[摘要] 目的 探索不同相對分子質(zhì)量聚乳酸-聚乙醇酸共聚物（PLGA） 微囊包封骨形態(tài)發(fā)生蛋白2 （BMP-2）對成骨細(xì)胞骨形成能力的影響。方法 用雙通道微量注射泵制備包封BMP-2 的2 種相對分子質(zhì)量（12 000 和30 000） 的PLGA微囊。用光學(xué)顯微鏡及掃描電子顯微鏡（SEM） 觀察微囊形態(tài)結(jié)構(gòu)；磷酸鹽緩沖溶液浸泡法表征微囊緩釋性能；細(xì)胞Calcein-AM/PI 染色及CCK-8 法檢測微囊細(xì)胞相容性；Transwell 遷移實驗檢測包封BMP-2 的微囊作用48 h 對MC3T3-E1 細(xì)胞的趨化作用；堿性磷酸酶活力測定、茜素紅染色法檢測微囊作用MC3T3-E1 細(xì)胞后對細(xì)胞骨形成能力的影響。結(jié)果 2 種相對分子質(zhì)量的微囊均表面光滑，具有良好的細(xì)胞相容性。相對分子質(zhì)量12 000 的微囊的趨化作用最佳。相對分子質(zhì)量30 000 的微囊較相對分子質(zhì)量12 000 的微囊緩釋時間長，且初始爆發(fā)量減少了約25%。成骨誘導(dǎo)14、21 d 后，相對分子質(zhì)量30 000 的微囊形成的鈣沉積結(jié)節(jié)較相對分子質(zhì)量12 000 的微囊多。結(jié)論 本研究通過調(diào)控PLGA的相對分子質(zhì)量控制BMP-2 的釋放，發(fā)現(xiàn)相對分子質(zhì)量30 000 的微囊能夠更好地誘導(dǎo)MC3T3-E1 細(xì)胞的長期骨形成能力。

[關(guān)鍵詞] 聚乳酸-聚乙醇酸共聚物微囊； 骨形態(tài)發(fā)生蛋白2； 成骨

[中圖分類號] R318.08 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2024075

組織工程支架能夠支持和促進細(xì)胞生長，是當(dāng)前組織缺損修復(fù)最重要的干預(yù)方法[1]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白2 （bone morphogenetic protein 2，BMP-2）是一種在骨和軟骨發(fā)育、修復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)化生長因子，常被添加于骨組織工程支架中[2]，已被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)在骨科和牙科中臨床應(yīng)用[2-3]。但是，BMP-2 的大劑量應(yīng)用不僅價格昂貴，還會導(dǎo)致異位骨化、炎癥反應(yīng)、軟組織水腫、破骨細(xì)胞活化等嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生。同時，BMP-2 在體內(nèi)會快速降解，半衰期短[4-5]。研究[3]表明，BMP-2 至少需在數(shù)周的時間段內(nèi)保持最小劑量水平才能有效[6-7]。針對此情況，目前最常見解決方式是通過能夠緩釋藥物的支架來局部遞送BMP-2。

支架是用來支持細(xì)胞生長的結(jié)構(gòu)，常見形式包括多孔的3D 基質(zhì)、水凝膠、球體和纖維網(wǎng)[1]。支架材料主要有金屬、陶瓷、聚合物等。其中聚乳酸-羥基乙酸共聚物［poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA］ 這種合成聚合物具有良好的生物相容性，已獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局的生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用批準(zhǔn)。PLGA是一種可生物降解的脂肪族無定形聚合物，由乳酸（lactic acid，LA） 和乙醇酸（glycollic acid，GA） 兩種單體聚合而成，其LA∶GA配比、相對分子質(zhì)量、分子鏈端基類型等都可以影響其降解速率[8-9]。Wei 等[2]通過將BMP-2 負(fù)載于介孔羥磷灰石微球和PLGA組成的復(fù)合支架中使BMP-2 緩釋，該支架與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bonemarrow mesenchymal stem cells，BMSCs） 共培養(yǎng)，實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)表明BMP-2 緩慢、長期釋放有利于成骨相關(guān)標(biāo)志物的長期高表達(dá)。

