摘要：LATERAL ORGAN BOUNDARIES DOMAIN（LBD）家族是含有高度保守的LOB結構域的一類植物特有轉錄因子，參與植物的生長代謝以及多種逆境脅迫應答等過程。本研究通過生物信息學方法對葡萄LBD基因家族中的VvLBD35和VvLBD36進行基因結構和進化關系分析，并利用qRT-PCR技術檢測兩個基因的組織表達模式以及在干旱、高鹽、高溫和低溫條件下的誘導表達模式。結果顯示，VvLBD35和VvLBD36均含有α-螺旋、無規(guī)則卷曲和β-轉角結構，VvLBD36還含有較多的3-折疊結構；VvLBD35和VvLBD36與擬南芥、水稻、玉米、柑橘和番茄等植物中的LBD蛋白都有較高的同源性；VvLBD35和VvLBD36的啟動子區(qū)含有多種脅迫、激素以及生長發(fā)育相關的應答元件：VvLBD35和VvLBD36在根、莖、葉中均有不同程度的表達，且均在葉中表達量最高，約是根和莖中的2-8倍：誘導表達模式分析表明，VvLBD35受高溫誘導最為顯著，下調至約為對照的6%，而VvLBD36受高鹽和高溫的誘導最為顯著，分別上調至對照的5.67倍和14.29倍。本研究為進一步深入揭示VvLBD35和VvLBD36的生物學功能奠定了實驗基礎。

關鍵詞：葡萄；LBD家族：序列分析；表達分析；非生物脅迫

中圖分類號：S663.1：Q786 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2024） 08-0023-07

LBD轉錄因子家族，又稱為AS2（asymmetricleaves 2-like）/LOB基因家族，因其編碼蛋白中均含有一段LOB （lateral organ boundaries）結構域而得名。LOB結構域一般含有3種保守的基序，即類鋅指結構域、Gly-Ala-Ser（GAS）結構域以及類亮氨酸拉鏈結構域。LBD轉錄因子家族根據LOB結構域的完整性可分為Ⅰ類和Ⅱ類。Ⅰ類包含3種完整的結構域，而且GAS結構域與類亮氨酸拉鏈結構域之間能夠通過形成“螺旋卷曲”結構，介導蛋白質之間的相互作用。Ⅱ類具有一個殘缺的亮氨酸拉鏈結構域，但Ⅱ類基因家族較Ⅰ類相對保守。LBD基因家族中Ⅰ類成員較多。研究顯示，LBD蛋白間一般以形成異源二聚體的形式發(fā)揮生物學作用。

目前，已在多種植物中鑒定到LBD基因家族成員，在擬南芥中鑒定到43個、大麥中24個、番茄中46個、玉米中44個、毛果楊中57個LBD基因。LBD轉錄因子參與植物的生長代謝以及多種逆境脅迫應答等過程。擬南芥中鑒定到AtLBD16、AtLBD29在生長素響應因子ARF7介導的側根發(fā)育以及溫度依賴性愈傷組織的形成中均發(fā)揮著關鍵作用：AtLBD15通過參與ABA信號轉導途徑調控植物的干旱脅迫應答：AtLBD27參與擬南芥器官的發(fā)生過程；AtLBD18、AtLBD30、AtLBD36等在擬南芥導管分化、細胞壁形成和花發(fā)育中均可發(fā)揮重要的作用：AtLBD37、AtLBD39調控擬南芥花青素的形成和氮響應過程。PtLBD1參與調控楊樹次生生長過程。小立碗蘚受甘露醇誘導后大多數(shù)PpLBDs表達量均上調，可能會增加植株的耐旱性。菊花CmLBD1的表達受生長素調節(jié)并參與不定根原基的形成過程。農作物中也鑒定到一些LBDs廣泛地參與到對非生物脅迫的應答以及植物生長發(fā)育調控過程。比如，玉米ZmLBD2和ZmLBD5均參與干旱脅迫響應的調控過程，ZmLBD19調控植物器官發(fā)生的過程：馬鈴薯StLBD2 -6和StLBD3-5的表達受干旱脅迫誘導，可能參與干旱脅迫應答：水稻Ⅱ類LBD蛋白OsLBD37和Os-LBD38介導抽穗期的生長調控：番茄SlLBD40介導茉莉酸信號轉導負調控干旱脅迫應答：小麥TaLBD16 - 4D參與植株結構和抽穗期的調控：大豆GmLBD12經干旱和多種激素等脅迫處理后被顯著誘導。然而，與擬南芥和農作物相比，經濟作物葡萄LBD基因家族的研究卻相對較少，與逆境脅迫的關系更是鮮有報道。

