摘 要： 蒟蒻薯屬（Tacca）植物的分類一直存在很大的爭(zhēng)議，其中廣西裂果薯（Schizocapsa guangxiensis）被認(rèn)為應(yīng)與裂果薯（Tacca plantanginea）歸并為同一物種，但也有學(xué)者根據(jù)其形態(tài)差異劃分為不同的物種。為了明確廣西裂果薯與裂果薯的遺傳差異和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，該研究對(duì)廣西裂果薯進(jìn)行DNA高通量測(cè)序，利用生物信息軟件組裝了完整的葉綠體基因組，并與已發(fā)表的裂果薯葉綠體基因組進(jìn)行比較及系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明：（1）廣西裂果薯和裂果薯的葉綠體基因組大小分別為162 149 bp和160 749 bp，GC含量都是36.90%，兩者注釋后得到的基因種類和基因數(shù)目完全一致，包含89個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因、37個(gè)tRNA基因、6個(gè)rRNA基因。（2）密碼子的偏好性分析顯示，兩物種使用的密碼子頻率存在一定差異，但是都偏好以A/T（U）結(jié)尾的密碼子。（3）與裂果薯相比，廣西裂果薯的SSC邊界發(fā)生明顯的擴(kuò)張現(xiàn)象，是導(dǎo)致兩者葉綠體基因組長(zhǎng)度差異的主要因素。（4）廣西裂果薯與裂果薯在LSC和SSC區(qū)域內(nèi)存在一些序列分歧，尤其是基因間隔區(qū)，可用于開發(fā)物種特異性分子標(biāo)記。（5）系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果顯示，廣西裂果薯與裂果薯的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，盡管廣西裂果薯寄定在蒟蒻薯屬內(nèi)，但是它們屬于兩個(gè)不同的物種。該研究豐富了廣西裂果薯葉綠體基因組遺傳信息，為廣西裂果薯物種分類、遺傳多樣性分析和物種保護(hù)提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 廣西裂果薯， 蒟蒻薯屬， 葉綠體基因組， 遺傳差異， 系統(tǒng)發(fā)育分析

中圖分類號(hào)： Q943; Q949

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

文章編號(hào)： 1000-3142（2024）09-1707-14

Characterization of genetic difference and phylogenetic

relationship between Schizocapsa guangxiensis and

Tacca plantaginea based on chloroplast genome

Abstract： The taxonomy of Tacca remains is controversial all the time. Schizocapsa guangxiensis is considered to be the same species as Tacca plantanginea， but some taxonomists classify them into different species based on their morphological differences. In order to clarify the genetic differences and phylogenetic relationship between Schizocapsa guangxiensis and Tacca plantanginea， this study conducted high-throughput DNA sequencing of Schizocapsa guangxiensis， assembled a complete chloroplast genome using bioinformatics software， and compared it with the published Tacca plantanginea chloroplast genome. The results were as follows： （1） The chloroplast genome size of Schizocapsa guangxiensis and Tacca plantanginea was 162 149 bp and 160 749 bp， respectively， and they had the same GC content （36.90%）. Notably， the gene types and gene amount were exactly the same in these two species， including 89 protein-coding genes and 37 tRNA genes， and 6 rRNA genes. （2） Codon preference analysis showed that there were certain differences in the codon frequencies used by the two species， but they both prefered codons ending in A/T（U）. （3） Compared with T. plantanginea， the SSC boundary of Schizocapsa guangxiensis had obvious expansion， which was the main factor leading to the length variant in chloroplast genome between the two species. （4） There were some sequence divergences between S. guangxiensis and Tacca plantanginea in the LSC and SSC regions， especially the intergenic region， which can be exploited as species-specific molecular marker. （5） Phylogenetic results showed that Schizocapsa guangxiensis and Tacca plantanginea had a rather distant genetic relationship. Although Schizocapsa guangxiensis was placed in Tacca， they belong to two different species. This study enriches the genetic information of the chloroplast genome of S. guangxiensis and provides a theoretical basis for species classification， genetic diversity analysis and species protection of S. guangxiensis.

Key words： Schizocapsa guangxiensis， Tacca， chloroplast genome， genetic difference， phylogenetic analysis

蒟蒻薯屬（Tacca）是薯蕷科（Dioscoreaceae）中一個(gè)較小的屬，包含約15種植物，廣泛分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)。這些植物因含有豐富的天然活性成分，被廣泛用于治療各種疾?。ㄙZ敏如和李星煒，2005）。如裂果薯的根部含有豐富的箭根酮內(nèi)酯、皂苷和黃酮等化學(xué)成分，具有抗腫瘤、清熱解毒、理氣止痛和涼血散瘀的功效（孫悅文，2013）。此外，常被用于治療跌打損傷、急性腸胃炎和瘡瘍腫毒等疾?。ㄔ颇鲜∷幉墓荆?993）。此外，該屬植物的觀賞價(jià)值也很高，聚傘形的花序大而美麗，在園藝植物中廣受青睞。近年來，由于生境破壞、過度開采和氣候變化等因素，許多種類面臨著瀕危的風(fēng)險(xiǎn)（傅立國(guó)和金鑒明，1992）。因此，加強(qiáng)對(duì)其保護(hù)和可持續(xù)利用至關(guān)重要。然而，當(dāng)前對(duì)蒟蒻薯屬的研究主要集中在顯微鑒定、活性物質(zhì)分離、藥理藥效和組織培養(yǎng)等方面（王慧明等，2004; Liu et al.， 2006; Jiang et al.， 2014; 秦燕萍等，2023），關(guān)于其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、物種遺傳多樣性和種質(zhì)資源保護(hù)的相關(guān)研究仍然相對(duì)較少（Zhang et al.， 2011）。值得注意的是，蒟蒻薯屬植物的分類標(biāo)準(zhǔn)一直存在爭(zhēng)議，物種界定的差異很大。自1881年建立裂果薯屬（Schizocapsa）以來，學(xué)者圍繞著是否將裂果薯屬歸并到蒟蒻薯屬的問題爭(zhēng)論不休。Drenth（1972）認(rèn)為裂果薯屬不能另立一屬，因?yàn)殚_裂的果實(shí)特征不足以界定一個(gè)新屬。在國(guó)際植物學(xué)名錄中，裂果薯已被歸類到蒟蒻薯屬下，并且將廣西裂果薯（S. guangxiensis）與裂果薯（T. plantanginea）歸并為同一物種。然而，也有學(xué)者認(rèn)為廣西裂果薯和裂果薯是兩個(gè)不同的物種：葉薄紙質(zhì) vs. 葉紙質(zhì)；外輪花被片寬圓形，內(nèi)輪花被片比外輪花被裂片小l/2左右 vs. 外輪花被片披針形，內(nèi)輪花被片卵圓形，內(nèi)輪花被片比外輪花被裂片稍短而寬；蒴果3瓣裂至中部 vs. 蒴果3瓣裂至基部（Zhu， 2000）。此外，根據(jù)兩屬植物的染色體數(shù)目和葉表皮氣孔類型的差異，認(rèn)為裂果薯屬不能歸并到蒟蒻薯屬，而應(yīng)獨(dú)立出來為宜（凌萍萍和丁志遵， 1982; 凌萍萍，1985; 中國(guó)科學(xué)院生物多樣性委員會(huì)，2023）。隨著DNA條形碼技術(shù)的發(fā)展和日趨成熟，Zhang等（2011）使用ITS、atpA、rbcL、 trnH-psbA和trnL-F條形碼重構(gòu)蒟蒻薯屬物種的系統(tǒng)發(fā)育樹來推斷屬內(nèi)物種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，然而該研究缺乏廣西裂果薯樣本，未涉及解釋屬和種的歸并問題。