目前通過支架遞送BMP-2 的方式主要包括與支架共價結(jié)合、在支架中被非共價固定、包封在支架中等。其中，將BMP-2 包封于顆粒中這種方式，由于可以將BMP-2 在釋放前與體內(nèi)環(huán)境隔離，已經(jīng)成為研究的一個熱點[4]。但是，目前用于緩釋生長因子的支架存在突釋嚴(yán)重、釋放時間短的缺點[3]。因此，制備一種能夠減少突釋，在未釋放前將生長因子與體內(nèi)環(huán)境隔離，并能夠盡可能長時間維持其生物活性的支架，是現(xiàn)在研究的熱點。本研究基于BMP-2 緩釋的目的，使用PLGA 微囊包封BMP-2，并對2 種不同相對分子質(zhì)量（12 000和30 000） 微囊中BMP-2 的釋放速率及其對成骨細(xì)胞骨形成能力的影響進行探討。

1 材料和方法

1.1 PLGA微囊的制備

取8 g 聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA） 溶于400 mL 去離子水，制備成2%的PVA 溶液。將PVA 溶液與磁力攪拌子一起盛于500 mL 燒杯中，置于磁力攪拌器［MS-H-Pro+，大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京） 有限公司］ 上備用。取1 g PLGA溶于10 mL二氯甲烷，配置成10%的PLGA溶液，置于50 mL 注射器中。將需要包封的內(nèi)容物溶液裝入20 mL注射器，包封的內(nèi)容物有去離子水、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 溶液（Bio‐Froxx 公司， 德國）、BMP-2 溶液（500 ng/mL）（蘇州近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司） [10-11]，根據(jù)實驗需要選擇。將裝有PLGA溶液的注射器與裝有需要包封的內(nèi)容物溶液的注射器分別安裝到雙通道微量注射泵（SP-2000，寧波安諾醫(yī)療器械科技有限公司） 的A、B 通道，調(diào)整A、B 通道注射速度分別為580、80 mL/h，連接同軸針頭的外針和內(nèi)針入口，將同軸針頭置于PVA 溶液液面以下，調(diào)整磁力攪拌器轉(zhuǎn)速，190、270 r/min 分別對應(yīng)相對分子質(zhì)量為12 000、30 000 的PLGA溶液。注射器排氣后開始注射。注射結(jié)束后，將針頭從PVA溶液中取出。攪拌8～12 h 后，靜置燒杯，使PLGA微囊沉淀，隨后棄去大部分上清液，加入去離子水清洗3 遍，冷凍干燥12 h。

1.2 PLGA微囊的形態(tài)觀察及粒度分析

通過掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM） 在10 kV電壓下觀察微囊的形態(tài)。通過光學(xué)顯微鏡觀察微囊形態(tài)，拍照記錄后用ImageJ測量微囊的粒徑（n=300）。

1.3 PLGA微囊的包封率檢測

制備PLGA微囊時，在去上清液前，從燒杯中取出2 mL PVA溶液，加入0.5 g 固體無水硫酸鈉，渦旋10 min，然后以4 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心10 min。上清液中含有未被包裹在微囊內(nèi)的BSA，用超微紫外分光光度計（NanoDropOne，ThermoFisher‐Scientific 公司，美國） 檢測上清液中的BSA 濃度（Cx）。假設(shè)用于包封去離子水微囊的PVA溶液的BSA 濃度為基礎(chǔ)濃度（C0），通過Cx 減去C0 來計算PVA 溶液中未被包裹的BSA 的實際濃度。使用下列公式計算包封率：Ma （mg） = （Cx?C0）×400 （mL）；包封率（%） =Mi-Ma/Mi×100% 。其中，Mi 為制備內(nèi)容物為BSA溶液的微囊時總共使用的BSA的量，Ma 為實際流失在PVA溶液中的BSA的總量。