葡萄作為一種具有較高營養(yǎng)價值的經濟作物，種植歷史悠久，在全世界范圍內被廣泛種植。然而，全球氣候變暖、工業(yè)污染、干旱、土壤鹽堿化等非生物脅迫的加劇嚴重影響著葡萄的生長過程。因此，研究葡萄脅迫應答相關基因、挖掘耐脅迫基因資源，為后續(xù)有針對性地進行脅迫應答相關基因的改造以培育具有多種脅迫抗性的新品種有重要的理論價值和現(xiàn)實意義。

前期研究通過生物信息學和同源性分析鑒定到葡萄中存在40個LBD基因（VvLBDl -VvLBD40），本研究通過生物信息學方法分析葡萄LBD基因家族成員VvLBD35和VvLBD36的基因結構特征和進化關系，利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測兩者在葡萄根、莖、葉中的組織表達模式以及在干旱、高鹽、高溫和低溫條件下的誘導表達模式，為進一步揭示VvLBD基因家族應答逆境脅迫的生物學作用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和處理

葡萄品種為‘貴妃’，于2021年9月在日光溫室中按照品種最適條件進行常規(guī)管理。葡萄種子首先置于4℃條件下層積，2d后移入25℃、16h光照/8 h黑暗的培養(yǎng)室中培養(yǎng)。分別收集培養(yǎng)4周后葡萄植株的根、莖、葉組織，經液氮速凍后移入-80℃超低溫冰箱保存。

誘導表達試驗：采用干旱（200 mmol/L甘露醇）、高鹽（300 mmol/L NaCl）、高溫（42℃）和低溫（4℃）分別處理生長4周的葡萄植株6h；以正常條件下的葡萄植株作為對照。脅迫處理后收集葡萄葉片并立即用液氮冷凍保存。

1.2 VvLBD35和VvLBD36蛋白的亞細胞定位及三級結構預測

從Phytozome數(shù)據庫（http：//www.phytozome.org/）下載葡萄VvLBD35和VvLBD36的核苷酸和氨基酸序列，通過查閱LBD轉錄因子保守基序的研究結果，依據其保守基序的序列特征，分析繪制VvLBD35和VvLB’D36的基因序列圖：使用WoLFPSORT在線網站（https：//www.genscript．com/wolf-psort.html）進行VvLBD35和VvLBD36的亞細胞定位預測；利用SWISS-MODEL（http：//swissmod-el．expasy. org）在線預測葡萄VvLBD35和Vv-LBD36蛋白的三級結構。

1.3 VvLBD35和VvLBD36的序列比對和系統(tǒng)進化樹構建

采用DNAMAN生物學軟件對葡萄VvLBD35與擬南芥AtLBD27、水稻Os0890402100、玉米2mOOOOleb042180、柑橘CcLBD6、番茄SILBD27進行氨基酸保守域序列比對，對VvLBD36與擬南芥AtLBD38、水稻OsLBD37、玉米2mOOOOleb326200、柑橘CICLE_v10026374mg、番茄Solyc029092550進行氨基酸保守域序列比對。利用ClustalX軟件對葡萄、擬南芥、水稻、玉米、柑橘、番茄6個物種的蛋白序列進行分析比對。利用MEGA7.0構建系統(tǒng)進化樹。

1.4 VvLBD35和VvLBD36的順式作用元件分析

利用PlantCARE（http：//bioinformatics. psb.ugent. be/webtools/plantcare/html/）在線預測葡萄VvLBD35和VvLBD36啟動子區(qū)（約2 000 bp）存在的順式作用元件，最后利用TBtools軟件進行可視化繪圖。

1.5 葡萄總RNA提取與qRT-PCR檢測

利用RN03 RNA提取試劑盒（北京Aidlab公司）提取葡萄組織總RNA，然后反轉錄合成cD-NA。qRT-PCR檢測采用Bio-Rad CFX96系統(tǒng)，使用Takara的SYBR Green PCR Master Mix試劑盒。VvActin作為內參基因，測定VvLBD35和Vv-LBD36在葡萄不同組織以及不同脅迫處理下葉片中的表達模式，重復3次。引物信息見表1。

