摘 要：本文旨在探究PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬在硒代蛋氨酸（selenomethionine，Se-Met）緩解氟致抑郁樣行為中的作用。選取40只BALB/c小鼠隨機(jī)分為5組：空白對(duì)照組（C組）、氟組（NaF150mg·L^-1，F(xiàn)組）、氟+低硒組（NaF150mg·L^-1+1.5mg·L^-1，F(xiàn)+LSe組）、氟+中硒組（NaF150mg·L^-1+3.0mg·L^-1，F(xiàn)+MSe組）、氟+高硒組（NaF150mg·L^-1+6.0mg·L^-1，F(xiàn)+HSe組）。氟化鈉暴露90d后，通過(guò)高架O型迷宮和懸尾試驗(yàn)觀察小鼠的行為學(xué)表現(xiàn)，運(yùn)用HE染色觀察小鼠大腦皮質(zhì)的損傷情況，采用生化試劑盒檢測(cè)氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的含量，并使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)線粒體自噬相關(guān)基因的表達(dá)水平。動(dòng)物行為學(xué)結(jié)果顯示：與C組相比，F(xiàn)組小鼠在懸尾試驗(yàn)中的“靜止”時(shí)間顯著增加（P＜0.05），在高架O型迷宮中進(jìn)入閉合臂的時(shí)間有明顯升高趨勢(shì)（P＜0.05）。在補(bǔ)充Se-Met后小鼠“靜止”時(shí)間顯著減少（P＜0.05），F(xiàn)+LSe和F+MSe小鼠進(jìn)入閉合臂的時(shí)間相比于F組顯著減少（P＜0.05）。病理組織切片結(jié)果顯示：F組小鼠大腦皮質(zhì)細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞體積縮小，且椎體細(xì)胞數(shù)量減少。經(jīng)Se-Met改善后，F(xiàn)+LSe組的大腦皮質(zhì)組織核仁清晰，細(xì)胞質(zhì)更加均勻，改善效果更顯著。氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)結(jié)果顯示：與C組相比，F(xiàn)組活性氧（reactive oxygen species，ROS）顯著升高（P＜0.05），谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）含量顯著減少（P＜0.05）。與F組相比，F(xiàn)+LSe、F+HSe和F+MSe組ROS含量均顯著降低（P＜0.05），且含量依次表現(xiàn)為F+LSelt;F+HSelt;F+MSe；F+LSe和F+HSe組GSH-PX含量相比于F組顯著升高（P＜0.05）。自噬相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平結(jié)果顯示：與C組相比，F(xiàn)組自噬相關(guān)基因Parkin、PINK1、LC3、OPTN、NBR1、Drp1、Fis1的mRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），OPA1、Mfn1、Mfn2的mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。與F組相比，F(xiàn)+LSe和F+HSe組顯著降低Parkin、OPTN、PINK1、P62、NBR1和Fis1的mRNA表達(dá)水平（P＜0.05），F(xiàn)+LSe和F+MSe組顯著降低Parkin、LC3、Drp1和P62的mRNA表達(dá)水平（P＜0.05），顯著增加OPA1的mRNA表達(dá)水平（P＜0.05），F(xiàn)+LSe組顯著增加Mfn2的mRNA表達(dá)水平（P＜0.05）。綜上所述，1.5mg·L^-1Se-Met可通過(guò)影響線粒體自噬相關(guān)基因的表達(dá)，恢復(fù)線粒體融合與分裂的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，緩解大腦皮質(zhì)氧化應(yīng)激，從而改善大腦皮質(zhì)組織損傷和抑郁樣行為的出現(xiàn)。

關(guān)鍵詞：硒代蛋氨酸；氟；線粒體自噬；大腦皮質(zhì)

中圖分類號(hào)：S856.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）07-3213-12

收稿日期：2023-11-03

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31972751）; 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)體系項(xiàng)目（2024CYJSTX13-10）; 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)橫向科技項(xiàng)目（2022HX286; 2024HX001）

作者簡(jiǎn)介：李媛媛（1999-），女，山西晉城人，碩士，主要從事環(huán)境毒理學(xué)研究，E-mail：16635049401@163.com；王天玉（1995-），女，山西長(zhǎng)治人，博士，主要從事環(huán)境毒理學(xué)研究，E-mail：2984232749@qq.com，李媛媛和王天玉為同等貢獻(xiàn)作者

