[摘要] 目的 在中國多個非綜合征型先天缺牙家系中鑒定PAX9 突變，并研究PAX9 突變導致非綜合征型先天缺牙的基因型—表型關系，為先天缺牙基因診斷提供依據。方法 收集自2018 年至2023 年期間于河北醫(yī)科大學口腔醫(yī)院就診的44 例非綜合征型多數牙缺失患者。采集先證者及其核心家系成員外周血進行全外顯子組測序（WES），并用Sanger 測序驗證其突變，通過生物信息學工具對突變體進行了致病性分析和功能預測。在PubMed等檢索出與先天缺牙相關PAX9 突變的55 篇文章共232 例患者，分析PAX9 突變基因型—表型關系。結果 在中國家庭中發(fā)現了一個新的PAX9 基因移碼突變c.447delG（p.Pro150Argfs*62） 和一個已報道的PAX9 基因錯義突變c.406Cgt;T （p.Gln136*）。通過生物信息學分析和三維結構建模，預測發(fā)現該移碼突變具有致病性，突變導致PAX9 蛋白提前終止，結構與功能受損嚴重?？偨YPAX9 基因型—表型關系發(fā)現，攜帶PAX9 突變的非綜合征型先天缺牙患者最容易缺失第二磨牙。結論 發(fā)現非綜合征型先天缺牙新的PAX9 基因移碼突變c.447delG（p.Pro150Argfs*62），擴展先天缺牙PAX9 突變譜。非綜合征型先天缺牙PAX9 突變最易感牙位為第二磨牙，PAX9 突變導致的乳牙缺失均為乳磨牙缺失。

[關鍵詞] 非綜合征型先天缺牙； PAX9； 全外顯子組測序； 基因型—表型

[中圖分類號] R781.9 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2024.2024090

牙齒發(fā)生發(fā)育涉及一系列復雜的上皮—間充質相互作用，涉及200 多個基因，主要涉及TGF-β/BMP、Wnt/β -Catenin、Eda/Edar/NF- κB 和SHH等信號通路[1-2]，這些信號通路中PAX9、AXIN2、EDA、LRP6、MSX1、WNT10A 和WNT10B 已被認為是導致非綜合征型牙齒發(fā)育不全的最常見致病基因[3]。

PAX9 位于14 號染色體q13.3，屬于9 個配對盒（PAX） 轉錄因子家族的成員之一，PAX9 包含一個高度保守的能與DNA 特異性結合的128 個氨基酸組成的配對結構域（paired domain，PD） 和一個八肽基序（octapeptide motif，OM） [4]。PAX9在咽囊內胚層、體節(jié)、神經嵴來源的間充質和遠端肢芽等胚胎組織中表達，在胚胎顱面生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[5]。

PAX9 基因突變以及多態(tài)性等遺傳學改變常導致顱面部發(fā)育缺陷。Pax9-/-小鼠在出生幾小時內死亡，并表現出牙胚、胸腺和甲狀旁腺發(fā)育停止，顱面及軟骨畸形，繼發(fā)腭裂等廣泛發(fā)育缺陷[6]。人PAX9 突變最常導致常染色體顯性遺傳性疾病——選擇性牙齒發(fā)育不全3 型（OMIM：#604625），即非綜合征型多數牙缺失（non-syndromic oligodontia），主要表現為磨牙缺失[7-8]。與先天缺牙有關的PAX9突變類型主要為錯義突變、移碼突變、無義突變，但嚴重的表型常是由單倍不足引起，表明表型嚴重程度與PAX9 突變劑量可能存在一定相關性[9]。PAX9 突變及多態(tài)性還與少數牙缺失、牙齒大小發(fā)育異常、腭裂[10]以及低出生體重[11]等相關。

