǒng)是高山倭蛙耐受結(jié)冰的生存策略之一；此外，高山倭蛙能夠耐受短暫的身體結(jié)冰［26］；與夏季相比，越冬的高山倭蛙采用季節(jié)性的代謝抑制策略，主要表現(xiàn)在動(dòng)物整體水平、器官水平和亞細(xì)胞水平的代謝速率顯著降低［26?27］。目前，全球氣候變暖對(duì)青藏高原特有物種高山倭蛙的影響是未知的，本研究旨在探究熱馴化對(duì)該物種體內(nèi)氧化應(yīng)激和抗氧化防御系統(tǒng)的影響，從生理生化層面揭示高山倭蛙對(duì)熱馴化的響應(yīng)，有助于揭示全球氣候變暖對(duì)青藏高原兩棲動(dòng)物的影響，對(duì)保護(hù)青藏高原的生物多樣性具有重要意義。

1 材料與方法

1. 1 動(dòng)物采集和熱馴化試驗(yàn)

高山倭蛙采自西藏自治區(qū)拉薩市當(dāng)雄縣（30. 28° N，91. 05° E；海拔4 280 m），采樣時(shí)間為2021年7月中旬，共采集雄性成體高山倭蛙20只。將采集的高山倭蛙裝于30 cm ×20 cm ×20 cm的收納箱中，并采用在收納箱外側(cè)放置冰袋的方式將運(yùn)輸溫度控制在15～20 ℃，帶至德州學(xué)院后，置于人工氣候培養(yǎng)箱（RGD-500C3；合肥右科儀器設(shè)備有限公司）中飼養(yǎng)2周（培養(yǎng)箱參數(shù)：溫度16 ℃，相對(duì)濕度90%，光照強(qiáng)度6 000 lx，12 h光照/12 h黑暗），每天08：00投喂20條小面包蟲(chóng)，18：00挑出剩余面包蟲(chóng)。然后，隨機(jī)取出10只高山倭蛙置于另一人工氣候培養(yǎng)箱中進(jìn)行熱馴化處理2 周（培養(yǎng)箱參數(shù)：溫度26 ℃，相對(duì)濕度90%，光照強(qiáng)度6 000 lx，12 h 光照/12 h黑暗）。以16 ℃條件為對(duì)照組，26 ℃為熱馴化組。熱馴化過(guò)程也為高山倭蛙提供同對(duì)照組的喂食。馴化結(jié)束后，對(duì)高山倭蛙進(jìn)行毀髓處死，解剖、快速提取完整的心臟、肝臟、腦和骨骼肌，分別裝入凍存管，速凍于液氮中，最后轉(zhuǎn)至超低溫冰箱中-80 ℃保存，用于氧化應(yīng)激指標(biāo)和抗氧化保護(hù)指標(biāo)的測(cè)定。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)德州學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：DZXY2021003）。

1. 2 樣本處理

組織預(yù)處理：稱取存放于冰箱中?80 ℃的組織樣品0. 02～0. 04 g，分別置于2 mL研磨管中，按質(zhì)量（g）∶體積（mL）=1∶9的比例加入預(yù)冷的0. 6%生理鹽水，使用冷凍樣品研磨儀進(jìn)行勻漿處理，儀器參數(shù)：?20 ℃，60 Hz，40 s，間隔20 s，循環(huán)5次。研磨充分后，離心（4 ℃，4 000 r/min，10 min），將上清液轉(zhuǎn)至1. 5 mL離心管中并置于冰上待測(cè)。吸取20 μL上清液，使用考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）測(cè)定蛋白濃度。

1. 3 生理生化指標(biāo)的測(cè)定

使用購(gòu)自南京建成生物工程研究所的生化試劑盒測(cè)定氧化應(yīng)激和抗氧化防御指標(biāo)，包括谷胱甘肽［GSH和氧化型谷胱甘肽（GSSG）］、SOD、CAT、GPX、GST、總抗氧化能力（T-AOC）、Vc和丙二醛（MDA），所有操作過(guò)程按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1. 4 數(shù)據(jù)處理