葉綠體是植物體內(nèi)具有獨(dú)立遺傳物質(zhì)的多功能細(xì)胞器，其基因組結(jié)構(gòu)高度保守，為典型的雙鏈環(huán)狀四分體結(jié)構(gòu)，即由一個(gè)大單拷貝區(qū)（large single copy，LSC）、一個(gè)小單拷貝區(qū)（small single copy，SSC）和兩個(gè)反向重復(fù)序列（inverted repeats，IRa和IRb）組成（Dobrogojski et al.， 2020）。不同植物葉綠體基因組之間的結(jié)構(gòu)差異主要體現(xiàn)在IR區(qū)的長(zhǎng)度和方向上的變化，這是導(dǎo)致基因組大小變化和單拷貝基因轉(zhuǎn)化為重復(fù)基因的主要因素（Mehmood et al.， 2020）。葉綠體基因組的基因按功能可以分為與光合作用相關(guān)基因、自身編碼基因和未知的開放閱讀框（Dobrogojski et al.， 2020）。由于生境條件各異，不同植物使用的密碼子偏好性也存在一定的差異（Zhou et al.， 2008）。與核基因組和線粒體相比，葉綠體基因組在結(jié)構(gòu)、基因數(shù)量和基因組成方面呈現(xiàn)出更高的保守性，其相對(duì)適中的進(jìn)化速率介于核基因組和線粒體基因組之間（CBOL Plant Working Group， 2009）。目前，已有多個(gè)葉綠體基因片段被開發(fā)用于物種鑒定、系統(tǒng)發(fā)育和群體遺傳多樣性的研究（CBOL Plant Working Group， 2009）。近年來，借助高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)葉綠體全基因組進(jìn)行分析，可以更加清晰地了解物種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、種群的遺傳結(jié)構(gòu)以及準(zhǔn)確鑒定近緣物種（Daniell et al.， 2021）。

本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)廣西裂果薯進(jìn)行葉綠體全基因組測(cè)序，結(jié)合公共數(shù)據(jù)庫中已公開發(fā)表的蒟蒻薯屬植物葉綠體基因組，擬探討以下問題：（1）通過葉綠體基因組比較揭示廣西裂果薯和裂果薯的遺傳差異程度；（2）通過構(gòu)建葉綠體基因組系統(tǒng)發(fā)育樹來推斷廣西裂果薯和裂果薯的親緣關(guān)系，為廣西裂果薯的歸并問題提供新的分子證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和數(shù)據(jù)來源

廣西裂果薯植物采集自廣西壯族自治區(qū)中國(guó)科學(xué)院廣西植物研究所。物種身份已經(jīng)過該單位陸昭岑助理研究員的準(zhǔn)確鑒定（圖1）。采集3片幼嫩葉片，用自來水沖洗干凈后保存于硅膠中干燥，用其提取總DNA。此外，我們通過NCBI數(shù)據(jù)庫（The National Center for Biotechnology Information）檢索并下載已公開發(fā)表的22個(gè)物種葉綠體基因組全長(zhǎng)序列，包括21個(gè)薯蕷科物種，分別是參薯 ［Dioscorea alata（OP 787126）］、異葉薯蕷 ［D. biformifolia（OQ 526002）］、D. brevipetiolata（NC 062811）、黃獨(dú) ［D. bulbifera（NC 039708）］、D. cayenensis（MZ 848368）、薯莨 ［D. cirrhosa（NC 065059）］、三角葉薯蕷 ［D. deltoidea（OQ 525993）］、D. depauperata（NC 062812）、龜甲龍 ［D. elephantipes（NC 009601）］、福州薯蕷 ［D. futschauensis（NC 039808）］、褐苞薯蕷 ［D. persimilis（NC 057257）］、D. praehensilis（NC 039837）、昆氏薯蕷 ［D. quinquelobata（NC 057067）］、D. sagittifolia（NC 039854）、善司芭潤(rùn)斯薯蕷 ［D. sansibarensis（NC 039838）］、綿萆薢 ［D. spongiosa（OQ 525998）］、山萆薢 ［D. tokoro（OQ 525999）］、盾葉薯蕷 ［D. zingiberensis（NC 027090）］、箭根薯 ［Tacca chantrieri（KX 171420）］、蒟蒻薯 ［T. leontopetaloides（NC 036658）］、裂果薯 ［T. plantanginea（MT 419421.1）］和1個(gè)外類群石蒜科物種蔥蓮 ［Zephyranthes bifida（NC 064147.1）］。