本研究通過對非綜合征型多數牙缺失患者進行全外顯子測序， 發(fā)現1 個新PAX9 突變位點c. 447delG （p. Pro150Argfs*62） 和1 個已報道的PAX9 突變位點c.406Cgt;T （p.Gln136*），為家系的精準遺傳提供理論依據，并擴大了PAX9 的突變譜；總結已報道的PAX9 突變導致先天缺牙患者表型（截至2023 年12 月），為臨床通過患者表型推斷突變基因提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選擇2018 年至2023 年期間于河北醫(yī)科大學口腔醫(yī)院就診的非綜合征型多數牙缺失患者44 例。篩選標準：排除診斷或疑似外胚層器官發(fā)育異常的綜合征，排除拔牙史后，曲面斷層片檢查證實缺牙區(qū)無恒牙胚，選取缺牙數目大于等于6 顆（除外第三磨牙） 的患者，獲得知情同意后納入研究對象；選取18～55 周歲所有恒牙均萌出（除第三磨牙） 且身體健康，沒有器官或系統疾病的對照組成員共100 例。本研究通過了河北醫(yī)科大學口腔醫(yī)院倫理委員會審查批準（批準號［2016］ 004）。

1.2 采集外周血及提取基因組DNA

采集收集到的家系及對照組成員的外周靜脈血（4 mL/人）。使用20%枸櫞酸葡萄糖抗凝。使用小量血液基因組DNA提取試劑盒［天根生化科技（北京） 有限公司］，提取外周血基因組DNA，儲存于?20 ℃下備用。

1.3 全外顯子測序、Sanger 測序及致病性預測

先證者的基因組DNA進行全外顯子測序［艾吉泰康生物科技（北京） 有限公司］。通過液相探針雜交捕獲技術對目標區(qū)域序列進行捕獲富集后建立DNA文庫，使用NovaSeq 6000 二代測序平臺進行高通量、高深度測序，產生了超過16 000 Mb的堿基；測序平均深度達到了140×，超過了99.6%的覆蓋率。利用Burrows-Wheeler Aligner 軟件將讀數與人類參考基因組37 版（Genome ReferenceConsortium Human Build 37，GRCH37） 進行比對。使用SAM文件處理工具（SAM tools） 和基因組分析工具包（Genome Analysis Toolkit，GATK） 鑒定單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）、插入和缺失（Indel），最后由基因組注釋工具（ANNOVAR） 進行突變注釋。

篩選條件為：1） 已知致病基因；2） 利用千人基因組計劃（1000 Genomes）、外顯子組聚合聯盟（Exome Aggregation Consortium， ExAC）、基因組聚合數據庫（Genome Aggregation Database，gnomAD） 等篩選出“最小等位基因頻率（minorallele frequency，MAF） lt;1%”或未在以上數據庫發(fā)現的候選基因及突變位點；3） 使用耐受性分析（sorting intolerant from tolerant，SIFT）、多態(tài)性表現型分析（polymorphism phenotyping v2， Poly‐Phen-2）、突變篩選分析（Mutation Taster） 等生物信息學軟件對候選突變進行功能預測，排除同義突變等無功能影響的突變；4） 根據2015 年美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會（America College of MedicalGenetics and Genomics，ACMG） 標準的致病突變分類進一步預測其致病性；5） 參考在線人類孟德爾遺傳（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）、人類基因突變數據庫（The Human GeneMutation Database，HGMD），根據家系圖譜進一步驗證遺傳方式及基因—疾病關系。最終獲得可能的致病突變基因及其位點。將突變位點信息交由生工生物工程（上海） 股份有限公司進行Sanger測序驗證。PAX9 的參考序列為NM_006194.4。

1.4 PAX9 突變蛋白二級結構及三維模型構建

使用PsiPred 4.0 （http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred）預測突變蛋白的二級結構。通過swiss-model（https：//swissmodel.expasy.org/） 在線軟件構建PAX9 野生型及突變蛋白的三維結構，然后使用PyMol v2.6 進行可視化分析，并用Expasy 在線軟件預測分析突變蛋白的理化性質。

1.5 基因型—表型分析

通過Pubmed 搜索“oligodontia”or“hypodontia”or“tooth agenesis”and“PAX9”，選取截止2023 年12 月報道的與PAX9 基因突變致先天缺牙相關的文章，篩選條件：1） PAX9 為先天缺牙的致病基因；2） 對缺牙表型有詳細的描述；3） 排除同義突變。篩選出55 篇文章中228 例[12-66]與本研究4 例共232 例患者納入分析。