1.4 磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer solution，PBS） 浸泡法表征微囊緩釋性能

稱取2 種相對分子質(zhì)量（12 000 和30 000）、包封內(nèi)容物分別為BSA 和去離子水的PLGA 微囊50 mg，浸入100 μL PBS （pH=7.4） 中，并在37 ℃恒溫振蕩器（ZQZY-78AV，上海知楚儀器有限公司） 中以200 r/min 振蕩。用超微量紫外分光光度計測定包封BSA微囊的PBS 中的BSA濃度，并將該量設(shè)為Cx，每5 d 更換一次新鮮的PBS。假設(shè)包封去離子水微囊的PBS 中的BSA濃度為基礎(chǔ)濃度（C0）。使用下列公式計算實際釋放的BSA 量（Mt）：Mt （μg） = （Cx?C0）×100 （μL）；使用下列公式計算BSA 的實際釋放率（release rate，RR）：RR （%） =Mt/Me×100% 。其中，Me 為50 mg 微囊中BSA的總量。

1.5 細(xì)胞Calcein-AM/PI 染色及CCK-8 法檢測微囊細(xì)胞相容性

分別將2 種相對分子質(zhì)量（12 000 和30 000）包封BMP-2 的PLGA 微囊40 μL 加入24 孔板中，紫外照射2 h 進行滅菌，PBS 清洗一遍，然后將微囊浸泡在1 mL 完全培養(yǎng)基中24 h 進行預(yù)培養(yǎng)。以不加任何刺激的孔為空白對照組。將MC3T3-E1 細(xì)胞按5×104 個/孔的密度接種到孔板中，于37 ℃、5%CO2和100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每2 d 更換一次培養(yǎng)液，5 d 后用Calcein-AM/PI 細(xì)胞活性與細(xì)胞毒性檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司） 按照說明書對細(xì)胞進行染色，倒置熒光顯微鏡（Leica 公司，德國） 下觀察染色結(jié)果。

分別將2 種相對分子質(zhì)量（12 000 和30 000）包封去離子水或BMP-2 的PLGA微囊20 μL加入96孔板中，紫外照射2 h 進行滅菌，PBS 清洗一遍，然后將微囊浸泡在完全培養(yǎng)基（含10%FBS 和1%青霉素/鏈霉素） 中24 h 進行預(yù)培養(yǎng)。以不加任何刺激的孔為空白對照組。將MC3T3-E1 細(xì)胞接種到孔板中（接種密度5 000 個細(xì)胞/孔），于37 ℃、5%CO2和100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每2 d 更換一次培養(yǎng)基。在第1、3、5、7 天分別吸除舊培養(yǎng)基，向每孔中加入150 μL 含10%CCK-8 溶液（APExBIO 公司，美國） 的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，避光孵育2 h 后吸取100 μL 液體置于另一96 孔板，使用酶標(biāo)儀（SpectraMax M2e，Molecular Devices 公司，美國） 于450 nm 波長下檢測光密度（opticaldensity，OD）。

1.6 Transwell 遷移實驗檢測細(xì)胞趨化

制備緩釋微囊： 分別將2 種相對分子質(zhì)量（12 000 和30 000） 包封BMP-2 的PLGA 微囊加入24 孔板中，加入1 mL PBS，37 ℃恒溫振蕩器以200 r/min 的轉(zhuǎn)速振蕩3 d 后吸除上清液，PBS 清洗一遍，凍干，設(shè)為BMP-2 scaffolds （sustained release）組，即BMP-2 scaffolds SR組。

取20 μL 緩釋微囊加入24 孔板的Transwell 小室的下室，另取2 種相同量未緩釋微囊（即按照1.1 制備的包封BMP-2 的PLGA 微囊） 加入另外的孔中進行對照，設(shè)為BMP-2 scaffolds （non-sustained-release） 組，即BMP-2 scaffolds 組。

