摘要：為了確定毛頭鬼傘基因組中漆酶基因Cc_lac21的“缺口”序列及可能的生理功能，本研究對其進行克隆和生物信息學分析，并以18S rDNA為內(nèi)參基因，檢測菌絲階段以及商品成熟階段子實體的菌蓋、菌柄頂端和菌柄基部Cc_lac21的表達水平。結(jié)果表明，Cc_lac21基因全長2 243 bp，含有12個內(nèi)含子、13個外顯子，編碼序列為1 452 bp，編碼483個氨基酸。Cc_Lac21為穩(wěn)定的親水性蛋白，N端前17個氨基酸為信號肽序列，分泌到胞外；二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲和延伸鏈為主；在28個絲氨酸（S）、21個蘇氨酸（T）和5個酪氨酸（Y）上可能發(fā)生磷酸化修飾；在第286位的蘇氨酸和第381位的絲氨酸處可能發(fā)生o-糖基化修飾；含有3個銅氧化蛋白結(jié)構(gòu)域，分別是2個銅氧化還原蛋白超家族（cupredoxin super family）和1個云芝Tv-LCC樣真菌漆酶的第三個銅氧化還原域（CuR0_3_Tv-LCC9）；與鱗白環(huán)蘑漆酶的親緣關系最近，包含3個基序。通過RT-qPCR分析發(fā)現(xiàn)，Cc_lac21在菌絲體階段和成熟菌柄基部表達量高，在菌蓋和伸長生長的菌柄頂端表達量低，推測Cc_lac21可能參與基質(zhì)木質(zhì)素的降解以及菌柄中菌絲細胞壁的成熟過程。本研究結(jié)果可為探究漆酶基因參與菌柄細胞壁成熟機制奠定基礎。

關鍵詞：毛頭鬼傘；漆酶基因Cc_lac21；生物信息學分析；表達分析

中圖分類號：Q781：S567.3 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2024）09-0013-09

毛頭鬼傘（Coprinus comatus）又稱“雞腿菇”，屬于擔子菌門鬼傘科鬼傘屬真菌，是一種優(yōu)良食藥兼用菌，對農(nóng)作物秸稈有較強的降解能力，能夠分泌包括漆酶（laccase，E.C.1.10.3.2）在內(nèi)的木質(zhì)纖維素水解酶。漆酶屬于多銅蛋白家族，因最早從日本漆樹（Rhus verniajluo）分離到而得名，廣泛存在于細菌、真菌、植物和昆蟲等各種生物體中，具有氧化多種芳香族和非芳香族化合物的能力，包括取代酚類化合物、一些無機離子和多種非酚類化合物，能對酚類物質(zhì)進行單電子氧化，并利用氧作為最終的電子受體，生成副產(chǎn)物水。相比于細菌漆酶，真菌漆酶具有更高的氧化還原電勢，生物學功能多樣，因而備受青睞。如：真菌漆酶可以降解酚類、非酚類木質(zhì)素相關化合物為高度耐降解的物質(zhì)，有利于酚類物質(zhì)清除：還可以對工業(yè)紡織廢水進行脫色和解毒，從而有助于廢水的生物修復。Clark等以昆蟲為反應器對真菌漆酶進行表達，實現(xiàn)了對工業(yè)污染物的原位生物修復。球孢白僵菌（Beauceria bassiana）漆酶BbLac2參與卵孢菌素合成，在逃避昆蟲免疫反應中扮演了多功能角色。柑橘漆酶CsLAC6可能與褐斑病的發(fā)生有關，其表達量上調(diào)對柑橘果皮褐斑的形成起促進作用。一色齒毛菌（Cerrena unicolor）漆酶Lac5具有較好的耐熱性且對黃曲霉毒素B1（AFB1）有良好的降解效果。此外，漆酶還參與真菌的生物合成、木質(zhì)素降解、子實體形態(tài)發(fā)生等過程。

隨著越來越多菌物基因組被解析，大量的食藥用真菌的漆酶基因被研究報道，如皺木耳（Auricularia delicata）、荷葉離褶傘（Lyophyllum decastes）、平菇（Pleutoms ostreatus）、杏鮑菇（Pteurotus eryngii）和松杉靈芝（Ganoderma tsugae）、楊樹菇（Agrocybe aegerita）、草菇（Volvariella volvacea）、云芝（Trametes versicolor）等。在毛頭鬼傘中，Bao等克隆了毛頭鬼傘漆酶基因lac1和lac2并在畢赤酵母中進行了異源表達，它們分別編碼517個和523個氨基酸：之后Gu等克隆了毛頭鬼傘的另外2個漆酶基因lac3和lac4，它們分別編碼547個和532個氨基酸。

但當前美國生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫中毛頭鬼傘的基因組數(shù)據(jù)ASM331602vl（登錄號：GCA_003316025.1）還是一個“草圖”結(jié)果，不僅缺少注釋信息，而且含有很多缺口，Contig N50值僅為17 206 bp，組裝質(zhì)量較差。前期基于此毛頭鬼傘基因組數(shù)據(jù)，我們預測到至少21個漆酶基因，包括Cc_lac21，但基因序列中有大量不確定的堿基信息，未能確定其氨基酸序列?；诖耍狙芯恐形覀冊O計特異性引物克隆Cc_lac21的全長序列，并填補“缺口”序列，然后對其開展生物信息學分析，并檢測其在毛頭鬼傘不同發(fā)育階段子實體不同部位中的表達情況，以期為闡明Cc_lac21在毛頭鬼傘生長發(fā)育過程中的生理功能以及開發(fā)利用毛頭鬼傘漆酶等奠定基礎。

1材料與方法

1.1菌株和引物

毛頭鬼傘QLKL-01菌株通過標本QLS20170822002（采自祁連山國家級自然保護區(qū)康樂自然保護站，東經(jīng)99.876709°，北緯38.905996°）組織分離獲得，現(xiàn)保藏于河西學院祁連山菌物活體組織庫。所有引物均由生工生物工程（上海）有限公司（簡稱生工生物公司）合成，其中，基因克隆引物（lac2/F：5’-ATGCTGTCCTCT-GCCCTCCT-3’：lac21R：5’-CTAGAA，ITCTGGAAGATAGTCAATATAGCTAG-3’）基于之前l(fā)ac21的生物信息預測序列使用Vazyme公司的CE Design軟件設計，RT-qPCR分析所需漆酶基因lac21引物（lac2/qF：5’-GACACAAGITITCCCACGCC-3’：/ac2/qR：5’- CAGTGGTCTCGCTGTTGTCT -3’）和內(nèi)參基因18S rDNA引物（18S rDNAF：5’- AAACGGCTACCACATCCA-3’；18SrDNAR：5’-CAC-CAGACITGCCCTCCA-3’）均采用NCBI PrimerBlast在線設計。