*通信作者：王金明，主要從事環(huán)境毒理學(xué)研究，E-mail：jm50408@163.com

Selenomethionine，through PINK1/Parkin-mediated Mitochondrial Autophagy，

Alleviates Fluoride-induced Depressive-like Behavior

LIYuanyuan，WANGTianyu，LIMeng，ZHANGWenhui，WANGYinghui，

ZHAOTianrui，LIHaojie，ZHAOYangfei，WANGJinming^*

（College of Veterinary Medicine，Shanxi Agricultural University，Taigu030801，China）

Abstract：This experiment aims to investigate the role of PINK1/Parkin-mediated mitochondrial autophagy in the alleviation of fluoride-induced depressive-like behavior by selenomethionine（Se-Met）.Forty BALB/c mice were selected and randomly divided into five groups：the blank control group（Group C），the fluorine group（NaF150mg·L^-1，Group F），the fluorine+low selenium group（NaF150mg·L^-1+1.5mg·L^-1，Group F+LSe），the fluorine+medium selenium group（NaF150mg·L^-1+3.0mg·L^-1，Group F+MSe），the fluorine+high selenium group（NaF150mg·L^-1+6.0mg·L^-1，Group F+HSe）.After90d of sodium fluoride exposure，the behavioral performance of mice was assessed by means of an elevated O-maze and hanging tail experiments; HE staining was used to evaluate the damage of the mouse cortex; biochemical kits were used to measure the content of oxidative stress-related indices; and real-time fluorescence quantitative PCR was utilized to determine the expression levels of mitochondrial autophagy-related genes.Animal behavioral results showed：the results indicated that mice in group Fhad asignificantly longer\"resting\"time in the tail suspension test compared to group C（Plt;0.05）and atendency to take more time to enter the closed arm of the elevated O-maze（Plt;0.05）.After Se-Met supplementation，the\"resting\"time of mice was reduced significantly（Plt;0.05），and the F+LSe and F+MSe mice took significantly less time to enter the closed arm（Plt;0.05），compared to the Fgroup.The results of the histopathological sections showed：the mice in group Fhad disorganized cortical cells，reduced cell volume，and fewer vertebral cells.Following Se-Met enhancement，the F+LSe group showed distinct nuclei and more uniform cytoplasm，and the improvement was notably more pronounced.The results of oxidative stress related indicators showed：group Fhad asignificantly higher level of reactive oxygen species（ROS）（Plt;0.05），and asignificantly reduced content of glutathione peroxidase（GSH-PX）（Plt;0.05），when compared to group C.Groups F+LSe，F(xiàn)+HSe，and F+MSe showed significantly lower levels of ROS（Plt;0.05）.Compared to group F，the ROS content was considerably lower（Plt;0.05），in groups F+LSe，F(xiàn)+HSe，and F+MSe，with the content decreasing in the order of F+LSelt;F+HSelt;F+MSe; the GSH-PX content，on the other hand，was significantly higher（Plt;0.05），in groups F+LSe and F+HSe，compared to group F.Results of mRNA expression levels of autophagy-related genes were shown：group Fshowed significantly higher mRNA expression levels of autophagy-related genes Parkin，PINK1，LC3，OPTN，NBR1，Drp1，and Fis1（Plt;0.05），compared to group C，and significantly lower mRNA expression levels of OPA1，Mfn1，and Mfn2（Plt;0.05）.Compared to group F，the mRNA expression levels of Parkin，PINK1，P62，NBR1，OPTN，and Fis1were significantly lower in the F+LSe and F+HSe groups（Plt;0.05），LC3，Parkin，P62and Drp1were significantly decreased in the F+LSe and F+MSe groups（Plt;0.05），OPA1was significantly increased（Plt;0.05），and the F+LSe group showed asignificant increase in the mRNA expression level of Mfn2（Plt;0.05）.In summary，1.5mg·L^-1of Se-Met can alleviate cortical oxidative stress by affecting the expression of mitochondrial autophagy-related genes，restoring the dynamic equilibrium state of mitochondrial fusion and fission，and thus ameliorating cerebral cortex damage and the emergence of depressive-like behaviors.