1.2 DNA提取和測(cè)序

采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取廣西裂果薯總DNA（Doyle & Doyle， 1987），分別使用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop-2000紫外分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific， USA）檢測(cè)DNA的質(zhì)量和濃度。利用Illumina HiSeq 2000平臺(tái)進(jìn)行雙端測(cè)序，測(cè)序讀長(zhǎng)為150 bp。利用FastaQ軟件過濾原始數(shù)據(jù)，除去多余的N序列、特異性接頭序列和過短序列，獲得總數(shù)據(jù)量為5 200.34 Mb的高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)（clean data）用于后續(xù)的葉綠體基因組組裝。

1.3 葉綠體基因組組裝和注釋

將上述獲得的clean data序列導(dǎo)入GetOrganelle v1.7.5.0軟件（Jin et al.， 2020）從頭進(jìn)行葉綠體基因組組裝，參數(shù)值設(shè)置為默認(rèn)值。將組裝結(jié)果文件.gfa導(dǎo)入Bandage 軟件中，對(duì)組裝完整度進(jìn)行可視化分析（Wick et al.， 2015）。使用在線葉綠體注釋平臺(tái)CPGAVAS2（http：//47.96.249.172：16019/analyzer/home）以裂果薯（MT 419421.1）為參照基因組，對(duì)葉綠體的蛋白質(zhì)編碼基因、tRNA和rRNA進(jìn)行注釋（Shi et al.， 2019）。使用GB2sequin檢查基因序列（Lehwark & Greiner， 2019），尤其是具有短外顯子和RNA編輯的起始密碼子基因，并手動(dòng)校正錯(cuò)誤的注釋。通過在線可視化工具OGDRAW（https：//chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/OGDraw.html）繪制葉綠體基因組圈圖（Greiner et al.， 2019）。完整的廣西裂果薯葉綠體基因組信息已上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫，登錄號(hào)為OR 805469。

1.4 密碼子使用偏好性分析

密碼子使用偏好性是物種遺傳變異和自然選擇而共同產(chǎn)生的結(jié)果。本研究利用CodonW v1.4.4軟件對(duì)葉綠體基因組的蛋白編碼基因進(jìn)行偏好性分析，并對(duì)相對(duì)同義密碼子使用度（relative synonymous codon usage， RSCU）進(jìn)行計(jì)算（Gupta et al.， 2004）。為了減少誤差，選擇蛋白質(zhì)編碼區(qū)長(zhǎng)度≥300 bp。通過R語言heatmap包對(duì)RSCU進(jìn)行可視化。當(dāng)RSCU值＞1時(shí)，表明該密碼子的使用頻率高于其他同義密碼子；當(dāng)RSCU值=1時(shí)，表明該密碼子無使用偏好性；當(dāng)RSCU值＜1時(shí)，表明該密碼子的使用頻率低于其他同義密碼子（王婧等，2019）。

1.5 重復(fù)序列分析

利用MISA在線分析網(wǎng)站（https：//webblast.ipk-gatersleben.de/misa）統(tǒng)計(jì)葉綠體基因組中的簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeats， SSR）（Beier et al.， 2017），參數(shù)采用默認(rèn)值，即單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的最小重復(fù)次數(shù)分別為10、8、4、3、3、4，SSR之間的最小距離設(shè)為100 bp。對(duì)于其他類型的散在重復(fù)序列，我們利用REPuter在線分析網(wǎng)站（https：//bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/reputer/manual.html）進(jìn)行鑒定，參數(shù)設(shè)置為最小重復(fù)序列 30 bp，漢明距離（Hamming distance）設(shè)置為3（Kurtz et al.， 2001）。

1.6 葉綠體基因組IR邊界比較和分歧區(qū)域鑒定

不同植物的葉綠體基因組在IR邊界區(qū)有不同程度的收縮和擴(kuò)張，是反映葉綠體基因組進(jìn)化特征的主要信息，其中反向重復(fù)區(qū)在穩(wěn)定葉綠體結(jié)構(gòu)方面發(fā)揮著重要作用。為了更清晰地展示廣西裂果薯和裂果薯葉綠體基因組的IR邊界差異信息，我們采用IRscope在線分析網(wǎng)站（https：//irscope.shinyapps.io/irapp/）對(duì)2個(gè)物種的葉綠體基因組邊界進(jìn)行可視化分析（Amiryousefi et al.， 2018）。對(duì)于序列分歧區(qū)的鑒定，我們利用mVISTA在線分析軟件（https：//genome.lbl.gov/vista/index.shtml）中的Shuffle-LAGAN模型，以裂果薯為參考物種，對(duì)廣西裂果薯和蒟蒻薯屬3個(gè)物種的葉綠體基因組進(jìn)行同源性比對(duì)（Frazer et al.， 2004）。

1.7 系統(tǒng)發(fā)育分析

本研究從NCBI數(shù)據(jù)庫下載已發(fā)表的22個(gè)葉綠體基因組全長(zhǎng)序列，包括21個(gè)薯蕷科物種和1個(gè)外類群物種（石蒜科蔥蓮）。使用PhyloSuite（V1.2.3）軟件中的MAFFTv7插件進(jìn)行序列比對(duì)和矩陣構(gòu)建，利用IQ-TREE 2以最大似然法（maximum likelihood， ML）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)（Minh et al.， 2021）。將得到的樹文件導(dǎo)入到FigTree軟件中進(jìn)行進(jìn)化系統(tǒng)樹優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 密碼子使用偏好性