使用IBM SPSS Statistics 26 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)每組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性和正態(tài)分布檢驗(yàn)，使用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)比較兩組之間的差異，plt;0. 05表示統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有顯著差異，在剔除異常值后，每組保留6個(gè)有效數(shù)據(jù)用于統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。使用Origin 2022軟件（Origin‐Lab Corporation）繪圖。

2 結(jié)果

2. 1 熱馴化對(duì)高山倭蛙谷胱甘肽水平的影響

與對(duì)照組相比，熱馴化并未對(duì)肝臟和骨骼肌組織的總谷胱甘肽和GSH含量產(chǎn)生顯著影響（圖1A、B）。盡管肝臟組織中的GSSG 含量未發(fā)生明顯變化，但熱馴化導(dǎo)致骨骼肌組織中GSSG含量顯著升高（t=1. 4，df=10，plt;0. 001）（圖1C）。此外，熱馴化導(dǎo)致肝臟和骨骼肌組織中GSSG/GSH明顯升高（圖1D）。

2. 2 熱馴化對(duì)高山倭蛙抗氧化酶的影響

與對(duì)照組相比，熱馴化導(dǎo)致腦組織中SOD活性上升約19%（t=?0. 398，df=10，plt;0. 01），但其他組織中SOD活性未見(jiàn)明顯變化（pgt;0. 05）（圖2A）。熱馴化并未導(dǎo)致心臟和骨骼肌組織中的CAT活性發(fā)生明顯變化（pgt;0. 05），但在腦組織中CAT 活性上升約27%（t=?3. 526，df=6. 741，plt;0. 05），肝臟組織的CAT活性上升約15%（t=?2. 317，df=10，plt;0. 05）（圖2B）。熱馴化導(dǎo)致骨骼肌組織中GPX活性上升約23%（t=?2. 446，df=10，plt;0. 05），肝臟組織中GPX活性上升約56%（t=?8. 468，df=10，plt;0. 001），但心臟和腦組織中的GPX活性未發(fā)生明顯變化（pgt;0. 05）（圖2C）。熱馴化導(dǎo)致骨骼肌組織中GST 活性上升26%（t=6. 175，df=10，plt;0. 001），但心臟、腦、肝臟組織中的GST活性未發(fā)生明顯變化（pgt;0. 05）（圖2D）。熱馴化誘導(dǎo)骨骼肌組織中T-AOC 活性上升約22%（t=?2. 750，df=10，plt;0. 05），腦組織中T-AOC活性上升約31%（t=?4. 561，df=10，plt;0. 01），肝臟組織中T-AOC活性上升約38%（t=?6. 766，df=10，plt;0. 001），心臟組織中T-AOC未發(fā)生明顯變化（pgt;0. 05）（圖2E）。此外，熱馴化并未導(dǎo)致心臟、腦、肝臟和骨骼肌組織中Vc含量發(fā)生明顯變化（pgt;0. 05）（圖2F）。

2. 3 熱馴化對(duì)高山倭蛙MDA 質(zhì)量摩爾濃度的影響

與對(duì)照組相比，熱馴化誘導(dǎo)肝臟組織中MDA質(zhì)量摩爾濃度下降約42%（t=5. 434，df=10，plt;0. 001），骨骼肌組織中MDA質(zhì)量摩爾濃度未發(fā)生明顯變化（pgt;0. 05）。

3 討論

本研究以高山倭蛙為研究對(duì)象，探究了熱馴化對(duì)其氧化應(yīng)激水平和抗氧化防御系統(tǒng)的影響，結(jié)果顯示不同組織中各指標(biāo)對(duì)熱馴化處理呈現(xiàn)不同的反應(yīng)，這與以往的研究結(jié)果［28?29］相吻合，即動(dòng)物對(duì)熱刺激的響應(yīng)呈現(xiàn)組織特異性和物種特異性。