Key words：selenomethionine; fluoride; mitochondrial autophagy; cerebral cortex

*Corresponding author：WANG Jinming，E-mail：jm50408@163.com

氟作為人體必需微量元素之一，適量攝入時(shí)可促進(jìn)機(jī)體對(duì)鈣和磷的吸收，加快骨的生長(zhǎng)，預(yù)防齲齒^[1]。然而，長(zhǎng)期攝入過(guò)量的氟，不僅會(huì)造成氟斑牙和氟骨癥，對(duì)多種非骨相組織也存在毒性效應(yīng)。Wang等^[2]發(fā)現(xiàn)150mg·L^-1氟化鈉對(duì)慢性氟中毒患者的精神有不良影響，主要引起記憶和注意力受損、嗜睡和思維困難等。在小鼠的試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)100mg·L^-1氟化鈉攝入會(huì)導(dǎo)致小鼠行為異常，造成動(dòng)物出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙和智力缺陷，降低動(dòng)物的學(xué)習(xí)和記憶能力^[3]。近年來(lái)，氟化物對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)影響的相關(guān)研究以及防治策略已經(jīng)成為許多國(guó)家（特別是發(fā)展中國(guó)家）亟待解決的問(wèn)題。Duan等^[4]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠的慢性社會(huì)挫敗應(yīng)激模型（chronic social defeated stress，CSDS）導(dǎo)致線粒體損傷，從而觸發(fā)杏仁核中的PINK1-Parkin線粒體自噬途徑。PINK1/Parkin通路被認(rèn)為是線粒體自噬的重要途徑之一，主要參與受損線粒體的清除^[5]。但線粒體的過(guò)度自噬會(huì)使線粒體受損，導(dǎo)致線粒體功能障礙。有研究表明，氧化應(yīng)激引起的線粒體功能障礙會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡激活，從而導(dǎo)致抑郁癥。抑郁癥患者中線粒體DNA（mtDNA）缺失的頻率較高^[6]。而目前也已有研究發(fā)現(xiàn)氟可以產(chǎn)生過(guò)量活性氧（ROS），誘導(dǎo)線粒體裂變與融合之間的平衡，導(dǎo)致線粒體功能和形態(tài)異常^[7]。大量研究表明，氟暴露可導(dǎo)致小鼠淋巴細(xì)胞線粒體損傷和ROS積累，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)氟中毒可導(dǎo)致線粒體裂變與融合失衡和細(xì)胞內(nèi)ROS增加^[8-10]。

硒現(xiàn)在被廣泛認(rèn)為是大腦中必需的微量元素。試驗(yàn)證據(jù)表明，硒與神經(jīng)系統(tǒng)正常功能的維持密切相關(guān)^[11]。硒代蛋氨酸（selenomethionine，Se-Met）是一種低毒、高生物利用度的有機(jī)硒化合物，是機(jī)體吸收硒的重要化學(xué)形式^[12]。Se-Met發(fā)揮著關(guān)鍵的抗氧化、抗炎作用。前人的研究表明，一定劑量的硒可緩解氟中毒，抑制氟誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化，糾正氧自由基，改善氟所致大腦損傷的作用^[13]。王玉鑫等^[14]的研究表明Se-Met可通過(guò)抑制氧化應(yīng)激來(lái)拮抗氟對(duì)機(jī)體造成的損傷。Se-Met在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用不僅歸功于其抗氧化特性，有研究報(bào)道缺硒還可能會(huì)影響一些心理參數(shù)，補(bǔ)硒后發(fā)現(xiàn)其與情緒和抑郁狀態(tài)的改善有關(guān)^[15]。長(zhǎng)期缺硒會(huì)增加阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病的風(fēng)險(xiǎn)^[16]。Zhang等^[17-18]研究發(fā)現(xiàn)Se-Met治療12周能顯著提高阿爾茨海默病模型小鼠的認(rèn)知能力，降低淀粉樣蛋白-β（amyloid β-protein，Aβ）沉積水平，減輕氧化應(yīng)激和突觸損傷。不僅如此，雌性小鼠在給藥間三氟甲基-二苯基二硒化物后，抑郁狀況顯著減輕^[19]，以上這些表明Se-Met具有潛在的抗抑郁作用。而硒在抗抑郁中的機(jī)制研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)硒可以有效緩解阿爾茨海默病模型小鼠的線粒體功能障礙，恢復(fù)線粒體融合與分裂的動(dòng)態(tài)平衡^[20]。但目前關(guān)于Se-Met是否可以緩解氟中毒引起的大腦皮質(zhì)損傷以及與PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬之間是否存在聯(lián)系還鮮有報(bào)道。