1.6 數(shù)據處理與分析

利用2 -AAC‘法計算VvLBD35和VvLBD36基因的相對表達量。利用SPSS 20.0軟件進行方差分析，采用最小顯著差數(shù)法（LSD）進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 VvLBD35和VvLBD36蛋白亞細胞定位及三級結構分析

VvLBD35和VvLBD36分別編碼301、222個氨基酸，對其編碼蛋白進行結構分析。結果顯示，VvLBD35具有典型的C-block基序CAACK-YQRRKCSSEC，結構模式符合CX2CX6CX3C，屬于LBD基因家族的Ⅰ類：而VvLBD36則不具有以上基序特征，含有一個殘缺的亮氨酸拉鏈結構，表明其屬于Ⅱ類。亞細胞定位預測結果顯示，Vv-LBD35和VvLBD36可能均定位于細胞核。蛋白質三級結構分析結果（圖1）顯示，VvLBD35包含多個α螺旋，無規(guī)則卷曲和β-轉角較少，未發(fā)現(xiàn)β-折疊；VvLBD36包含少量的α螺旋，較多的β-折疊、β-轉角和無規(guī)則卷曲結構。

2.2 VvLBD35和VvLBD36的氨基酸序列比對和系統(tǒng)進化分析

如圖2所示，通過對VvLBD35和VvLBD36蛋白與其他5個物種LBD家族成員分別進行氨基酸多序列比對，VvLBD35與擬南芥AtLBD27、水稻Os08g0402100、玉米2m0000leb042180、柑橘CcLBD6、番茄SILBD27均包含保守LOB結構域中的C基序，該序列的相似性高達85%，全部序列的相似性為33%（圖2A）；VvLBD36與擬南芥AtLBD38、水稻OsLBD37、玉米2mOOOOleb326200、柑橘CICLE_v10026374mg、番茄Solyc02g092550的序列相似性達到61%（圖2B）。表明6種LBD家族成員的N端區(qū)域高度保守，C端區(qū)域具有特異性，為可變C端。圖2 VvLBD35（A）和VvLBD36（B）與其他物種LBD氨基酸序列比對

為了進一步了解VvLBD35和VvLBD36轉錄因子的進化關系，利用MEGA7.0軟件對12種LBD蛋白進行系統(tǒng)進化分析。結果（圖3）顯示，VvLBD35轉錄因子與番茄SILBD27、擬南芥AtLBD27同源性較高，系統(tǒng)進化關系較近，其次是玉米2m00001eb042180、水稻Os08g0402100以及柑橘CcLBD6; VvLBD36與擬南芥AtLBD38、番茄Solyc02g092550以及柑橘CICLE_v10026374mg同源性較高，系統(tǒng)進化關系較近，其次是水稻Os-LBD37和玉米2m00001eb326200。

2.3 VvLBD35和VvLBD36啟動子順式作用元件分析

為了解VvLBD35和VvLBD36的潛在功能和調控機制，利用PlantCARE在線軟件分別提取葡萄VvLBD35和VvLBD36約2 000 bp的啟動子序列，并進行順式作用元件分析。如圖4所示，Vv-LBD35啟動子上分布有脫落酸作用元件（ABRE）、茉莉酸甲酯作用元件（CGTCA -motif）、生長素反應元件（TGA - element）、光響應元件（TCCC-motif）、低溫反應元件（LTR）以及干旱脅迫反應元件（MBS）等；VvLBD36啟動子區(qū)域則含有赤霉素（P-box）、水楊酸（TCA-element）、氧脅迫（GC -motif）和茉莉酸甲酯（CGTCA - motif和TGACG-motif）響應等相關的順式作用元件；同時，這兩個基因的啟動子中還含有與生長發(fā)育相關的元件，如胚乳發(fā)育元件（GCN4_motif）和分生組織表達元件（CAT-box）等。表明VvLBD35和VvLBD36可能在葡萄的非生物脅迫應答和生長發(fā)育方面均發(fā)揮著重要作用。