所有樣品紫外照射2 h 滅菌后，PBS 清洗一遍，并加入1 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)24 h。第2天吸除舊培養(yǎng)基，PBS清洗一遍，在下室中加入700 μL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，上室中加入200 μL 基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸后的MC3T3-E1 細(xì)胞，接種密度為2×105個/室。每組設(shè)置3 個復(fù)孔。培養(yǎng)48 h 后使用4% 多聚甲醛（Biosharp，北京蘭杰柯科技有限公司） 固定細(xì)胞，并用棉球小心擦去上室細(xì)胞，使用結(jié)晶紫染色液（上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司） 對下室細(xì)胞進行染色，并在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移結(jié)果。隨后對下室細(xì)胞進行半定量分析，在小室中加入700 μL 33%冰乙酸，37 ℃靜置20 min，使下室結(jié)晶紫充分溶解，在595 nm 波長處檢測OD值。

1.7 微囊的堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）活力測定

按照1.6 中的方法制備緩釋微囊，分別取2種相對分子質(zhì)量（12 000 和30 000） 的緩釋微囊40 μL 加入6 孔板中，設(shè)為BMP-2 scaffolds SR 組。取2 種相同量未緩釋微囊（即按照1.1 制備的包封BMP-2 的PLGA 微囊） 加入另外的孔中， 設(shè)為BMP-2 scaffolds 組，并設(shè)置一個不加任何刺激的孔作為空白對照組。所有樣品紫外照射2 h 滅菌后，PBS 清洗一遍，加入2 mL 完全培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)24 h。

將MC3T3-E1 細(xì)胞以3×105個/孔的密度接種于6 孔板。當(dāng)細(xì)胞密度為70%時，用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)細(xì)胞成骨分化，培養(yǎng)基的配制成分為α-MEM+10%FBS+1%青鏈霉素+10 mmol/L β-甘油磷酸鈉+0.2 mmol/L 抗壞血酸+100 nmol/L 地塞米松。每2～3 d 更換1 次培養(yǎng)基，培養(yǎng)7 d 后，冰上吸棄各組舊培養(yǎng)基，PBS 洗2 遍。用RIPA 裂解液（上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司） 提取總蛋白，BCA蛋白測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司） 定量，按照AKP 試劑盒（南京建成生物工程研究所） 說明書測定各組樣本的AKP 活力。

1.8 浸提液誘導(dǎo)成骨分化

制備緩釋微囊的浸提液：分別將2 種相對分子質(zhì)量（12 000 和30 000） 包封BMP-2 的PLGA微囊200 mg 放入2 mL 凍存管中，紫外照射2 h 滅菌，PBS 清洗1 遍。加入1 mL 完全培養(yǎng)基，密封后置于37 ℃恒溫振蕩器上以200 r/min 振蕩3 d，吸去舊培養(yǎng)基，PBS 清洗1 遍，加入1 mL 新鮮的完全培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫振蕩器上以200 r/min 振蕩。此后每72 h 靜置凍存管內(nèi)液體并提取上清液，以1∶20 的比例加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。之后加入1 mL 新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)振蕩。將該種培養(yǎng)液培養(yǎng)的細(xì)胞設(shè)為BMP-2 scaffolds （sustained release）組，即BMP-2 scaffolds SR組。

制備未緩釋微囊的浸提液：稱取2 種相對分子質(zhì)量（12 000和30 000） 包封BMP-2 的微囊200 mg于凍存管中，紫外照射2 h 滅菌，PBS 清洗一遍，加入1 mL完全培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫振蕩器上以200 r/min 振蕩。此后每72 h 靜置凍存管內(nèi)液體并提取上清液，以1∶20 的比例加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。之后加入1 mL 新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)振蕩。