因此，本研究將從動(dòng)物行為學(xué)試驗(yàn)、組織形態(tài)學(xué)觀察、氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)和線粒體自噬相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平等方面，通過(guò)PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬探究Se-Met緩解氟中毒小鼠的抑郁樣行為，為今后治療地方性氟中毒誘導(dǎo)的大腦皮質(zhì)損傷提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

硒代蛋氨酸（上海麥克林生物科技有限公司）；氟化鈉（NaF）（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）；蘇木精、伊紅（廣東臺(tái)山化工廠）；ROS試劑盒、過(guò)氧化氫酶（CAT）試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化氫酶（GSH-PX）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；RNAiso Plus、SYBR Green qPCR Master Mix、SYBR Green PCR kit（大連寶生物工程有限公司）

1.1.2 主要儀器

自動(dòng)雙重純水蒸餾器（上海亞榮生化器廠SZ-93型）；生物組織包埋機(jī)（KD-BM）、石蠟組織自動(dòng)切片機(jī)（KD-2508）（深圳永年科技有限公司）；BX51型成像顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；組織勻漿儀（德國(guó)IKA公司）；Mx3000P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)Stratagene公司）；PCR儀、酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；高速冷凍離心機(jī)（D-3752）（德國(guó)Sigma公司）；生物組織包埋機(jī)HY-BM1160（金華惠支儀器設(shè)備有限公司）；電子分析天平（AUY-120，日本島津）；Elevated zero maze行為學(xué)裝置和Tail suspension行為學(xué)裝置（沃瑞德（深圳）生物科技有限公司）

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

45只雄性3周齡BALB/c小鼠購(gòu)買于山西省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有動(dòng)物均飼養(yǎng)在溫度適宜，通風(fēng)良好的環(huán)境中。本試驗(yàn)所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試驗(yàn)設(shè)計(jì)均遵循山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查相關(guān)規(guī)定（審批編號(hào)：SXAU-EAW-2019M0601）。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)分組

45只3周齡BALB/c小鼠（體重（20±1）g）適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為5個(gè)組，分別為空白對(duì)照組（C組）、氟組（NaF150mg·L^-1[21]，F(xiàn)組）、氟+低硒組（NaF150mg·L^-1+1.5mg·L^-1，F(xiàn)+LSe組）、氟+中硒組（NaF150mg·L^-1+3.0mg·L^-1，F(xiàn)+MSe組）、氟+高硒組（NaF150mg·L^-1+6.0mg·L^-1，F(xiàn)+HSe組）。SeMet與NaF均通過(guò)飲水?dāng)z入。

1.2.2 樣品采集與處理

飼喂90d后，首先對(duì)健康小鼠進(jìn)行行為學(xué)試驗(yàn)，斷頸處死，取小鼠大腦皮質(zhì)組織，剝離小鼠顱骨，使其大腦完全暴露，用手術(shù)刀片切斷大腦和小腦連接處，再切開(kāi)左右大腦半球，即可暴露大腦皮質(zhì)組織，用鑷子從大腦側(cè)面輕輕剝離，即為大腦皮質(zhì)組織，每組取3只小鼠的大腦皮質(zhì)組織用4%多聚甲醛固定，用于病理組織學(xué)染色，剩余凍于-80 ℃保存，用于氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)和自噬相關(guān)基因的測(cè)定。

1.2.3 行為學(xué)試驗(yàn)

1.2.3.1 高架O型迷宮試驗(yàn)（elevated zero maze，EZM）：黑色O型迷宮離地面50cm，在離圓心40cm處由兩相對(duì)開(kāi)臂和兩相對(duì)閉臂區(qū)組成，附有立墻。每只小鼠提前一天訓(xùn)練5min，使其熟悉EZM環(huán)境。試驗(yàn)時(shí)將小鼠放入開(kāi)臂區(qū)中間，頭面向閉壁區(qū)，拍攝動(dòng)物5min內(nèi)的行為軌跡，記錄分析小鼠在開(kāi)放臂和閉合臂的時(shí)間。每只動(dòng)物在試驗(yàn)結(jié)束后需要清除糞便，并且用75%酒精噴灑底部。