2 結果

2.1 臨床表現

先證者臨床檢查均表現為先天性牙齒缺失，缺牙數均為6 個以上，皮膚、毛發(fā)發(fā)育正常，未見汗腺、唾液、淚液分泌減少等其他外胚葉器官發(fā)育不良的表現，未觀察到其他器官和系統的異常。經過全面口腔檢查和曲面斷層X線片證實2 名患者恒牙先天缺失。

家系1：先證者為6 歲女童，漢族，口內余留牙14 顆乳牙， 其中62、72 乳牙脫落， 55、65、75、85 牙先天缺失，曲面斷層片顯示16 顆恒牙缺失（12、15、16、17、22、25、26、27、31、35、36、37、41、45、46、47 牙）；先證者母親正常；父親亦為先天缺牙患者，口內余留牙16 顆，否認拔牙史，其中65、74、85 乳牙滯留，12、22、24牙殘根，21 牙殘冠，曲面斷層片顯示15 顆恒牙缺失（13、14、15、16、17、23、25、26、27、32、34、36、37、45、47 牙），未見其他器官異常；先證者自述其叔叔與奶奶也患有先天缺牙，但無法提供DNA樣本（圖1）。

家系2：先證者為4 歲男童，漢族，口內余留15 顆乳牙，其中51 牙外傷脫落，55、65、75、85牙缺失，曲面斷層片顯示缺失16 顆恒牙（12、13、15、16、17、23、25、26、27、31、35、36、37、45、46、47 牙）；先證者母親自述從小缺失后牙，否認拔牙史，口內可見固定義齒修復，曲面斷層片顯示15 顆恒牙缺失（12、13、16、17、22、25、26、27、35、36、37、41、44、46、47 牙），未見其他器官異常；先證者父親和弟弟（2 周半） 經檢查未見牙齒及其他器官的異常，弟弟由于年齡小未拍攝曲面斷層片（圖2）。

2.2 全外顯子檢測及分析

通過全外顯子測序，家系1 中發(fā)現一例新PAX9c.447delG （p.Pro150Argfs*62），此突變位點未在1000 Genomes、ExAC、gnomAD 數據庫中發(fā)現；Mutation Taster 預測的分值為1， 取值為D（Disease_causing），表示很可能有害；2015 年美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會（American College ofMedical Genetics and Genomics，ACMG） 標準的致病突變分類，預測為可能致?。辉诩蚁? 中為PAX9 無義突變： PAX9 c. 406Cgt;T （p.Gln136*），Mutation Taster 預測的分值為1，取值為A （Disease_causing_automatic），表示已知有害；2015 年ACMG 標準的致病突變分類，預測為致病，HGMD數據庫已報道該突變位點與先天缺牙相關（表1）。

經Sanger 測序驗證，家系1 中先證者PAX9 突變遺傳自父親，家系2 先證者PAX9 突變遺傳自母親（圖3）。此外，在100 名健康對照中均未發(fā)現新PAX9 突變體。

2.3 PAX9 突變蛋白二級結構預測及三維構建分析

PAX9 c.447delG （p.Pro150Argfs*62） 新突變體，在核酸序列第447 位缺失了G堿基，導致后續(xù)核苷酸翻譯蛋白序列重排，第149 位氨基酸編碼的堿基ACG變?yōu)锳CC，但編碼的氨基酸仍然為蘇氨酸，但從第150 位氨基酸開始由環(huán)狀非極性脯氨酸變?yōu)閭孺湢顦O性精氨酸，其后氨基酸也隨之發(fā)生改變，導致蛋白質三維結構顯著改變，并在新閱讀框架的第62 位密碼子處產生終止密碼子，突變蛋白在翻譯至第210 位賴氨酸提前終止，導致蛋白截短，生物信息學預測表明，突變位點之前增加了1 個α-螺旋結構，突變位點之后減少了4 個α-螺旋結構，蛋白質結構發(fā)生顯著改變（圖4、5）。