將該種培養(yǎng)液培養(yǎng)的細(xì)胞設(shè)為BMP-2 scaffolds（non-sustained-release） 組，即BMP-2 scaffolds 組。將MC3T3-E1 細(xì)胞以3×105個/孔的密度接種于6 孔板。當(dāng)細(xì)胞生長至70%匯合狀態(tài)時，對照組用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，實驗組用上述方法制成的浸提液培養(yǎng)基誘導(dǎo)成骨分化，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分為α-MEM+10%FBS+1%青鏈霉素+10 mmol/L β-甘油磷酸鈉+0.2 mmol/L 抗壞血酸+100 nmol/L 地塞米松。每3 d 更換一次培養(yǎng)基。

1.9 微囊浸提液的AKP 活力測定

按照1.8 中的方法培養(yǎng)MC3T3-E1 細(xì)胞，培養(yǎng)7 d 后，冰上吸棄各組舊培養(yǎng)基，PBS 洗2 遍。用RIPA裂解液提取總蛋白，BCA蛋白測定試劑盒定量，按照AKP 試劑盒說明書測定各組樣本的AKP活力。

1.10 茜素紅染色

按照1.8 中的方法培養(yǎng)MC3T3-E1 細(xì)胞，成骨誘導(dǎo)14、21 d 后，用1%茜素紅S 染色液（pH4.2）（北京雷根生物技術(shù)有限公司） 進行礦化檢測。檢測完畢后使用2%氯化十六烷基吡啶溶液（上海阿拉丁生化科技股份有限公司） 孵育30 min，使用酶標(biāo)儀在562 nm波長處檢測OD值。

1.11 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 26 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示數(shù)據(jù)，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t 檢驗，Plt;0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PLGA微囊的形態(tài)及粒度

制備的PLGA微囊形態(tài)及粒度表征見圖1，結(jié)果顯示：PLGA微囊表面光滑，大多數(shù)粒徑集中在80～160 μm，相對分子質(zhì)量30 000 的PLGA微囊粒徑較相對分子質(zhì)量12 000 的微囊粒徑略大。

2.2 微囊的包封率

相對分子質(zhì)量為12 000 和30 000 的PLGA微囊的包封率分別為24.52%±1.53%、46.32%±6.07%。統(tǒng)計分析表明，相對分子質(zhì)量為30 000 的微囊包封率高于相對分子質(zhì)量為12 000 的微囊，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.004）。

2.3 微囊的緩釋性能

2 種相對分子質(zhì)量PLGA制備的包裹BSA溶液的微囊釋放性能見圖2，結(jié)果顯示：這2 種微囊均可以持續(xù)釋放BSA，且第1 天都表現(xiàn)出了初始爆發(fā)性釋放。其中，相對分子質(zhì)量12 000 的微囊第1 天釋放率接近55%，10 d后釋放速率顯著減緩，第25天時幾乎檢測不到BSA的釋放，累積釋放率已達(dá)到90%；相對分子質(zhì)量30 000 的微囊第1 天釋放率約為30%，其后緩慢持續(xù)釋放，第35 天仍能檢測到BSA 的釋放，累積釋放率約為50%。與相對分子質(zhì)量12 000 的微囊相比，相對分子質(zhì)量30 000的微囊的緩釋時間更長，且初始爆發(fā)量減少了約25%。

2.4 細(xì)胞相容性

Calcein-AM/PI 染色（圖3A） 顯示，加入PLGA微囊的實驗組與空白對照組細(xì)胞均能正常增殖，并且實驗組細(xì)胞可以黏附到PLGA微囊表面，使PLGA微囊的輪廓變亮。相對分子質(zhì)量12 000 的微囊降解速率較快，降解后黏附于孔板底部，相對分子質(zhì)量30 000 的微囊在第5 天時僅有少部分黏附于底部。CCK-8 結(jié)果（圖3B、C） 顯示了空白對照組以及加入PLGA微囊的實驗組1、3、5、7 d的細(xì)胞活力，可見實驗組成骨細(xì)胞有隨時間增殖的趨勢，2 種不同相對分子質(zhì)量的PLGA微囊對成骨細(xì)胞均具有良好的生物相容性。