1.2.3.2 懸尾試驗(yàn)（tail suspension test，TST）：小鼠懸尾裝置是一個(gè)頂上有掛鉤的木制盒。試驗(yàn)時(shí)將小鼠尾巴用膠帶粘住然后頭朝下同時(shí)掛在掛鉤上，保證其不會(huì)掉落，且頭離盒底要有一定距離，記錄其在5min中內(nèi)持續(xù)不動(dòng)的時(shí)間。

1.2.4 病理組織切片染色

取用4%多聚甲醛固定的大腦皮質(zhì)組織，24h后，流水沖洗，通過(guò)梯度酒精脫水、透明、浸蠟和包埋后進(jìn)行切片，厚度為5μm。制備好的組織切片經(jīng)過(guò)脫蠟、水化后用蘇木精染色；用1%鹽酸進(jìn)行分化，水洗返藍(lán)；加入伊紅染液進(jìn)行染色并充分水洗，經(jīng)梯度酒精脫水和二甲苯透明后，最后中性樹(shù)膠封片，顯微鏡觀察并拍照。

1.2.5 氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

每組分別取6只小鼠的大腦皮質(zhì)，按照1∶9（1g組織∶9mL PBS緩沖液）的比例加入PBS緩沖液，冰浴勻漿后4 ℃3000r·min^-1離心20min，取上清液。分別用ROS、CAT、GSH-PX生化試劑盒測(cè)定皮質(zhì)中氧化應(yīng)激水平，具體操作過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.6 自噬相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè)

每組分別取8只小鼠的大腦皮質(zhì)，采用Trizol法提取總RNA，進(jìn)行純度測(cè)定，并采用凝膠電泳檢驗(yàn)總RNA的完整性，檢測(cè)后的總RNA利用TaKaRa一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄后的cDNA以β-actin為內(nèi)參，用熒光定量PCR儀檢測(cè)自噬相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平。20μL反應(yīng)體系包括2×SYBR Green qPCR Master Mix10μL，上下游引物各0.4μL，ddH₂O7.2μL，cDNA2μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10min，循環(huán)反應(yīng)95℃15s和60℃30s，共40個(gè)循環(huán)，最后運(yùn)用2^－ΔΔCT方法進(jìn)行基因表達(dá)量的計(jì)算。根據(jù)發(fā)表在NCBI上的基因序列，采用Primer5在線軟件設(shè)計(jì)特異性引物，相關(guān)引物序列見(jiàn)表1。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)和分析采用SPSS26.0軟件進(jìn)行單因素方差（one-way ANOVA）分析和最小顯著差數(shù)法（LSD）多重比較，以Plt;0.05表示差異的顯著性，試驗(yàn)數(shù)據(jù)釆用“x-±s”表示。

2 結(jié) 果

2.1 高架O型迷宮試驗(yàn)

圖1結(jié)果顯示，F(xiàn)組小鼠在迷宮中進(jìn)入閉合臂的時(shí)間相比于C組有明顯升高趨勢(shì)（Plt;0.05），F(xiàn)+LSe和F+MSe組相比于F組小鼠進(jìn)入閉合臂的時(shí)間顯著減少（Plt;0.05）。

2.2 懸尾試驗(yàn)

懸尾試驗(yàn)結(jié)果（圖2）顯示，F(xiàn)組小鼠在懸尾試驗(yàn)中的“靜止”時(shí)間相比于C組顯著增加（Plt;0.05），與F組相比，F(xiàn)+LSe、F+MSe和F+HSe組小鼠“靜止”時(shí)間均顯著降低（Plt;0.05）。

2.3 小鼠大腦皮質(zhì)組織形態(tài)學(xué)變化

通過(guò)HE染色（圖3），發(fā)現(xiàn)C組小鼠皮層分隔清晰，細(xì)胞排列致密，細(xì)胞核清晰。與對(duì)照組比較，F(xiàn)組小鼠大腦皮質(zhì)層細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞體積縮小，椎體細(xì)胞數(shù)量減少，軸突變短（如圖3箭頭所示）。與F組相比，F(xiàn)+LSe組的核仁清晰，細(xì)胞質(zhì)更加均勻，椎體細(xì)胞數(shù)目增加；但F+MSe組和F+HSe組與F組比較雖然大腦皮質(zhì)組織受損狀況有所減輕，但與F組比較僅有F+LSe組改善效果顯著。