植物在分化之前所使用的遺傳密碼子是相似的，在演化過程中由于基因突變和自然選擇而導(dǎo)致不同生境下的個(gè)體具有特定偏好的密碼子，最后分化成不同的物種（Romero et al.， 2000）。本研究利用生信云在線網(wǎng)站工具分析了廣西裂果薯和裂果薯葉綠體基因組的蛋白質(zhì)編碼序列相對(duì)同義密碼子使用度（RSCU）。結(jié)果顯示，廣西裂果薯葉綠體的蛋白質(zhì)編碼區(qū)總長(zhǎng)85 844 bp，共編碼54 049個(gè)密碼子，64種密碼子中，共編碼20種氨基酸，其中UAA、UAG、UGA為終止密碼子。廣西裂果薯和裂果薯編碼率最高的密碼子都是AGA（Arg，精氨酸），但裂果薯編碼率（2.03）比廣西裂果薯（1.96）的高（圖2）。廣西裂果薯和裂果薯使用密碼子偏好性最低的是CGC（Arg，精氨酸），使用度RSCU都為0.42。此外，二者使用的AUG（Met，蛋氨酸）和UGG（Trp，色氨酸）的RSCU都為1.00，表明沒有密碼子偏好性，但是其他大多數(shù)氨基酸都顯示出密碼子偏向。廣西裂果薯密碼子RSCU＞1共有30個(gè)，而裂果薯密碼子RSCU＞1共有31個(gè)，其中GGG（Gly，甘氨酸）在裂果薯中RSCU高于廣西裂果薯。二者密碼子RSCU ＞ 1并且第三位以A/T（U）結(jié)尾的密碼子同為28個(gè)，廣西裂果薯以G堿基結(jié)尾的只有1個(gè)（AGG），而裂果薯以G堿基結(jié)尾的有2個(gè)（AGG、GGG），二者以C堿基結(jié)尾的都為1個(gè)（UCC）。廣西裂果薯密碼子RSCU＜1共有29個(gè)，而裂果薯密碼子RSCU＜1共有28個(gè)，二者大多數(shù)密碼子都以C或G結(jié)尾，RSCU偏低（圖2）。以上分析結(jié)果表明，廣西裂果薯與裂果薯葉綠體基因組密碼子偏好使用都以A/T（U）結(jié)尾的密碼子，但是二者在密碼子使用度上存在差異。

2.2 重復(fù)序列分析

SSR是廣泛存在于葉綠體基因組中的重復(fù)序列，由于其重復(fù)類型和數(shù)量豐富、共顯性遺傳、實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)，常用于近緣物種鑒定和物種群體的遺傳多樣性分析（Bayliss et al.， 2004）。由圖3：A可知，從廣西裂果薯葉綠體基因組中鑒定了66個(gè)SSR位點(diǎn)，裂果薯中鑒定了58個(gè)。兩者的SSR類型有單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸和五核苷酸（圖3：B）。此外，單核苷酸A/T重復(fù)單元的比例最高，在廣西裂果薯中占總SSR種類的72.73%，在裂果薯中占總SSR種類的68.96%。五核苷酸重復(fù)最少，廣西裂果薯有2個(gè)，占總SSR種類的3.03%，裂果薯只有1個(gè)，占總SSR種類的1.72%（圖3：B）。二者都沒有檢測(cè)到六核苷酸。廣西裂果薯和裂果薯中A/T、AT/AT、AAT/ATT、AAAT/ATTT、AATT/AATT和AATAT/ATATT重復(fù)基序分別占總SSR的84.85%和86.21%（圖3：A），表明兩物種都偏好使用A和T堿基。

散在長(zhǎng)重復(fù)序列的鑒定結(jié)果顯示，廣西裂果薯的葉綠體中含有45個(gè)長(zhǎng)重復(fù)序列，包含21個(gè)回文重復(fù)序列、14個(gè)正向重復(fù)序列、6個(gè)反向重復(fù)序列、4個(gè)互補(bǔ)重復(fù)序列（圖4：A）。裂果薯具有48個(gè)重復(fù)，包含19個(gè)回文重復(fù)序列、17個(gè)正向重復(fù)序列、9個(gè)反向重復(fù)序列、3個(gè)互補(bǔ)重復(fù)序列（圖4：A）。這些重復(fù)序列主要位于蛋白質(zhì)編碼區(qū)。兩者的回文重復(fù)序列的長(zhǎng)度集中在30～60 bp之間（圖4：A），占長(zhǎng)重復(fù)序列種類的46.67%和39.58%（圖4：B）。

2.4 葉綠體基因組IR邊界分析

葉綠體基因組邊界的收縮與擴(kuò)增現(xiàn)象能夠揭示葉綠體基因組結(jié)構(gòu)變化和進(jìn)化過程（Yang et al.， 2023）。為了觀察廣西裂果薯IR區(qū)是否發(fā)生收縮或擴(kuò)張，我們對(duì)廣西裂果薯和已發(fā)表的3個(gè)蒟蒻薯屬物種箭根薯、蒟蒻薯和裂果薯進(jìn)行可視化分析（圖5）。4種植物葉綠體基因組均為環(huán)形四分體結(jié)構(gòu)，在LSC、IRb、IRa和SSC區(qū)域中可劃分為4個(gè)邊界，即LSC/IRb邊界、IRb/SSC邊界、SSC/IRa邊界和IRa/LSC邊界。rpl22、rps19、trnH、rpl2、ycf1和psbA等基因存在于LSC/IRb、IRb/SSC、SSC/IRa和IRa/LSC邊界的交界處。我們發(fā)現(xiàn)不同蒟蒻薯植物的葉綠體基因組邊界存在明顯的差異，不同長(zhǎng)度的rps19基因在4個(gè)物種中均位于LSC區(qū)，廣西裂果薯和裂果薯的rps19基因距離IRb/LSC邊界都為74 bp，而在箭根薯和蒟蒻薯中分別為8 bp和4 bp。在裂果薯和箭根薯中，ndhA基因橫跨IRb/SSC邊界，并向SSC區(qū)域分別延伸718 bp和794 bp，而廣西裂果薯和蒟蒻薯的ndhA基因橫跨IRa/LSC邊界，并分別向SSC區(qū)域延伸778 bp和838 bp。在廣西裂果薯和蒟蒻薯中，ndhF基因橫跨IRb/SSC邊界，并向IRb區(qū)分別延伸106 bp和90 bp，而裂果薯的ndhF基因橫跨IRa/SSC邊界并向IRa區(qū)延伸206 bp，只有箭根薯ndhF基因均在SSC區(qū)并距離IRa/SSC邊界29 bp。4個(gè)物種psbA基因均位于LSC區(qū)，并距離IRa/SSC邊界54～61 bp。以上結(jié)果表明，廣西裂果薯和裂果薯的LSC/IRb邊界和IRa/LSC邊界信息一致，主要的變異發(fā)生在IRb/SSC邊界和SSC/IRa邊界上，也是葉綠體基因組長(zhǎng)度存在差異的主要原因。