2.5 細(xì)胞趨化

各組下室細(xì)胞染色以及半定量結(jié)果（圖4） 顯示： BMP-2 scaffolds/12 000 組的趨化作用最佳（Plt;0.05），能吸引更多細(xì)胞向其遷移。

2.6 微囊的AKP 活力

在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d 后，AKP 活性測定結(jié)果（圖5 左） 顯示，BMP-2 scaffolds/12 000 組相對AKP 活力最高，表明BMP-2 從微囊中釋放后仍能保持活性，發(fā)揮成骨分化作用，同時從側(cè)面表明BMP-2 scaffolds/12 000 組在7 d 內(nèi)釋放的藥物較另外3 組更多，這與2.3 中得到的緩釋結(jié)果相一致。2 個BMP-2 scaffolds SR 組AKP 活力差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但都高于空白對照組。表明2 種微囊經(jīng)過3 d 的緩釋仍能釋放出BMP-2， 并能夠保持BMP-2 的活性。BMP-2 scaffolds/30 000 組微囊的AKP 活力與空白對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.7 浸提液對MC3T3-E1 體外成骨分化的影響

微囊浸提液的AKP 活性測定結(jié)果（圖5 右）顯示，相對分子質(zhì)量12 000 的微囊的AKP 活力高于相對分子質(zhì)量30 000 的微囊（Plt;0.05），而相對分子質(zhì)量30 000 的微囊的AKP 活力與空白對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05）。

將MC3T3-E1 細(xì)胞在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，茜素紅染色及半定量分析結(jié)果見圖6。相對分子質(zhì)量30 000 的2 組較其他組鈣沉積結(jié)節(jié)多，相對分子質(zhì)量12 000 的2 組鈣沉積結(jié)節(jié)較空白對照組少，BMP-2 scaffolds SR/12 000 組幾乎無鈣沉積結(jié)節(jié)。14、21 d 時茜素紅染色結(jié)果對比，空白對照組以及相對分子質(zhì)量30 000 的2 組鈣沉積結(jié)節(jié)都隨時間增多，但是相對分子質(zhì)量12 000 的2 組鈣沉積結(jié)節(jié)21 d 時與14 d 時差異無統(tǒng)計學(xué)意義。21 d 時茜素紅半定量分析顯示，相對分子質(zhì)量30 000 的2 組鈣沉積結(jié)節(jié)高于空白對照組以及相對分子質(zhì)量12 000的2 組（Plt;0.05）。

3 討論

本課題組的前期研究利用相對分子質(zhì)量為12 000 以及150 000 的PLGA 微囊制備了一種可以持續(xù)釋放生長因子的支架。研究[10]表明，相對分子質(zhì)量為12 000 的微囊在14 d 內(nèi)促進骨形成的能力優(yōu)于相對分子質(zhì)量為150 000 的微囊。然而，骨形成在體內(nèi)是一個長期的過程，BMP-2 需要在體內(nèi)釋放至少數(shù)周。本研究基于上述實驗結(jié)果，選擇制備相對分子質(zhì)量為12 000 以及30 000 的微囊進行對比，在其內(nèi)包裹BSA研究釋藥能力。結(jié)果表明，相對分子質(zhì)量為12 000 的微囊釋放BSA 的時間持續(xù)約25 d， 其中第1 天約釋放其含量的55%；相對分子質(zhì)量為30 000 的微囊在緩釋35 d時僅釋放了其所載藥物的50%，第1 天釋放了其含量的30%。BMP-2 通過初始爆發(fā)釋放，隨后緩慢持續(xù)釋放的方式遞送能更好地促進骨形成[12]。同時釋放動力學(xué)結(jié)果表明，相對分子質(zhì)量為12 000的微囊在初期釋放的BMP-2 含量最高，BMP-2 的作用為促進成骨細(xì)胞的增殖和分化[13-14]，在細(xì)胞趨化實驗中BMP-2 也表現(xiàn)出了對成骨細(xì)胞的趨化作用，這印證了前期課題組的研究結(jié)果[10]。