2.4 氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)結(jié)果

氧化應(yīng)激結(jié)果（圖4）顯示，與C組相比，F(xiàn)組ROS含量顯著升高（P＜0.05），GSH-PX含量顯著減少（P＜0.05）；與F組相比，F(xiàn)+LSe、F+HSe和F+MSe組ROS含量均顯著降低（P＜0.05），且含量依次表現(xiàn)為F+LSelt;F+HSelt;F+MSe；F+LSe和F+HSe組GSH-PX含量相比于F組顯著升高（P＜0.05）。CAT結(jié)果顯示均沒(méi)有顯著變化。

2.5 自噬相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平

自噬相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平結(jié)果（圖5）顯示，與C組相比，F(xiàn)組Parkin、PINK1、LC3、OPTN、NBR1、Drp1、Fis1的mRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），OPA1、Mfn1、Mfn2的mRNA表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），P62的mRNA表達(dá)水平?jīng)]有顯著變化。與F組相比，F(xiàn)+LSe組顯著降低Parkin、PINK1、LC3、OPTN、NBR1、P62、Drp1和Fis1的mRNA表達(dá)水平（P＜0.05），顯著升高OPA1、Mfn2的mRNA表達(dá)水平（P＜0.05）；F+MSe組顯著降低Parkin、NBR1、P62、LC3和Drp1的mRNA表達(dá)水平（P＜0.05），顯著升高OPA1的mRNA表達(dá)水平（P＜0.05）；F+HSe組顯著降低Parkin、PINK1、NBR1、P62、OPTN和Fis1的mRNA表達(dá)水平（P＜0.05）。經(jīng)Se-Met改善后Mfn1的mRNA表達(dá)水平?jīng)]有顯著變化。

3 討 論

氟化物和其他鹵族元素一樣，可通過(guò)血腦屏障進(jìn)入大腦。目前，已有的流行病學(xué)調(diào)查和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)了氟化物的神經(jīng)毒性作用^{[22，23]}。據(jù)報(bào)道，長(zhǎng)期飲用氟化物含量較高的水患癡呆癥的風(fēng)險(xiǎn)更高^[24]。氟化物引起的神經(jīng)毒性會(huì)導(dǎo)致機(jī)體活性氧的產(chǎn)生、線粒體受損和抗氧化酶能力下降^[25-26]。硒作為大腦中必需的微量元素之一，對(duì)大腦和神經(jīng)系統(tǒng)中參與抗氧化防御的硒蛋白的正常功能至關(guān)重要^[27]。試驗(yàn)證據(jù)表明，大腦中的硒水平隨著年齡的增長(zhǎng)而降低，并且這種降低與大腦的認(rèn)知障礙有關(guān)^[28]。Loef等^[16]發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期缺硒會(huì)增加阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。