2.5 葉綠體基因組序列分歧鑒定

本研究通過mVISTA在線工具分析了廣西裂果薯和蒟蒻薯屬3個(gè)物種的葉綠體基因組序列的分歧位點(diǎn)。圖6結(jié)果顯示，廣西裂果薯與裂果薯、蒟蒻薯、箭根薯序列相似度較高。編碼區(qū)變異程度較低且在IRa和IRb 區(qū)無明顯變異，如ycf2、rrn23、ndhB、rps12、ndhH、trnV-GAC基因具有較高的保守性。但是，廣西裂果薯與其他3個(gè)物種相比，在非基因編碼區(qū)存在明顯的差異，其中LSC區(qū)和SSC區(qū)的多樣性和變異程度較高，如trnK-UUU-trnQ-UUG、trnS-GCU-trnG-UCC、atpF、atpH-atpI、rpoB-trnC-GCA、trnE-UUC-trnT-GGU、ndhC-trnV-UAC、rbcL-accD、ycf4、petA-psbJ、rpl14-rpl16、ndhA、ccsA和ndhD序列差異較大（圖6）。這些分歧程度高的位點(diǎn)可以開發(fā)為屬內(nèi)物種鑒定的分子標(biāo)記。

2.5 廣西裂果薯葉綠體基因組特征

廣西裂果薯葉綠體基因組物理譜圖為典型的環(huán)狀雙鏈四分體結(jié)構(gòu)（圖7），其中包括1個(gè)LSC區(qū)、1個(gè)SSC區(qū)和2個(gè)IR區(qū)。廣西裂果薯和裂果薯的葉綠體基因組全長(zhǎng)分別為162 149 bp和160 749 bp，兩者序列長(zhǎng)度差異為1 400 bp，總的GC含量都是36.90%。兩種植物的LSC長(zhǎng)度分別為84 541 bp和84 671 bp，SSC長(zhǎng)度分別為10 072 bp和8 318 bp，IR長(zhǎng)度分別為33 768 bp和33 880 bp（表1）。廣西裂果薯和裂果薯葉綠體基因組的基因種類和數(shù)目完全一致，注釋到132個(gè)基因，包括89個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因，37個(gè)tRNA基因和6個(gè)rRNA編碼基因（表1）。廣西裂果薯與光合作用相關(guān)的基因44個(gè)、自我復(fù)制相關(guān)的基因54個(gè)、其他基因功能相關(guān)的基因6個(gè)和未知功能相關(guān)基因5個(gè)（表2）。在這些基因中，ndhA、ndhB、atpF、rpoC1、rps12、rpl16、rpl2、trnA-UGC、trnE-UUC、trnK-UUU、trnL-UAA、trnT-CGU各含有1個(gè)內(nèi)含子，而基因ycf3、clpP各含有2個(gè)內(nèi)含子（表2）。

2.6 廣西裂果薯的系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過分析物種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，可以幫助我們理解物種間親緣關(guān)系和演化途徑。本研究將石蒜科蔥蓮屬蔥蓮作為外類群，結(jié)合廣西裂果薯和其他21個(gè)薯蕷科的物種，運(yùn)用最大似然法（ML）構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，得到了一致的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，22個(gè)薯蕷科物種主要分為3個(gè)分支：分支I（Clade I）和分支Ⅲ（Clade Ⅲ）為薯蕷科薯蕷屬（Dioscorea）、分支Ⅱ（Clade Ⅱ）為薯蕷科蒟蒻薯屬（Tacca）。廣西裂果薯與箭根薯以100%的支持率聚為了一個(gè)單支，表明這兩個(gè)物種的親緣關(guān)系最近，其次是100%支持率的蒟蒻薯和裂果薯（圖8），表明廣西裂果薯和裂果薯的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

3 討論與結(jié)論

在本研究中，我們組裝了廣西裂果薯的完整葉綠體基因組。廣西裂果薯葉綠體基因組具有典型的四分體結(jié)構(gòu)，與同科其他物種類似。通過比較已發(fā)布的蒟蒻薯屬物種葉綠體基因組，我們發(fā)現(xiàn)它們之間的基因種類和數(shù)量、順序、結(jié)構(gòu)和其他特征高度保守。[JP+2]廣西裂果薯和裂果薯偏好使用的密碼子頻率不一致。在非編碼區(qū)也存在一些分歧度較高的序列，可開發(fā)為屬內(nèi)物種鑒定的分子標(biāo)記?，F(xiàn)有的葉綠體基因組數(shù)據(jù)的系統(tǒng)發(fā)育分析證明廣西裂果薯與箭根薯關(guān)系最為密切。