3. 1 熱馴化對(duì)高山倭蛙氧化應(yīng)激水平的影響

作為外溫脊椎動(dòng)物，兩棲動(dòng)物對(duì)環(huán)境溫度的變化極其敏感，被認(rèn)為是生物多樣性觀測(cè)和環(huán)境監(jiān)測(cè)的指示物種［30］。GSSG/GSH比值是體現(xiàn)細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的一項(xiàng)重要指標(biāo)［31］，另外GSH是一種重要的解毒劑和小分子抗氧化劑［32］。GSH/GSSG 比值越大，表明機(jī)體抗氧化能力越強(qiáng)，反之，GSSG/GSH比值越大，代表生物體遭受氧化脅迫越強(qiáng)。在本研究中，熱馴化導(dǎo)致肝臟和骨骼肌組織中GSSG/GSH比值顯著升高，表明熱馴化誘導(dǎo)高山倭蛙機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，這可能是熱馴化誘導(dǎo)其代謝水平升高，從而伴隨著活性氧的急劇增加。以前的研究已經(jīng)證實(shí)，活性氧的生成與機(jī)體的代謝水平成正比。此外，急性的熱處理也能誘導(dǎo)機(jī)體氧化應(yīng)激水平升高，如冬眠的高山倭蛙（4 ℃）被急性熱刺激（10 ℃，12 h）后，肝臟和骨骼肌組織中GSSG 含量及GSSG/GSH 比值顯著升高［33］。

3. 2 熱馴化對(duì)高山倭蛙抗氧化防御系統(tǒng)的影響

急性熱應(yīng)激可以導(dǎo)致變溫動(dòng)物抗氧化防御系統(tǒng)上調(diào)［34］，而且熱馴化對(duì)抗氧化防御系統(tǒng)的影響依賴于物種、組織和暴露條件（時(shí)間和溫度）。本研究發(fā)現(xiàn)，熱馴化導(dǎo)致腦組織中的SOD活性顯著增加，而其他組織中SOD 活性沒(méi)有發(fā)生明顯變化。SOD 作為一種重要的抗氧化保護(hù)酶，其發(fā)揮的作用是抗氧化防御的第一步，即將O2·-轉(zhuǎn)化生成H2O2、羥自由基（·OH）［35］。腦組織中SOD活性上升是高山倭蛙對(duì)熱馴化的一種保護(hù)性策略，能夠有效地降低高溫條件下活性氧激增帶來(lái)的負(fù)面影響。顧重建等［36］對(duì)紅耳滑龜（Trachemys scripta elegans）幼龜?shù)难芯恳舶l(fā)現(xiàn)，熱馴化導(dǎo)致肝臟和肌肉組織中SOD活性顯著升高；另外，熱刺激（30 ℃，48 h）導(dǎo)致棘胸蛙肝臟中SOD酶活性顯著升高［12］。抗氧化保護(hù)酶發(fā)揮作用的第二步是CAT清除體內(nèi)的H2O2［37］。本研究發(fā)現(xiàn)，熱馴化導(dǎo)致高山倭蛙腦和肝臟組織中CAT 活性顯著增加。GPX作為一種重要的抗氧化酶，能夠?qū)SH氧化成GSSG，同時(shí)將H2O2 還原為H2O，從而能夠有效地保護(hù)生物膜的結(jié)構(gòu)和功能［38］。GST是生物體中一種主要的解毒酶，能夠催化GSH和親電底物結(jié)合，增加有毒物質(zhì)的水溶性，消除生物體因受到脅迫而產(chǎn)生的活性氧［39］。在本研究中，熱馴化導(dǎo)致肝臟組織中GPX活性和骨骼肌組織中GST活性均顯著增加。在三刺魚(yú)（Gasterosteus aculeatus）的研究中發(fā)現(xiàn)，熱條件會(huì)使其肌肉組織中GPX活性顯著增加［40］；在金頭鯛（Sparus aurata）中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果，熱刺激導(dǎo)致肝臟和肌肉中的CAT 和GST 活性均顯著增加［28］。T-AOC 是反映體內(nèi)抗氧化防御能力的一個(gè)重要指標(biāo)，可以綜合評(píng)價(jià)整個(gè)身體的抗氧化水平，克服單一抗氧化防御指標(biāo)的片面性［41］。本研究發(fā)現(xiàn)，熱馴化導(dǎo)致高山倭蛙腦、肝臟和骨骼肌中T-AOC均顯著增高，而心臟組織中無(wú)明顯變化。不同組織對(duì)活性氧的敏感程度和抗氧化保護(hù)酶的表達(dá)等不同，例如，肝臟是體內(nèi)最活躍的代謝器官，也是產(chǎn)生活性氧的主要場(chǎng)所，通常肝臟具有更強(qiáng)的抗氧化保護(hù)酶活性。此外，肌肉和腦組織中含有大量不飽和脂肪酸，這是活性氧攻擊的主要對(duì)象，因此這兩種組織很容易遭受氧化損傷［42］，提高這些組織中T-AOC有助于及時(shí)清除活性氧造成的損傷。此外，已有大量的研究證實(shí)抗氧化保護(hù)酶在應(yīng)對(duì)脅迫時(shí)表現(xiàn)出組織特異性變化［29］?；钚匝蹩梢约せ钜恍┺D(zhuǎn)錄因子，如FoxO、Nrf2、HIF-1、NF-κB 和p53，從而提高抗氧化酶的表達(dá)［43］，而且翻譯后修飾也參與調(diào)控抗氧化酶的活性［44］。這些調(diào)節(jié)作用對(duì)高山倭蛙抗氧化酶的影響還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