EZM和TST都是評(píng)價(jià)焦慮狀態(tài)的經(jīng)典方法，在精神神經(jīng)藥理學(xué)基礎(chǔ)中應(yīng)用廣泛^[29]。EZM試驗(yàn)主要探索小鼠的心理活動(dòng)，正常小鼠會(huì)有探索心理而驅(qū)使它們向開(kāi)放區(qū)域運(yùn)動(dòng)，而有焦慮抑郁情緒的小鼠向開(kāi)放區(qū)探索的動(dòng)力會(huì)減弱。TST通過(guò)將試驗(yàn)動(dòng)物的尾部固定從而使其頭部向下懸掛，其在有限環(huán)境中四肢拼命掙扎但無(wú)法逃脫，之后四肢間斷性放棄掙扎，即為典型的“不動(dòng)狀態(tài)”，反映出了“行為絕望狀態(tài)”。本研究結(jié)果顯示150mg·L^-1的NaF引起小鼠焦慮抑郁樣行為的出現(xiàn)。1.5、3.0mg·L^-1的Se-Met都顯著減少了懸尾試驗(yàn)中的“靜止”時(shí)間和小鼠進(jìn)入閉合臂的時(shí)間，緩解了焦慮抑郁的行為。這提示Se-Met的抗抑郁效應(yīng)與劑量有一定相關(guān)性。與本試驗(yàn)一致的是，一種抗抑郁藥有機(jī)硒化合物同樣減輕小鼠在懸尾試驗(yàn)中的“靜止”時(shí)間^[30]。由于動(dòng)物組織結(jié)構(gòu)是其發(fā)揮具體功能的基礎(chǔ)，因此判斷小鼠抑郁樣行為的出現(xiàn)與其大腦皮質(zhì)組織結(jié)構(gòu)的變化存在著密切聯(lián)系。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)F組小鼠大腦皮質(zhì)出現(xiàn)空泡化，細(xì)胞排列紊亂，有壞死現(xiàn)象，與前人研究結(jié)果一致^[31]。經(jīng)Se-Met改善后，發(fā)現(xiàn)1.5mg·L^-1的Se-Met顯著減輕了大腦皮質(zhì)的損傷情況，使核仁清晰，細(xì)胞質(zhì)更加均勻，且椎體細(xì)胞數(shù)目增加。說(shuō)明低劑量的Se-Met緩解氟中毒導(dǎo)致的細(xì)胞損傷，可在一定程度上恢復(fù)氟造成的神經(jīng)細(xì)胞損傷。Zheng等^[32]研究發(fā)現(xiàn)，在補(bǔ)充Se-Met后，可明顯減輕阿爾茨海默病模型小鼠的神經(jīng)元損傷，增加神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)目，維持較為完整的細(xì)胞形態(tài)。大量研究表明，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致氟毒性效應(yīng)的關(guān)鍵機(jī)制^[33-34]，氟暴露使小鼠機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而導(dǎo)致過(guò)量的活性氧自由基及氧化應(yīng)激產(chǎn)物對(duì)小鼠大腦皮質(zhì)組織造成損傷，影響大腦皮質(zhì)功能。

氧化應(yīng)激作為引起氟中毒的重要作用機(jī)制之一，抗氧化物質(zhì)在其過(guò)程中顯得尤為重要。硒對(duì)氟抗氧化能力的影響已經(jīng)被很多學(xué)者研究。硒是機(jī)體內(nèi)谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活性中心，是合成抗氧化酶的必需元素^[35]。

酶抗氧化系統(tǒng)作為對(duì)抗氧化物質(zhì)的防線之一，可以拮抗氟誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。研究顯示，硒在體內(nèi)的含量可以影響機(jī)體GSH-PX、ROS、CAT等因子的活性^[36]。在本試驗(yàn)中也可看出有機(jī)硒可以緩解氟中毒小鼠大腦皮質(zhì)組織的氧化水平。F組GSH-PX含量相對(duì)C組顯著下降，ROS水平顯著升高，與F組相比，1.5mg·L^-1和6.0mg·L^-1的Se-Met顯著增加了GSH-PX含量。因此，本研究表明Se-Met顯著提升了小鼠機(jī)體內(nèi)的抗氧化能力，減少ROS的產(chǎn)生，而這也是Se-Met可保護(hù)大腦皮質(zhì)組織免受氟化物影響的重要原因之一。Wang等^[14]研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充0.15mg·kg^-1的Se-Met可以顯著提高GSH-PX的活性，改善氟中毒引起的氧化應(yīng)激。大量研究表明過(guò)量的ROS自由基和氧化應(yīng)激產(chǎn)物可引起組織損傷，進(jìn)而通過(guò)復(fù)雜的信號(hào)機(jī)制導(dǎo)致線粒體功能障礙，影響其正常的生理功能^[37-39]。