通常高等植物的葉綠體基因組長(zhǎng)度在120～160 kb范圍內(nèi)，而廣西裂果薯和裂果薯的葉綠體基因組全長(zhǎng)分別為162 149 bp和160 749 bp，兩者序列長(zhǎng)度差異為1 400 bp。與其他被子植物類似，兩物種葉綠體基因組的IR區(qū)檢測(cè)到高GC含量，這可能是由于rRNA序列富含GC的結(jié)果。內(nèi)含子在基因選擇性剪接中起著至關(guān)重要的作用，然而也有一些物種在進(jìn)化過程中丟失了內(nèi)含子（Qian et al.， 2013）。本研究發(fā)現(xiàn)薯蕷科植物的葉綠體基因組在進(jìn)化過程中沒有丟失任何內(nèi)含子，暗示該科植物葉綠體基因組的蛋白質(zhì)編碼基因高度保守。密碼子使用偏好性能反映物種基因的起源、進(jìn)化和突變模式，對(duì)物種進(jìn)化和遺傳研究都有重要意義（Quax et al.， 2015）。通過對(duì)廣西裂果薯和裂果薯葉綠體密碼子統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，盡管精氨酸（Arg）是兩者使用最多的氨基酸，但是兩物種所使用的密碼子頻率不一樣，甚至其他密碼子的使用頻率也存在一定的差異，此結(jié)果對(duì)于探索它們?cè)谶M(jìn)化過程中所經(jīng)受的選擇壓力以及物種分化提供了理論依據(jù)。在優(yōu)選密碼子（RSCU>1）中，我們發(fā)現(xiàn)除了UUG之外，大多數(shù)密碼子以A或U結(jié)尾，但這并不是廣西裂果薯葉綠體基因組所獨(dú)有的，在單子葉植物水稻和玉米、雙子葉植物丹參和煙草中也觀察到了相似的現(xiàn)象（Qian et al.， 2013；Asaf et al.， 2016）。盡管同源基因在不同物種中具有相似的功能，但是不同物種在進(jìn)化過程中由于所處的生存條件差異很大，自然會(huì)偏好選擇適應(yīng)該環(huán)境的遺傳變異并固定下來，最終導(dǎo)致基因亞功能化而發(fā)生物種分化。根據(jù)RSCU的結(jié)果，我們認(rèn)為廣西裂果薯和裂果薯之間可能已經(jīng)發(fā)生物種分化。

SSR已被廣泛應(yīng)用于群體遺傳學(xué)、系統(tǒng)發(fā)育評(píng)估和近緣物種或品種的鑒定，是區(qū)分較低分類水平物種的重要分子標(biāo)記（Torokeldiev et al.， 2019）。我們發(fā)現(xiàn)葉綠體基因組的大多數(shù)SSR都位于SSC和LSC區(qū)域的非編碼區(qū)，占SSR總數(shù)的80%以上。在廣西裂果薯葉綠體基因組中檢測(cè)到66個(gè)SSR，但裂果薯只有58個(gè)。兩者都含有相同的重復(fù)類型，但在不同類型中的數(shù)量有所差異。在許多植物葉綠體基因組中，Poly （A/T）的SSR通常比其他SSR重復(fù)類型更常見，這類SSR主要位于非編碼區(qū)，通常代表種內(nèi)變異的重復(fù)次數(shù)，而二核苷酸及以上重復(fù)的SSR主要位于基因序列中，是基因功能發(fā)生變化最終形成新物種的動(dòng)力之一（Tuler et al.， 2015）。因此，本研究中檢測(cè)到的SSR位點(diǎn)可為廣西裂果薯遺傳多樣性水平分析和近緣物種鑒定提供新的分子標(biāo)記。散在長(zhǎng)重復(fù)序列也在基因組結(jié)構(gòu)變異和物種分化中發(fā)揮著重要作用（Cavalier， 2002）。大多數(shù)重復(fù)序列位于基因間隔區(qū)域，其次是編碼區(qū)域。本研究中，廣西裂果薯有21個(gè)回文重復(fù)序列、14個(gè)正向重復(fù)序列、6個(gè)反向重復(fù)序列、4個(gè)互補(bǔ)重復(fù)序列；而裂果薯具有19個(gè)回文重復(fù)序列、17個(gè)正向重復(fù)序列、9個(gè)反向重復(fù)序列、3個(gè)互補(bǔ)重復(fù)序列。由此可知，二者在散在長(zhǎng)重復(fù)序列的數(shù)目上有明顯的差異性，是兩物種遺傳物質(zhì)變異的分子證據(jù)。

雖然被子植物的葉綠體基因組在結(jié)構(gòu)和大小上相對(duì)保守，但是由于進(jìn)化事件引起的IR區(qū)域的擴(kuò)張和收縮會(huì)導(dǎo)致基因組的IR邊界和基因組大小發(fā)生微量變化，從而增加了被子植物葉綠體的遺傳多樣性（He et al.， 2017）。我們發(fā)現(xiàn)廣西裂果薯和蒟蒻薯屬物種的葉綠體基因組IR區(qū)長(zhǎng)度基本相似，尤其是IRb/LSC和IRa/LSC的邊界大致相同，主要差異發(fā)生在IRb/SSC和SSC/IRa邊界上，這是導(dǎo)致SSC區(qū)長(zhǎng)度發(fā)生變化的主要原因。在許多被子植物的葉綠體基因組中IRb區(qū)的ycf1基因經(jīng)常形成假基因化。然而，廣西裂果薯的IR區(qū)向SSC區(qū)發(fā)生明顯的擴(kuò)張現(xiàn)象，形成了完整的ycf1基因。IR區(qū)的擴(kuò)張也是導(dǎo)致廣西裂果薯葉綠體基因組變大的主要因素。此外，我們?cè)谏X蒻薯屬其他物種中也觀察到以上現(xiàn)象?；贗R區(qū)邊界分析結(jié)果，我們推測(cè)廣西裂果薯可能歸屬于蒟蒻薯屬。由于形態(tài)上的相似性，利用傳統(tǒng)的方法對(duì)近期分化的物種進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分具有非常高的挑戰(zhàn)性。對(duì)于某些特殊的物種，即使是使用標(biāo)準(zhǔn)DNA植物條形碼也無法區(qū)分，必要時(shí)，需針對(duì)特定物種開發(fā)物種特異性的分子標(biāo)記（Zhao & Woeste， 2011）?；趍VISTA比較分析，我們發(fā)現(xiàn)IR區(qū)域比LSC和SSC區(qū)域更加高度保守，并且編碼區(qū)域比非編碼區(qū)域保守性高，這與其他被子植物類似（Qian et al.， 2013）。廣西裂果薯葉綠體基因組中的LSC和SSC區(qū)域具有一些高水平變異序列，多數(shù)位于基因間隔區(qū)上。這些高度變異的區(qū)域可能具有解決該屬物種鑒定和構(gòu)建高分辨率系統(tǒng)發(fā)育樹的能力，可以作為候選的蒟蒻薯屬特異性DNA條形碼。