理化性質方面，與野生型相比，p.Pro150Argfs*62 突變蛋白分子量因截短而顯著減少（由36 310.12 變?yōu)?3 208.74）；正電殘基與負電殘基數量均增加（由11 和21 變?yōu)?3 和30），蛋白雖然仍為堿性，等電點變化較?。ㄓ?.39 變?yōu)?1.00），但因突變蛋白空間結構改變導致不穩(wěn)定性指數顯著增高，說明突變蛋白較野生型更容易降解；突變蛋白消光系數顯著下降（由42 860 變?yōu)?4 325），但半衰期無變化（表2）。疏水性分析表明，PAX9蛋白為疏水性蛋白，突變后第150 位精氨酸疏水性顯著下降，且第150 位后疏水性呈整體下降趨勢，親水性平均值由?0.279 變?yōu)?0.571。因為蛋白質疏水性與水不溶性分子和水分子相互作用有關，疏水性越強，蛋白質越穩(wěn)定，因此突變蛋白的穩(wěn)定性下降（圖6）。

2.4 PAX9 基因型—表型分析

選取共232 例已報道PAX9 突變的先天缺牙患者（除第三磨牙缺失），進行基因型—表型分析。共計95 種PAX9 突變體，其中錯義突變和移碼突變占比較高（約46.3%和31.6%），其次為無義突變（約12.6%），其他突變類型較少見（圖7a）；PAX9 突變主要與非綜合征型先天缺牙有關，尤其是非綜合征多數牙缺失（約81.5%），其次非綜合征型少數牙缺失（約16.4%），同時也可導致綜合征型先天缺牙，但較少見（圖7b）。

排除綜合征型先天缺牙患者5 例，與PAX9 突變相關非綜合征型先天缺牙的數目為1～28 不等，平均為11 顆，且任何一顆恒牙都可能受累，呈左右對稱趨勢，上頜缺牙率要高于下頜，除下頜中切牙外，其余上頜同名牙缺牙率均高于下頜同名牙；上頜從高到低依次為第二磨牙、第一磨牙、第二前磨牙、側切牙、尖牙、第一前磨牙、中切牙；下頜從高到低依次為第二磨牙、中切牙、第一磨牙、第二前磨牙、側切牙，第一前磨牙和尖牙（圖8）。PAX9 突變導致的乳牙缺失、均為乳磨牙缺失（表3）。

3 討論

牙齒發(fā)育不全主要是由遺傳因素導致的，但其遺傳異質性是相當廣泛的，約90%是由以下7 個基因突變引起，包括AXIN2、EDA、LRP6、MSX1、PAX9、WNT10A 和WNT10B[3]， 其中由PAX9 突變體引起的非綜合征型先天缺牙多以常染色體顯性方式遺傳[36]。

PAX9 是一個重要的轉錄因子：PAX9 蛋白與靶DNA 的結合是通過PD 的N-末端亞結構域實現的，而C-末端亞結構域與N-末端亞結構域一起在通路調節(jié)中發(fā)揮作用，八肽可能與其他蛋白質相互作用，其功能尚未研究[67]，可能與抑制轉錄活性有關[68]。大多數PAX9 突變聚集于PD （73.7%），且第二磨牙缺失通常與高度保守的配對結構域有關，尤其是N-末端亞結構域[69]。本研究在1 個中國非綜合征型先天缺牙家族中發(fā)現了PAX9 新突變c.447delG （p.Pro150Argfs*62），另一個家系中發(fā)現已報道的PAX9 突變c.406Cgt;T （p.Gln136*）。通過Sanger 測序驗證先證者均為雜合突變，進行家系基因共分離，發(fā)現突變分別來源于先天缺牙的父親或母親，表明在這兩個家系PAX9 突變導致非綜合征型先天缺牙均為常染色體顯性遺傳，與以前的研究一致[37，57]。Mutation Taster 與ACMG 標準突變分類預測這兩種突變體均具有致病性。這兩個突變體均位于第3 外顯子，是PAX9 基因最大的編碼區(qū)，也是先天缺牙相關的突變熱點[9]。