為了抵抗活性氧的攻擊，維持機(jī)體氧化還原穩(wěn)態(tài)，小分子抗氧化劑也發(fā)揮了重要作用，其中典型的代表就是Vc［45］。Vc具有很強(qiáng)的還原性，在體內(nèi)起著平衡自由基的產(chǎn)生和清除的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，熱馴化對(duì)心臟、腦、肝臟和骨骼肌組織中Vc含量無(wú)影響，表明機(jī)體并未動(dòng)用Vc 參與活性氧的清除過(guò)程。

3. 3 熱馴化對(duì)高山倭蛙MDA 的影響

MDA含量常?？煞从丑w內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的程度，間接反映出細(xì)胞損傷程度［46］。在本研究中，熱馴化后肝臟組織中MDA含量顯著降低，而且肌肉中MDA含量未發(fā)生變化，表明熱馴化并未導(dǎo)致這些組織出現(xiàn)氧化損傷，這主要是由于熱馴化導(dǎo)致抗氧化防御能力顯著增強(qiáng)并快速清除急劇增加的活性氧。然而，在密點(diǎn)麻蜥中發(fā)現(xiàn)，肝臟組織中MDA含量在熱馴化后顯著升高，但是SOD 活性并未發(fā)生明顯變化［19］。總之，熱馴化對(duì)不同動(dòng)物的氧化損傷的影響存在種間差異。

4 結(jié)論

綜上所述，高山倭蛙肝臟和骨骼肌組織中GSSG/GSH比值顯著增加，表明熱馴化導(dǎo)致高山倭蛙體內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高；抗氧化防御系統(tǒng)發(fā)生了組織特性的變化，尤其肝臟中CAT、GPX和T-AOC活性顯著上升，但MDA含量明顯下降，表明高山倭蛙體內(nèi)有著完善的抗氧化防御系統(tǒng)，能夠及時(shí)有效地抵御熱馴化導(dǎo)致的氧化應(yīng)激水平升高，本研究對(duì)于理解全球變暖對(duì)世居高原的兩棲動(dòng)物的影響具有重要意義。

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