2.4 VvLBD35和VvLBD36的組織表達模式分析

為分析VvLBD35和VvLBD36在葡萄不同組織中的表達情況，以生長4周的葡萄不同組織的cDNA為模板，利用qRT-PCR技術分別檢測Vv-LBD35和VvLBD36在葡萄根、莖和葉中的表達量。結果（圖5）顯示，VvLBD35和VvLBD36在根、莖和葉中均有表達，且均在葉中表達量最高，約是根和莖中的2-8倍?？梢?，VvLBD35和VvLBD36在葡萄不同組織中表達程度不同，這可能與其在不同組織中的表達調控有關。

2.5 VvLBD35和VvLBD36的誘導表達模式分析

VvLBD35和VvLBD36在不同誘導處理下的表達模式分析結果顯示，與對照相比，各誘導條件F VvLBD35的表達量均顯著降低，以高溫條件下降低最顯著，下調至約為對照的6%（圖6A）；Vv-LBD36受高鹽和高溫條件誘導表達水平顯著升高，分別為對照的5.67倍和14.29倍，而干旱和低溫處理幾乎不影響VvLBD36的表達（圖6B）。

3 討論與結論

轉錄因子作為轉錄調控最后一環(huán)的關鍵因子，是近年來植物逆境脅迫分子機制研究中的一個熱點。葡萄在栽培種植過程中極易遭受逆境脅迫，為更加有效地控制非生物脅迫對葡萄的危害，提高經濟效益，葡萄的抗逆性尤其是耐低溫、耐高溫、干旱抗性以及響應鹽害的能力亟待提高。為了能更好地了解葡萄轉錄因子LBD蛋白的結構特征和表達調控特點，本研究對葡萄Vv-LBD35和VvLBD36進行了蛋白特征的預測，分析了兩個基因在葡萄主要組織中的內源表達規(guī)律以及不同脅迫條件下的誘導表達模式，為深入揭示VvLBD35和VvLBD36響應逆境脅迫的調控機制和生物學功能奠定了基礎。

LBD基因已經在許多植物中被鑒定且大部分成員都屬于I類。毛果楊57個LBD基因中I類占79%：水稻基因組中鑒定到35個LBD基因，其中I類成員占比高達86%：小立碗蘚基因組中鑒定到31個LBD轉錄因子，屬于I類的成員占比為77%。前人由于研究策略、查詢序列、數(shù)據庫選擇等差異在葡萄基因組中分別鑒定到了40、50、30個LBD家族成員，而且經過基因分析發(fā)現(xiàn)大部分成員也歸屬于I類家族。本研究通過對葡萄VvLBD35和VvLBD36基因進行蛋白特征分析得知，VvLBD35屬于I類，具有CX，CX6CX3C的結構模式：而VvLBD36則不具有以上基序特征，只含有1個殘缺亮氨酸拉鏈結構，證明Vv-LBD36轉錄因子屬于Ⅱ類亞家族。

截至目前，LBD轉錄因子在多個物種響應非生物脅迫中發(fā)揮的作用已被驗證。擬南芥AtLBD15、番茄SILBD40、馬鈴薯StLBD1 -5以及小立碗蘚PpLBDs等參與了植物的干旱脅迫應答；大豆GmLBD12受干旱、低溫等多種因素的顯著誘導：16個BnLBDs能夠提高苧麻植株的耐熱性：辣椒中I類LBD基因在響應高溫脅迫時表達量明顯低于Ⅱ類LBD基因。

通過對葡萄VvLBD35和VvLBD36啟動子區(qū)的順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，二者啟動子區(qū)域均含有與非生物脅迫應答相關的元件。誘導表達模式分析顯示，高溫條件下VvLBD35的表達顯著下調，同樣VvLBD36受高溫脅迫的誘導表達最為顯著，表明，VvLBD35和VvLBD36可能在植物響應高溫脅迫中發(fā)揮重要作用。另外，誘導表達模式分析表明葡萄VvLBD36也受到高鹽脅迫的誘導。本研究結果為進一步揭示葡萄LBD轉錄因子在高溫等非生物脅迫應答中的作用和抗性機制奠定了理論基礎。

基金項目：山東省自然科學基金面上項目（ZR2022MC064）；作物生物學國家重點實驗室開放課題（2021KF06）；濰坊學院博士科研基 金項目（2023BS19）