PAX9 c.447delG （p.Pro150Argfs*62） 新突變屬于移碼突變，是PAX9 最常見的突變類型之一。堿基序列中第447 位鳥嘌呤缺失，序列向前移碼，第149 位編碼的氨基酸仍為蘇氨酸，但編碼的氨基酸從150 位開始改變至210 位后提前終止，嚴重影響蛋白質理化性質，尤其是引起蛋白質疏水性明顯下降，導致蛋白質穩(wěn)定性降低，使突變蛋白更容易降解，該突變位點位于PAX9 配對結構域下游，導致其八肽結構缺失，蛋白截短，肽鏈較野生型顯著縮短，蛋白相對分子質量顯著減少，嚴重影響蛋白質結構。PAX9 無義突變c.439Cgt;T （p.Q147*） 導致蛋白截短，該突變也位于配對結構域之外，導致八肽結構缺失影響蛋白質的結構和功能[44]，本研究新發(fā)現位點與該研究相似；PAX9c.480Cgt;G（p.Tyr160*） 無義突變導致的蛋白截短，使C 端反式激活結構域缺失，從而影響蛋白質的功能[66]； PAX9 移碼突變c. 491_510del20bp （p.Pro165Glnfs*145） 導致突變蛋白下調或減少PAX9的下游靶點BMP4 的轉錄激活[70]。本課題組也發(fā)現PAX9 p.Gly51Val 和p.Arg47Pro 在人牙髓干細胞中蛋白表達下降，可能由于單倍體不足導致先天缺牙表型[37]。PAX9 作為PAX 轉錄因子家族成員之一，突變導致蛋白截短無法正常行駛功能，導致PAX9 單倍劑量不足或影響靶基因的DNA 結合能力及反式激活能力[71]，但突變如何影響牙胚發(fā)育仍需進一步研究。

通過Pubmed 篩選出55 篇文章共232 例患者對PAX9 致牙齒發(fā)育不全進行基因型—表型分析，筆者發(fā)現PAX9 突變引起的牙齒發(fā)育不全，主要是非綜合征型先天缺牙，且大部分患者為多數牙缺失，與之前研究[57]一致。Chu 等[61]用176 名患者分析，錯義突變（49%） 是PAX9 致先天缺牙的主要突變類型，其次為移碼突變（29%）、無義突變（11%），其他類型突變少見（11%），本研究擴大樣本量至232 例，移碼突變占比上升（31.6%），但錯義突變仍然是PAX9 的主要突變類型（46.3%）。Intarak 等[69]發(fā)現，從突變類型上，無義突變和移碼突變患者的上頜第二磨牙及第二前磨牙缺失率高于錯義突變，本研究2 例先證者上頜第二磨牙及第二前磨牙均缺失；此外，本課題組也發(fā)現除下頜中切牙外，上頜同名牙缺牙率高于下頜牙，但左右呈對稱趨勢，且最常累及磨牙，尤其是第二磨牙，與之前研究[61，69]一致，但下頜尖牙與第一前磨牙差異不明顯，但Intarak 等[69]認為下頜第一前磨牙缺牙最少見（4%）；其次在報道乳牙缺失的患者中，均累及乳磨牙[14，38，40-41，45，57]，且發(fā)現乳牙發(fā)育不全的患者均是蛋白截短突變，如無義或移碼突變[37]，與本研究兩位先證者一致，但對于乳牙缺失的研究較少，因此，對于PAX9 突變致乳牙缺失的基因型—表型關系還需進一步分析。本課題組進一步擴大了樣本量，總結基因型—表型關系，為臨床根據表型診斷基因型提供依據。

綜上，本研究在中國漢族非綜合征型先天缺牙家系中發(fā)現了1 個新PAX9 c. 447delG （p.Pro150Argfs*62），進一步擴大了PAX9 的突變譜；總結至2023 年12 月的已報道的PAX9 突變表型，發(fā)現PAX9 突變主要是錯義突變和移碼突變；易累及牙位為上頜第二磨牙、下頜第二磨牙、上頜第一磨牙，為先天缺牙的基因診斷提供了理論基礎。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。

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（本文編輯 李彩）