線粒體是高度動(dòng)態(tài)的細(xì)胞器，可根據(jù)細(xì)胞環(huán)境的變化進(jìn)行融合和裂變，并能通過(guò)PINK1和Parkin調(diào)控的線粒體自噬來(lái)確保線粒體周轉(zhuǎn)和受損線粒體的清除^[40]。正常情況下，PINK1含量極低，然而，當(dāng)線粒體受損時(shí)，PINK1進(jìn)入線粒體內(nèi)膜的路徑被阻斷，并聚集于線粒體外膜，將Parkin募集至受損線粒體。PINK1位于Parkin上游發(fā)揮作用，兩者協(xié)同調(diào)控線粒體自噬^[5]。本研究發(fā)現(xiàn)，1.5、3.0和6.0mg·L^-1的Se-Met均顯著下調(diào)了自噬相關(guān)基因Parkin和PINK1的mRNA的表達(dá)水平，其中1.5mg·L^-1Se-Met的改善效果相較于3.0和6.0mg·L^-1Se-Met的改善效果更好。研究表明，在PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬發(fā)生過(guò)程中，P62將優(yōu)先定位于鄰近線粒體之間，通過(guò)其PB1寡聚結(jié)構(gòu)域促進(jìn)受損線粒體的聚積^[41]。但在本研究中氟暴露后并沒(méi)有導(dǎo)致P62mRNA表達(dá)增加。有研究顯示敲除P62，對(duì)Parkin募集至線粒體這一過(guò)程并沒(méi)有影響，只是影響到對(duì)受損線粒體的最終清除。而NBR1是連接LC3與泛素蛋白的另一蛋白，與P62協(xié)同參與線粒體自噬過(guò)程^[42]。本研究發(fā)現(xiàn)，Se-Met顯著降低了NBR1的mRNA，1.5和3.0mg·L^-1的Se-Met顯著降低了LC3的mRNA表達(dá)水平。因此推測(cè)本試驗(yàn)中NBR1與P62協(xié)同參與自噬的過(guò)程，其中主要以NBR1為主。研究表明，OPTN是PINK1/Parkin介導(dǎo)線粒體自噬過(guò)程的主要受體，線粒體的有效清除需它們參與^[43]。本研究結(jié)果顯示1.5和6.0mg·L^-1的Se-Met顯著下調(diào)了OPTN的mRNA表達(dá)水平，使自噬恢復(fù)到正常水平。以上這些結(jié)果表明，1.5和6.0mg·L^-1的Se-Met可以緩解氟暴露導(dǎo)致PINK1/Parkin介導(dǎo)的線粒體自噬，進(jìn)而維持線粒體功能正常。氟中毒可引起線粒體功能障礙，部分原因是線粒體裂變與融合之間的平衡被破壞，導(dǎo)致線粒體形態(tài)發(fā)生變化，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體功能障礙^[44]。線粒體融合由三種GTPases調(diào)節(jié)，即線粒體外膜中的Mfn1和Mfn2以及內(nèi)膜中的OPA1^[45]。這個(gè)過(guò)程將相鄰的線粒體連接在一起，并合并它們的內(nèi)膜和外膜，最終形成一個(gè)線粒體。Drp1被轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體外膜以啟動(dòng)寡聚反應(yīng)，沿著線粒體外表面形成圍繞未來(lái)裂變位點(diǎn)的大環(huán)復(fù)合物^[46]。研究發(fā)現(xiàn)重度抑郁患者大腦中Drp1表達(dá)增加，而Mfn1、Mfn2和OPA1的mRNA表達(dá)減少^[47]。還有報(bào)道稱，Drp1表達(dá)的減少可減少阿爾茨海默病模型小鼠中寡聚淀粉樣蛋白-β（Aβ）的產(chǎn)生，減少線粒體功能障礙，維持線粒體動(dòng)力學(xué)，并增強(qiáng)線粒體生物發(fā)生和突觸活性^[47-48]。本研究發(fā)現(xiàn)1.5和3.0mg·L^-1的Se-Met顯著上調(diào)OPA1的mRNA表達(dá)，且顯著下調(diào)Drp1的mRNA表達(dá)，1.5和6.0mg·L^-1的Se-Met顯著下調(diào)Fis1的mRNA表達(dá)，1.5mg·L^-1的Se-Met顯著上調(diào)Mfn2的mRNA表達(dá)。Chen等^[20]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6mg·L^-1Se-Met顯著增加小鼠線粒體融合蛋白Mfn2的表達(dá)水平，并降低Drp1的表達(dá)水平，與本文結(jié)果相似。綜上所述，1.5mg·L^-1Se-Met可以更顯著緩解氟誘導(dǎo)的線粒體自噬，并恢復(fù)線粒體融合與分裂的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，進(jìn)而維持線粒體的正常功能。

4 結(jié) 論

1.5mg·L^-1Se-Met可通過(guò)影響線粒體自噬相關(guān)基因的表達(dá)，恢復(fù)線粒體融合與分裂的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，緩解大腦皮質(zhì)氧化應(yīng)激，從而改善大腦皮質(zhì)組織損傷和抑郁樣行為的出現(xiàn)。

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（編輯 白永平）