葉綠體基因組含有豐富的變異位點(diǎn)，作為植物鑒定的“超級(jí)條形碼”能通過基因的缺失和排列順序等方面來鑒定物種，在物種系統(tǒng)發(fā)育分析中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。大量研究表明，葉綠體基因組在近緣物種、居群及個(gè)體間均能實(shí)現(xiàn)高效鑒定，與傳統(tǒng)分子系統(tǒng)學(xué)研究相比，基于葉綠體全基因組序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹具有更高的支持率和分辨率（Daniell et al.， 2021）。根據(jù)傳統(tǒng)的形態(tài)分類，裂果薯屬已被歸入蒟蒻薯屬，并且《中國(guó)植物志》將廣西裂果薯歸并為裂果薯（中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì)，1985）。然而，2023版中國(guó)生物物種名錄中仍然將裂果薯屬作為獨(dú)立的一屬。在本研究中，我們檢索公共數(shù)據(jù)庫中可用的薯蕷科葉綠體基因組，并基于ML方法推斷廣西裂果薯和裂果薯的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，結(jié)果顯示廣西裂果薯和箭根薯聚為一支（支持率100%），而裂果薯以100%的支持率位于蒟蒻薯屬的基部，表明廣西裂果薯和裂果薯是兩個(gè)完全不同的物種。然而，有限的類群信息會(huì)導(dǎo)致不同的拓?fù)湎到y(tǒng)樹，為了可靠地推斷物種系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，我們有必要對(duì)蒟蒻薯進(jìn)行全面采樣?？傮w而言，廣西裂果薯完整的葉綠體基因組可為該屬和種的分類修訂提供新的分子依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

AMIRYOUSEFI A， HYVNEN J， POCZAI P， 2018. IRscope： an online program to visualize the junction sites of chloroplast genomes ［J］. Bioinformatics， 34（17）： 3030-3031.

ASAF S， KHAN AL， KHAN AR， et al.， 2016. Complete chloroplast genome of Nicotiana otophora and its comparison with related species ［J］. Front Plant Sci， 7： 843.

BAYLISS CD， DIXON KM， MOXON ER，2004. Simple sequence repeats （microsatellites）： mutational mechanisms and contributions to bacterial pathogenesis. A meeting review ［J］. FEMS Immunol Med Microbiol， 40（1）： 11-19.

BEIER S， THIEL T， MNCH T， et al.， 2017. MISA-web： a web server for microsatellite prediction ［J］. Bioinformatics， 33（16）： 2583-2585.

Biodiversity Committee， Chinese Academy of Sciences， 2023. Catalogue of Life China 2023 Annual Checklist ［M］. Beijing： Science Press. ［中國(guó)科學(xué)院生物多樣性委員會(huì)， 2023. 中國(guó)生物物種名錄（2023版） ［M］. 北京： 科學(xué)出版社.］

CAVALIER T， 2002. Chloroplast evolution： secondary symbiogenesis and multiple losses ［J］. Curr Biol， 12（2）： R62-R64.

CBOL Plant Working Group， 2009. A DNA barcode for land plants ［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 106（31）： 12794-12797.

Chinese Academy of Sciences Editorial Committee for Flora of China， 1985. Flora Reipublicae Popularis Sinicae： Volume 16. Part 1 ［M］. Beijing： Science Press. ［中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì)， 1985. 中國(guó)植物志： 第十六卷第一分冊(cè) ［M］. 北京： 科學(xué)出版社.］

DANIELL H， JIN S， ZHU XG， et al.， 2021. Green giant-a tiny chloroplast genome with mighty power to produce high-value proteins： history and phylogeny ［J］. Plant Biotechnol J， 19（3）： 430-447.

DOBROGOJSKI J， ADAMIEC M， LUCINSKI R， 2020. The chloroplast genome： a review ［J］. Acta Physiol Plantarum， 42： 1-13.

DOYLE JJ， DOYLE JL， 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue ［J］. Phytochemical Bull， 19： 11-15.

DRENTH E， 1972. A revision of the family Taccaceae ［J］. Blumea， 20： 367-406.

FRAZER KA， PACHTER L， POLIAKOV A， et al.， 2004. VISTA： computational tools for comparative genomics ［J］. Nucl Acids Res， 32（2）： W273-W279.

FU LK， JIN JM， 1992. China plant red data book： rare and endangerad plants： Part 1 ［M］. Beijing： Science Press： 642-643. ［傅立國(guó)， 金鑒明， 1992. 中國(guó)植物紅皮書-稀有瀕危植物： 第1冊(cè) ［M］. 北京： 科學(xué)出版社： 642-643.］

GREINER S， LEHWARK P， BOCK R， 2019. Organellar Genome DRAW （OGDRAW） version 1.3.1： expanded toolkit for the graphical visualization of organellar genomes ［J］. Nucl Acids Res， 47（W1）： W59-W64.

GUPTA SK， BHATTACHARYYA TK， GHOSH TC， 2004. Synonymous codon usage in Lactococcus lactis： mutational bias versus translational selection ［J］. J Biomol Struct Dyn， 21（4）： 527-536.

HE L， QIAN J， LI X， et al.， 2017. Complete chloroplast genome of medicinal plant Lonicera japonica： genome rearrangement， intron gain and loss， and implications for phylogenetic studies ［J］. Molecules， 22（2）： 249.

JIANG J， YANG H， WANG Y， et al.， 2014. Phytochemical and pharmacological studies of the genus Tacca： a review ［J］. Trop J Pharm Res， 13（4）： 635-648.

JIA MR， LI XW， 2005. Zhongguo Minzu Yaozhi Yao ［M］. Beijing： China Medical Science and Technology Press. ［賈敏如， 李星煒， 2005. 中國(guó)民族藥志要 ［M］. 北京： 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社.］

JIN JJ， YU WB， YANG JB， et al.， 2020. GetOrganelle： a fast and versatile toolkit for accurate de novo assembly of organelle genomes ［J］. Genome Biol， 21（1）： 241.

KURTZ S， CHOUDHURI JV， OHLEBUSCH E， et al.， 2001. REPuter： the manifold applications of repeat analysis on a genomic scale ［J］. Nucl Acids Res， 29（22）： 4633-4642.

