摘 要： 破骨細(xì)胞是骨吸收的主要功能細(xì)胞，具有力學(xué)敏感性。本研究旨在利用形狀記憶聚合物（ SMPs）的形狀回復(fù)力原位調(diào)控破骨細(xì)胞的形成。首先將純聚乳酸（ PLA） 、不同質(zhì)量比（ 7∶3、5∶5、3∶7）的PLA 和聚己內(nèi)酯（PCL）通過(guò)熱致相分離法（TIPS）制備PLA/PCL 3D 支架，并表征其形貌、結(jié)構(gòu)、熱性能；然后，將篩選的PLA/PCL（ 5∶5）支架在45 ℃ 下壓縮塑形（壓縮比分別為0、50%、75%）和4 ℃ 下冷卻固定，并表征形狀記憶性能；最后，通過(guò)基于RAW264.7巨噬細(xì)胞的破骨分化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了形狀回復(fù)力對(duì)抑制破骨細(xì)胞形成的調(diào)控作用。結(jié)果表明： PLA/PCL（5∶5）材料體系的形狀回復(fù)溫度接近人體體溫，適合制備3D 支架；形狀回復(fù)力與塑形應(yīng)變相關(guān)，壓縮比75% 組的支架產(chǎn)生的形狀回復(fù)力為50% 組的1.7 倍；形狀回復(fù)力可抑制巨噬細(xì)胞的融合分化及相關(guān)功能表達(dá)，對(duì)破骨細(xì)胞形成的抑制作用與回復(fù)力大小有關(guān)。

關(guān)鍵詞： 形狀記憶聚合物；熱致相分離；形狀回復(fù)力；破骨細(xì)胞；骨組織工程

中圖分類號(hào)： R318.08 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

隨著人口老齡化問(wèn)題日趨嚴(yán)重，骨質(zhì)疏松癥（OP）的發(fā)病率逐漸提高。OP 具有骨量低下、骨強(qiáng)度下降、骨脆性增加的特點(diǎn)[1-2]，主要是由破骨細(xì)胞過(guò)度活躍使骨吸收和骨形成出現(xiàn)不平衡導(dǎo)致[3]，而惡性腫瘤、嚴(yán)重感染、意外創(chuàng)傷更會(huì)使OP 患者出現(xiàn)嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松性骨缺損（OBD）。對(duì)于OBD 的治療一般需要使用生物材料，并要求植入的生物材料構(gòu)建體不僅能促進(jìn)骨形成，還應(yīng)具有抑制局部破骨細(xì)胞過(guò)度活躍的能力。雖然在植入的生物材料中負(fù)載藥物或激素可在一定程度上抑制過(guò)度活躍的破骨細(xì)胞[4]，但不可避免會(huì)產(chǎn)生不同程度的副作用，如使用雙膦酸鹽會(huì)引起頜骨壞死[5]，導(dǎo)致治療效果不佳。

眾所周知，骨是承力組織。諸多研究表明機(jī)械應(yīng)力的加載與破骨細(xì)胞的分化形成[6-8]、骨吸收功能以及成骨細(xì)胞的成骨分化功能密切相關(guān)。目前對(duì)于力學(xué)刺激影響破骨細(xì)胞行為的研究一般通過(guò)使用生物反應(yīng)器進(jìn)行[9-10]，無(wú)法移植進(jìn)入體內(nèi)是生物反應(yīng)器應(yīng)用的一大限制。鑒于力學(xué)刺激的重要調(diào)控作用，如果使植入的生物材料支架具有主動(dòng)、原位施加動(dòng)態(tài)力學(xué)刺激的功能，這種具有力學(xué)活性的生物材料支架將對(duì)抑制破骨細(xì)胞形成和提升OBD 的治療效果提供新的調(diào)控方式。

形狀記憶聚合物（SMPs）是一類易于塑形固定且在特定刺激（如超聲、熱、光等）作用下能回復(fù)至初始形狀的刺激響應(yīng)性聚合物。將SMPs 制備成3D 力學(xué)活性支架，其在受激回復(fù)時(shí)產(chǎn)生的形狀回復(fù)力可被用來(lái)調(diào)控破骨細(xì)胞的形成和功能。對(duì)于熱響應(yīng)型SMPs，玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（Tg）是控制其形狀回復(fù)過(guò)程的“開(kāi)關(guān)”溫度，然而大多數(shù)熱響應(yīng)型SMPs 通常具有較高的Tg，導(dǎo)致無(wú)法應(yīng)用到組織修復(fù)領(lǐng)域[11]，因此需通過(guò)不同的方法（如添加改性材料）來(lái)降低Tg 以適合應(yīng)用需求[12-13]。本課題組的前期工作表明，摻入3-羥基丁酸酯-co-3-羥基戊酸酯共聚物（PHBV）對(duì)聚左旋乳酸（PLLA）進(jìn)行改性，可使PLLA 的Tg 降低[14]。形狀回復(fù)力可促進(jìn)骨形成和顱骨缺損的修復(fù)[15]，但利用形狀回復(fù)力調(diào)控破骨細(xì)胞行為的研究鮮有報(bào)道。

本文目的是制備Tg 接近人體體溫的具有形狀記憶功能的3D 支架，然后研究形狀回復(fù)力對(duì)抑制破骨細(xì)胞形成的調(diào)控作用：首先選擇聚已內(nèi)酯（PCL）對(duì)聚乳酸（PLA）進(jìn)行共混改性，通過(guò)熱致相分離法（TIPS）制備出PLA/PCL 3D 支架；然后將支架進(jìn)行形狀記憶編程，并采用電紡絲法制備纖維膜組裝在3D 支架頂端用于細(xì)胞種植；最后在纖維膜?形狀記憶PLA/PCL 3D 復(fù)合支架上種植RAW264.7 巨噬細(xì)胞并誘導(dǎo)形成破骨細(xì)胞，驗(yàn)證由支架原位施加不同大小形狀回復(fù)力對(duì)破骨細(xì)胞形成的調(diào)控作用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料和試劑

PLA（Mw = 100 000，濟(jì)南岱罡生物材料有限公司）；PCL（Mw = 80 000，濟(jì)南岱罡生物材料有限公司）；1，4-二氧六環(huán)（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；六氟異丙醇（HFIP，化學(xué)純，上海達(dá)瑞有限公司）；DMEM 高糖培養(yǎng)基（南京凱基生物有限公司）；核因子κB 受體活化因子配體（RANKL，北京索萊寶科技有限公司）；活/死染色試劑（賽默飛世爾科技公司）；CCK-8 試劑盒（上海碧云天生物有限公司）；抗酒石酸酸性磷酸酶染色試劑盒（TRAP，南京建成生物有限公司）；蛋白上樣緩沖液（北京中科瑞泰生物科技有限公司）；CTSK 一抗、TRAP一抗（江蘇親科生物研究中心有限公司）；ECL 發(fā)光液（上海生工生物工程股份有限公司）；4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，美國(guó)Invitrogen 公司）；BIOZOL 試劑盒（新賽美生物科技有限公司）；cDNA 第一鏈合成試劑盒（天根生化科技有限公司）；Super Real PreMix Plus（SYBR Green，天根生化科技有限公司）；RAW264.7 細(xì)胞（中科院細(xì)胞研究所）。