本研究發(fā)現(xiàn)，微囊的粒徑大多數(shù)集中在80～160 μm。支架的孔隙gt;50 μm有利于細(xì)胞的進入以及血管生成[15]。Rmaidi 等[16]測定了PLGA對細(xì)胞的黏附，光學(xué)顯微鏡顯示將細(xì)胞與材料共培養(yǎng)4 h 后細(xì)胞能夠黏附并擴散在材料表面，并且黏附的細(xì)胞總數(shù)約為接種總數(shù)的90%。本研究微囊的Calce‐in-AM/PI 染色結(jié)果表明，5 d 時有大量的MC3T3-E1 黏附于微囊的周圍，在微囊的邊緣形成一個粗光圈，這是由于PLGA的疏水性可以使細(xì)胞迅速黏附至其表面。在這種微囊內(nèi)部包裹BMP-2，通過AKP 活力檢測、茜素紅染色及半定量分析證明了BMP-2 被包裹后通過微囊緩釋能夠起到促進成骨的效果，同時從側(cè)面證明BMP-2 通過微囊釋放后仍能保持其活性。但是相對分子質(zhì)量為12 000 的微囊雖然在7 d 的AKP 活性檢測實驗中表現(xiàn)出明顯的誘導(dǎo)成骨能力，但是在14、21 d 的長期誘導(dǎo)成骨實驗中表現(xiàn)出了明顯的不足，甚至成骨能力低于空白對照組。出現(xiàn)這種現(xiàn)象，一方面是由于相對分子質(zhì)量為12 000 的微囊在前期突釋嚴(yán)重，BMP-2 已早期大量釋放；另一方面，PLGA是通過酯鍵水解降解為乳酸和羥基乙酸，其酸性降解產(chǎn)物會引發(fā)PLGA自催化作用，加速其降解，并使局部微環(huán)境呈弱酸性。PLGA的水解過程分為兩個階段，第一階段PLGA的相對分子質(zhì)量逐漸降低，而總重量不變；第二階段PLGA相對分子質(zhì)量降低，水解產(chǎn)物溶于水，總重量快速下降[8-9，17]。由于相對分子質(zhì)量為12 000 的微囊的相對分子質(zhì)量較小，導(dǎo)致在成骨初期就已到達(dá)水解的第二階段。過快的水解導(dǎo)致周圍環(huán)境呈弱酸性，周圍組織出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，阻礙了成骨分化的進程[8，18]。

本研究初步證明，通過調(diào)控PLGA相對分子質(zhì)量的大小，可以控制其內(nèi)包封藥物的釋放速率。與相對分子質(zhì)量為12 000 的PLGA微囊相比，相對分子質(zhì)量為30 000 的PLGA微囊對誘導(dǎo)長期的成骨分化更有利。但是本研究僅局限于體外研究，并且由于本研究目的在于比較2 種相對分子質(zhì)量微囊的釋藥能力對成骨效果的影響，應(yīng)用了微囊的浸提液，對于該微囊的形態(tài)結(jié)構(gòu)對MC3T3-E1 成骨分化的影響體現(xiàn)不足，因此下一步需要改進實驗方法，并增加體內(nèi)實驗，進一步驗證該結(jié)論的準(zhǔn)確性。同時，在實際實驗中發(fā)現(xiàn)低相對分子質(zhì)量的微囊在緩釋的后期會使周圍環(huán)境呈酸性，不利于成骨[19]，后期也需要進一步研究以解決這一問題。對于微囊釋放BMP-2 來促進成骨分化的最適相對分子質(zhì)量，也仍需比較更多不同相對分子質(zhì)量的微囊以得出更準(zhǔn)確的結(jié)論。本研究結(jié)果為進一步開發(fā)可控性骨組織工程技術(shù)材料提供了思路。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。

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（本文編輯 杜冰）