LEHWARK P， GREINER S， 2019. GB2sequin — A file converter preparing custom GenBank files for database submission ［J］. Genomics， 111（4）： 759-761.

LING PP， DING ZZ， 1982. Two new species of Taccaceae from China ［J］. Acta Phytotaxon Sin， 20（2）： 201-204. ［凌萍萍， 丁志遵， 1982. 中國(guó)蒟蒻薯科二新種 ［J］. 植物分類學(xué)報(bào)， 20（2）： 201-204.］

LING PP， 1985. Flora Reipublicae Popularis Sinicae： Volume 16. Part 1 ［M］. Beijing： Science Press： 42-44. ［凌萍萍， 1985. 中國(guó)植物志： 第十六卷第一分冊(cè) ［M］. 北京： 科學(xué)出版社： 42-44.］

LIU HY， NI W， XIE BB， et al.， 2006. Five new withanolides from Tacca plantaginea ［J］. Chem Pharm Bull， 54（7）： 992-995.

MEHMOOD F， ABDULLA H， SHAHZADI I， et al.， 2020. Characterization of Withania somnifera chloroplast genome and its comparison with other selected species of Solanaceae ［J］. Genomics， 112（2）： 1522-1530.

MINH BQ， SCHMIDT HA， CHERNOMOR O， et al.， 2021. IQ-TREE 2： new models and efficient methods for phylogenetic inference in the genomic Era ［J］. Mol Biol Evol， 37（5）： 1530-1534.

QIAN J， SONG J， GAO H，et al.， 2013. The complete chloroplast genome sequence of the medicinal plant Salvia miltiorrhiza ［J］. PLoS ONE， 8（2）： e57607.

QIN YP， ZHANG XX， HE NT，et al.， 2023. Mechanism of anti-tumor effect of Saponin I of Schizocapsa plantaginea Hance on human pancreatic cancer cell PANC-1 transplanted in nude mice ［J］. J Guangxi Med Univ， 40（6）： 938-944. ［秦燕萍， 張璇璇， 何能婷， 等， 2023. 裂果薯皂苷Ⅰ抗人胰腺癌細(xì)胞PANC-1裸鼠移植瘤的作用機(jī)制研究 ［J］. 廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)， 40（6）： 938-944.］

QUAX TE， CLAASSENS NJ， SLL D， et al.， 2015. Codon bias as a means to fine-tune gene expression ［J］. Mol Cell， 59（2）： 149-161.

ROMERO H， ZAVALA A， MUSTO H， 2000. Codon usage in Chlamydia trachomatis is the result of strand-specific mutational biases and a complex pattern of selective forces ［J］. Nucl Acids Res， 28（10）： 2084-2090.

SHI L， CHEN H， JIANG M， et al.， 2019. CPGAVAS2， an integrated plastome sequence annotator and analyzer ［J］. Nucl Acids Res， 47（W1）： W65-W73.

SUN YW， 2013. Targeted screening anti-cancer from herbal medicine in Guangxi and the isolation and anti-caner research of steroidal saponins from Schizocapsa plantaginea Hance ［D］. Nanning： Guangxi Medical University. ［孫悅文， 2013. 廣西特色中草藥靶向抗腫瘤篩選及裂果薯皂苷的分離與抗腫瘤作用研究 ［D］. 南寧： 廣西醫(yī)科大學(xué).］

TOROKELDIEV N， ZIEHE M， GAILING O， et al.， 2019. Genetic diversity and structure of natural Juglans regia L. populations in the southern Kyrgyz Republic revealed by nuclear SSR and EST-SSR markers ［J］. Tree Genet Genomes， 15（1）： 501-512.

TULER AC， CARRIJO TT， NIA LR， et al.， 2015. SSR markers： a tool for species identification in Psidium （Myrtaceae） ［J］. Mol Biol Rep， 42： 1501-1513.

WANG HM， WEI JF， QIU MM， et al.， 2004. Characteristics and microscopic identification of Tacca plantaginea Hance ［J］. China Med Mat （10）： 724-725. ［王慧明， 韋家福， 丘明明， 等， 2004. 水田七的性狀與顯微鑒定 ［J］. 中藥材 （10）： 724-725.］

WANG J， WANG TY， WANG LY， et al.， 2019. Assembling and analysis of the whole chloroplast genome sequence of Elaeagnus angustifolia and its codon usage bias ［J］. Acta Bot Boreal-Occident Sin， 39（9）： 1559-1572. ［王婧， 王天翼， 王羅云， 等， 2019. 沙棗葉綠體全基因組序列及其使用密碼子偏性分析 ［J］. 西北植物學(xué)報(bào)， 39（9）： 1559-1572.］

WICK RR， SCHULTZ MB， ZOBEL J， et al.， 2015. Bandage： interactive visualization of de novo genome assemblies ［J］. Bioinformatics， 31（20）： 3350-3352.

YANG C， WANG K， ZHANG H， et al.， 2023. Analysis of the chloroplast genome and phylogenetic evolution of three species of Syringa ［J］. Mol Biol Rep， 50（1）： 665-677.

Yunnan Medicinal Herbs Company， 1993. Directory of traditional Chinese medicinal resources in Yunnan Province ［M］. Beijing： Science Press. ［云南省藥材公司， 1993. 云南中藥資源名錄 ［M］. 北京： 科學(xué)出版社.］

ZHANG L， LI HT， GAO LM， et al.， 2011. Phylogeny and evolution of bracts and bracteoles in Tacca （Dioscoreaceae） ［J］. J Integr Plant Biol， 53（11）： 901-911.

ZHAO P， WOESTE KE， 2011. DNA markers identify hybrids between butternut （Juglans cinerea L.） and Japanese walnut （Juglans ailantifolia Carr.） ［J］. Tree Genet Genomes， 7： 511-533.

ZHOU M， LONG W， LI X， 2008. Patterns of synonymous codon usage bias in chloroplast genomes of seed plants ［J］. For Stud China， 10： 235-242.

ZHU WZ， 2000. Flora of China： Vol. 24 ［M］. Beijing： Science Press; St. Louis： Missouri Botanical Garden Press： 274-275.